Содержание к диссертации
стр.
Список сокращений 4
Глава I. 1.1.
Введение 5
Обзор литературы 11
Основные задачи и принципы промышленного
культивирования 11
микроорганизмов
1.1.1. 1.1.2.
Методы культивирования микроорганизмов 11
Производственные питательные среды и требования, . ^
предъявляемые к ним
Питательные потребности микроорганизмов 23
Культивирование и микробиологический контроль
отдельных вакцинных штаммов 33
1.3
1.3.
Глава П. 2.1
микроорганизмов
Питательные потребности чумного микроба 33
Питательные потребности лептоспир и листерий 36
Оптимизация питательных сред 40
Материалы и методы исследований 50
Лабораторное и производственное оборудование,
питательные среды, растворы, 50
2.2. 2.3. 2.4.
2.5. 2.6.
2.7.
реактивы
Лабораторные животные, используемые в опытах 51
Исследование препарата «ЭСРМ» на безвредность 52
Исследование биологической активности препарата
«ЭСРМ»
Контроль стерильности препарата «ЭСРМ» 53
Исследование химического состава препарата «ЭСРМ» 53
Характеристика штаммов микроорганизмов, использованных в работе, и изучение биологических свойств препарата
2.8. 2.9. Глава III.
«ЭСРМ»
Метод электронной микроскопии 61
Статистическая обработка результатов исследований 63
Технология приготовления препарата «ЭСРМ» и его
характеристика 64
3.1.
3.2.
3.3. Глава IV.
4.1.
Технология приготовления препарата «ЭСРМ» 67
Результаты отработки оптимального метода стерилизации 7Q
«ЭСРМ»
Некоторые показатели химического состава «ЭСРМ» 81
Изучение стимулирующего действия препарата «ЭСРМ» на рост некоторых вакцинных штаммов микроорганизмов.. Влияние препарата «ЭСРМ» на биологические свойства 88
Listeria monocytogenes
Влияние препарата «ЭСРМ» на биологические свойства QQ Leptospira interrogans
Влияние препарата «ЭСРМ» на биологические свойства 1 п^ Yersinia pestis
Заключение 117
Выводы 129
Практические предложения 131
Список литературы 132
Приложения 162
4 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ГИСК - Государственный институт стандартизации и контроля
медицинских препаратов им. Л.А.Тарасевича;
ГОСТ - Государственный отраслевой стандарт;
ж.м.к. - живые микробные клетки;
ЗФР - забуференный физиологический раствор;
л - литр;
М - моль;
м. к. - микробные клетки;
мг - миллиграм;
мин - минуты;
мкг - микрограм;
мл - миллилитр;
млн. - миллион;
млрд. - миллиард;
МПА - мясопептонный агар;
МПБ - мясопептонный бульон;
МППБ - мясопептонно-печеночный бульон;
НД - нормативная документация;
об/мин - оборотов в минуту;
ОСО - отраслевой стандартный образец;
РМА - реакция микроагглютинации;
рН - водородный показатель;
РП - регламент производства;
СТЭМБ - стимулятор эмбриональный;
ТУ - технические условия;
ТХУ - трихлоруксусная кислота;
ФС - фармакопейная статья;
ЭСРМ - эмбриональный стимулятор роста микроорганизмов.
Введение к работе
Актуальность. Одним из главных принципов промышленной биотехнологии, использующей в качестве биологических объектов микроорганизмы, является их культивирование на любом из производственных этапов, от поддержания штаммов до получения биомассы микроорганизмов в количестве, достаточном для обеспечения эффективности производства.
Основным условием для успешного культивирования, обеспечивающего максимальное накопление биомассы и поддержания активности штаммов, является подбор питательных сред в соответствии с питательными и другими физиологическими потребностями микроорганизма (Малахов Ю.А., Панин А.Н., Соболева Г.Л., 2000; Прозоркина Н.В., Рубашкина Л.А., 2002; Ellinghausen Н., Faine S., 1982).
Большинством специалистов для подавляющей массы производственных микроорганизмов лучшими признаны питательные среды из естественного сырья: препараты крови, казеин, мясные гидролизаты, экстракты растительного и животного происхождения (Коротеева Л.А., Шишов В.П., Маслак А.А., 2001; Меджидов М.М., 2003; Faine S., 1982). Однако практика показывает, что многие предприятия биологической промышленности, традиционно использующие среды из такого сырья, часто испытывают серьезные затруднения, связанные со снижением объема наращиваемой бактериальной массы, необходимой для производства препаратов.
Не исключено, что проблема снижения стандартности питательных сред, важность которой подчеркивается многими исследователями (Зелютков Ю.Г., Зайцев В.И., 1997; Геладзе В.Ш. и др., 1998; Овсова Л.М. и соавт., 2003), обусловлена, прежде всего, снижением качества продуктов природного происхождения в связи со сложной экологической обстановкой и антропогенным воздействием на окружающую среду. В
частности, в мясных продуктах могут содержаться антибиотики, химикаты, нитраты, токсические продукты, что отрицательно отражается на культивировании промышленных штаммов (Рябов В., Генкель В., Волкова Н., 1996; Waguespack М., 1986; Corrigan P.J., SeneviratnaP., 1989).
Для повышения качества сред в их состав добавляют различные биологически активные вещества, нивелирующие отрицательные воздействия и стимулирующие биологические свойства микроорганизмов. В некоторые среды добавляют такие питательные добавки, как казеиново-дрожжевой экстракт, экстракт кормовых дрожжей, сыворотку крови животных, углеводы, пептон, желатин и другие компоненты, выступающие в роли дополнительных источников ростовых веществ (Бузолева Л.С, 2001; Гариб Ф.Ю., 2002; Саяпина Л.В., 2002; Brubaker R.R., Surgalla M.S., 1964). В отличие от питательных добавок микроэлементы, витамины, аминокислоты добавляют к питательным средам в минимальных количествах. Подобные биологически активные вещества в таких количествах не являются питательными компонентами, а выполняют роль активаторов роста или катализаторов (Никитина В.А., Бобрышев В.И., Кафизова Ф.И., 1979; Macfarlane D.E., Elian-Jones Т.Е., 1980), участвующих в сложнейших биохимических реакциях.
Однако все питательные добавки и стимуляторы роста обладают селективным действием по отношению к большинству микроорганизмов, а при избыточном добавлении некоторых из них отмечается даже эффект ингибирования ростовых свойств микробов (Брильков А.В., Печуркин Н.С., 1990; Глазунов А.В., Аргунов СВ., Капульцевич Ю.Г., 1993; Gadgii M.D., 1967). Хороший стимулирующий эффект с возможностью использования для широкого перечня микробов при их культивировании может обеспечиваться при использовании питательных смесей, сочетающих различные ростостимулирующие компоненты (Мейнелл Дж., МейнеллЭ., 1967).
В связи с вышеизложенным, изыскание наиболее универсальных стимуляторов роста и размножения микроорганизмов, которые можно использовать для совершенствования традиционных питательных сред при выращивании большинства микробов, остается актуальной задачей.
Цель и основные задачи исследования. Целью работы явилась разработка на основе эмбриональных и внезародышевых тканей куриного яйца нового стимулятора роста микроорганизмов (ЭСРМ), изучение его влияния на их биологические свойства и ростостимулирующего эффекта на некоторые вакцинные штаммы.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи.
Изыскать оптимальные и рациональные биотехнологические приемы, способствующие накоплению и сохранению в препарате «ЭСРМ» оптимального набора и соотношения биологически активных веществ, обеспечивающих ростостимулирующую активность микроорганизмов.
Отработать методы стерилизации, обеспечивающие 100% стерильность и максимальную сохранность всех компонентов «ЭСРМ».
Исследовать стимулирующее действие препарата на жизнеспособность Listeria monocytogenes, Leptospira interrogans, Yersinia pestis.
Определить опытным путём минимальную и оптимальную дозы стимулятора роста в зависимости от тестового микроорганизма и среды, используемой для его выращивания.
Изучить влияние «ЭСРМ» на морфологические, тинкториальные и культуральные свойства тестовых микроорганизмов, выращенных на питательных средах с использованием «ЭСРМ».
Изучить химический состав препарата «ЭСРМ».
Исследовать возможность использования препарата в составе питательных сред для получения биомассы микроорганизмов в производственных целях, с последующим изучением изготовленных
биопрепаратов по основным показателям согласно нормативной документации (НД).
Научная новизна. Разработан и экспериментально апробирован новый тканевой биологически активный препарат, обладающий стимулирующими свойствами на рост микроорганизмов, изготовленный по оригинальной технологии из инкубированного куриного яйца.
Впервые изучено и обнаружено стимулирующее действие препарата на рост чумного микроба, листерий, лептоспир и отработаны оптимальные дозы стимулятора роста для тестовых микроорганизмов при их культивировании на разных жидких и плотных питательных средах.
Установлено, что препарат «ЭСРМ» при добавлении в питательные среды не изменяет морфологические, тинкториальные, культуральные свойства культивируемых микроорганизмов.
Проведены исследования экспериментальных серий вакцин против лептоспироза и чумы, изготовленных из бактериальной массы, выращенной на питательной среде с использованием стимулятора роста микроорганизмов «ЭСРМ» в соответствие нормативной документацией. Установлено, что изготовленные экспериментальные серии вакцин отвечают всем требованиям НД по изготовлению вакцин против лептоспироза и чумы.
Приоритетность выполненных исследований подтверждена уведомлением о положительном результате формальной экспертизы на изобретение, заявка от 24.05.2004, № 2004115830/13 (016861).
Теоретическая и практическая значимость. На основании проведенных исследований по приготовлению и испытанию препарата «ЭСРМ» разработана и утверждена техническая документация (Технические условия). Научные разработки используются в работе ФГУЗ Ставропольского научно-исследовательского противочумного института и ФГУП «Ставропольская биофабрика». Получены положительные результаты по эффективному применению препарата «ЭСРМ» в качестве
стимулятора роста микроорганизмов. Результаты исследований используются в учебном процессе медико-биолого-химического факультета Ставропольского ГУ, Воронежского ГАУ им. К.Д. Глинки, Кабардино-Балкарской ГСХА, Пятигорской ГФА, Ставропольском филиале МГОПУ им. М.А. Шолохова в качестве дополнений к учебным материалам по дисциплинам «Микробиология» и «Биотехнология».
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на межрегиональной научно-практической конференции «Приоритеты культуры и экологии в образовании» (апрель 2003 г., филиал МГОПУ им. М.А. Шолохова, г. Ставрополь); межрегиональной научной конференции «Студенческая наука - экономике России» (апрель 2003 г., Сев.-Кав. ГТУ, г. Ставрополь); межрегиональной научной конференции «Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе» (апрель 2004 г., Ставропольский ГУ); межрегиональной научно-практической конференции «Образование, здоровье и культура в начале XXI века» (апрель 2004 г., филиал МГОПУ им. М.А. Шолохова, г. Ставрополь); межрегиональной научной конференции «Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе» (апрель 2005 г., Ставропольский ГУ); Всероссийской студенческой конференции «Актуальные проблемы современной биологии» (апрель 2005 г., г. Астрахань); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и образования» (март 2005 г., Самарская ГСХА); научных чтениях, посвященных 200-летию Московского общества испытателей природы «Биотехнология, экология, охрана окружающей среды (Московский ГУ им. М.В. Ломоносова, 2005); I ежегодной научной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН (апрель 2005 г., г. Ростов-на-Дону.).
Препарат был представлен на Всероссийской выставке-ярмарке научно-исследовательских работ и инновационной деятельности
студентов, аспирантов и молодых ученых высших учебных заведений РФ «ИННОВ-2003», «ИННОВ-2005» (2003, 2005 гг. ЮРГТУ, г. Новочеркасск), IV-V Московском международном салоне инноваций и инвестиций (г. Москва, 2004, 2005 гг.) и награжден 5 дипломами и 5 серебряными медалями.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 10 печатных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 173 страницах машинописного текста, иллюстрирована 22 рисунками, 10 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений и приложений. Список использованной литературы содержит 259 источников, в том числе - 45 зарубежных авторов.
Положения, выносимые на защиту:
Технология приготовления стимулятора роста микроорганизмов «ЭСРМ».
Результаты исследования стимулирующего влияния полученного препарата «ЭСРМ» на жизнеспособность тестовых микроорганизмов и его оптимальные дозы.
3. Результаты влияния «ЭСРМ» на морфологические,
тинкториальные, культуральные и антигенные свойства исследуемых
микроорганизмов.
4. Результаты производственной апробации препарата «ЭСРМ» в
качестве стимулятора роста в биотехнологическом цикле вакцины
поливалентной «ВГНКИ» против лептоспироза животных и вакцины
чумной живой сухой из штамма ЕВ.
