Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА І.Обзор литературы 11
1.1. Бактерии рода Bacillus — антагонистически активные агенты против бактерий, грибов и вирусов 11
1.1.1. Характеристика антагонистической активности бацилл 11
1.1.2. Препараты пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus 19
1.1.3. Пробиотические препараты на основе метаболитов 24
1.2. Биологически-активные вещества, продуцируемые бактериями рода Bacillus 27
1.2.1. Физико-химические свойства биологически-активных веществ, выделяемых бациллами 27
1.2.2. Условия синтеза биологически-активных веществ 36
Собственные исследования
Глава 2. Объекты и методы исследования 43
2.1. Объекты исследований 43
2.2. Методы исследований 47
2.3. Статистическая обработка результатов исследований 57
ГЛАВА 3. Характеристика выделенного штамма в. pumilus «пашков» 58
3.1. Изучение морфологических и физиолого-биохимических свойств штамма В. pumilus 58
3.2. Антагонистическая активность штамма В. pumilus «Пашков» в отношении бактерий и дрожжевых грибов в сравнении с другими представителями рода Bacillus 60
3.3. Адгезивная активность штамма і?, pumilus «Пашков» в опытах
in vitro 64
3.4. Определение чувствительности к антибиотикам и плазмидного профиля штамма В. pumilus «Пашков» 65
3.5. Изучение токсичности, токсигенности, вирулентности и безопасности штамма В. pumilus «Пашков» в опытах in vivo 68
3.6. Характеристика рибосомальной РНК штамма/?, pumilus «Пашков»...72
ГЛАВА 4. Изучение ингибирующих свойств биологически-активных веществ, синтезируемых штаммом в. pumilus «пашков» в отношении условно патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов 75
4.1. Влияние состава питательной среды на ингибирующую активность биологически-активных веществ, синтезируемых штаммом В. pumilus «Пашков» в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов 75
4.2. Оценка специфической активности продуктов синтеза штамма В. pumilus «Пашков» в отношении бактерий Pseudomonas aeruginosa 89
4.3. Определение условий сохранения антимикробной активности культуральной жидкости В. pumilus «Пашков» 91
ГЛАВА 5. Оценка противовирусной активности биологически-активных веществ, синтезируемых штаммом в. pumilus «пашков» 93
5.1. Изучение репродуктивной активности энтеровирусов на клеточных линиях Vero 93
5.2. Определение инфекционного титра энтеровирусов 95
5.3. Выявление цитотоксичности культуральной жидкости, полученной в результате культивирования В. pumilus «Пашков» 98
5.4. Оценка противовирусной активности культуральнои жидкости В. pumilus «Пашков» по лечебной схеме 100
5.5. Оценка противовирусной активности культуральнои жидкости В. pumilus «Пашков» по профилактической схеме 105
Заключение
Выводы 118
Список литературы 1
- Характеристика антагонистической активности бацилл
- Статистическая обработка результатов исследований
- Определение чувствительности к антибиотикам и плазмидного профиля штамма В. pumilus «Пашков»
- Оценка специфической активности продуктов синтеза штамма В. pumilus «Пашков» в отношении бактерий Pseudomonas aeruginosa
Введение к работе
Актуальность темы
Бактерии рода Bacillus обладают выраженными антагонистическими свойствами в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (Блинкова Л.П., 2005, Бондаренко В.П., 2010, Михайлова Н.А., 1995, Успенский Ю.П., 2009, Muhammad S.A., 2009, Romero D., 2007).
Каждый производственный штамм бацилл характеризуется уникальностью и многообразием биохимических процессов, что проявляется в различии спектра и выраженности их антимикробного действия (Давыдов Д.С., 2007, Duc le H., 2004).
Антагонистическая активность бактерий рода Bacillus лежит в основе создания споровых препаратов-пробиотиков для профилактики и лечения различной патологии человека (Осипова И.Г., 2006, Успенский Ю.П., 2009, Duc le H., 2004, Hong H.A., 2008).
На отечественном фармацевтическом рынке существует более двух десятков препаратов из бацилл, содержащих штаммы B.subtilis и B.licheniformis (Похиленко В.Д., 2007). Другие представители бактерий рода Bacillus, например, B.pumilus не изучены (Бондаренко В.М., 2003, Мацулевич Т.В., 2007).
Критериями отбора пробиотических штаммов бацилл являются, помимо спектра и уровня антагонистической активности, способность к адгезии, стабильные генетические характеристики, безопасность для макроорганизма, таксономическая идентификация с применением современных и валидированных методов (Булатова Е.М., 2009, Ермоленко Е.И., 2009, Осипова И.Г., 2007, Duc le H., 2004, Hong H.A., 2008).
Антагонистическая активность спорообразующих бактерий обусловлена биологически-активными веществами, в основном белковой природы, синтез которых генетически запрограммирован и может реализоваться в полной мере при оптимальным параметрах культивирования (Блинкова Л.П., 2003, Jack R.W., 2005, Hong H.A., 2005, Stein T., 2005). Одним из значимых факторов, влияющих на продукцию биологически-активных веществ, является состав питательной среды (Подберезный В.В., 1997, Abdel-Mawgoud A.M., 2008, Jamil B., 2007, Muhammad S.A., 2009).
Метаболиты бацилл, выделяемые при культивировании, наряду с пробиотической активностью, представляют огромный интерес в качестве основы антимикробных препаратов, действующих избирательно на условно-патогенные и патогенные микробов без резких нарушений сложившегося микробиоценоза, имеющих место при применении антибиотиков широкого спектра действия (Вахитов Т.Я. и др., 2005, Онищенко Г.Г. и др., 2002, Teusink B. et al., 2005, Villas-Boas S. G. et al., 2005).
Таким образом, поиск новых перспективных штаммов – кандидатов в пробиотические, а также получение микробных продуктов на основе их метаболитов, обладающих направленным лечебным действием как в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов, а также против вирусов, являются актуальными и перспективными направлениями.
Цель настоящего исследования – экспериментальное изучение антагонистической активности штамма Bacillus pumilus «Пашков» в отношении различных видов бактерий, грибов и вирусов.
Задачи исследования:
-
Изучить морфологические и физиолого-биохимические свойства выделенного штамма Bacillus pumilus.
-
Оценить антагонистическую активность штамма B.pumilus «Пашков» в отношении условно-патогенных, патогенных бактерий, дрожжевых грибов.
-
Подобрать оптимальные параметры выращивания штамма B.pumilus «Пашков» для получения культуральной жидкости с максимальной ингибирующей активностью в отношении микробов и определить условия сохранения ее активности.
-
Изучить противовирусную активность культуральной жидкости, полученной при выращивании штамма B.pumilus «Пашков» на новой питательной среде, на примере возбудителей энтеровирусных инфекций.
Научная новизна работы:
Составлен генетический паспорт штамма, идентифицированного как B.pumilus «Пашков». Подана заявка на изобретение (№ 2009129639 от 04.08.2009г.): «Штамм бактерий B.pumilus «Пашков» - продуцент биологически активных веществ, обладающих антагонистической активностью в отношении условно-патогенных, патогенных бактерий, дрожжевых грибов и вирусов».
Разработана новая жидкая питательная среда, обеспечивающая максимальную выработку штаммом B.pumilus «Пашков» метаболитов, обладающих бактерицидным действием в отношении тест-штаммов патогенных и условно-патогенных бактерий, клинических штаммов P.aeruginosa и выраженным фунгистатическим эффектом в отношении клинических штаммов дрожжевых грибов.
Впервые, на примере изучения метаболитов, показана противовирусная активность спорообразующих бактерий в отношении энтеровирусов: полиовируса I типа, вирусов ЕСНО 3 и ЕСНО 6, вирусов Коксаки В нетипированных с 1 по 6 типы.
Практическая значимость работы
Выделенный и идентифицированный штамм бактерий рода B.pumilus «Пашков» депонирован в Государственной коллекции культур ГИСК им. Л.А. Тарасевича под номером 286. Изученный штамм может быть рекомендован для разработки нового оригинального биотерапевтического препарата-пробиотика медицинского и ветеринарного назначения, а также других лекарственных средств.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Выделенный штамм бактерий по морфологическим, физиолого-биохимическим и другим свойствам соответствует виду B.pumilus «Пашков». Он не содержит плазмид, антагонистически активен в отношении условно-патогенных и патогенных микробов разных таксономических групп, имеет низкий уровень адгезии. По своим характеристикам штамм можно рекомендовать в качестве пробиотического.
-
Культуральная жидкость B.pumilus «Пашков» содержит метаболиты, обладающие бактерицидным действием в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий, в том числе возбудителя госпитальных инфекций P.aeruginosa, и фунгистатическим действием в отношении дрожжевых грибов. Активность метаболитов зависит от параметров культивирования.
-
Разработанная питательная среда для культивирования B.pumilus «Пашков» позволяет получить БАВ, активно влияющие на условно-патогенные и патогенные микробы.
-
Биологически-активные вещества, выделяемые при культивировании B. pumilus «Пашков» обладают противовирусной активностью.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008).
Диссертация апробирована на совместном заседании отдела микробиологии Учреждения Российской академии медицинских наук НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН и кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии МПФ ММА им. И.М.Сеченова (Москва, 14 мая 2010).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.
Объем и структура диссертации
Материалы диссертации изложены на 149 страницах машинописного текста, иллюстрированы 7 рисунками и 28 таблицами, состоят из введения, обзора литературы, 4 глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы, включающего 263 источников (127 отечественных и 136 зарубежных).
Характеристика антагонистической активности бацилл
В настоящее время существует более четырех десятков препаратов, полученных на основе различных видов бактерий рода Bacillus, способных оказывать пробиотическое действие (23, 47, 51, 52, 97, 112, 117, 164, 166, 256, 259). В клиническую практику внедрены лекарственные средства, изготовленные на основе живых непатогенных антагонистически активных бацилл, имеющих широкий диапазон лечебно-профилактического действия и экологическую безопасность: В. cereus, В. subtilis, В. licheniformis, В. mesentericus Тоа, В. coagulans, В. polymyxa, В. pulvifaciens и др. (86, 98, 117,154, 169,170,243).
На сегодняшний день в России зарегистрировано около 25 наименований препаратов для нужд медицины и ветеринарии (97).
Для использования в практике здравоохранения существуют следующие препараты на основе бацилл: Бактиспорин, Споробактерин, Биоспорин, Витаспорин (44).
Бактиспорин, представляющий собой лиофилизированные живые бактерии В. subtilis штамма ЗН, является высокоэффективным средством для лечения детей и взрослых с острыми кишечными инфекциями (дизентерия, сальмонеллез) и дисбиозами различного генеза, в том числе с аллергодерматозом и пищевой аллергией (62, 118, 119). Высокую эффективность Бактиспорин проявил при лечении дисбиозов, вызванных грибами рода Candida, бактериями рода Pseudomonas (25). Являясь препаратом широкого спектра действия и обладая устойчивостью к ряду антибиотиков, Бактиспорин показан при сопутствующей терапии туберкулеза, бактериального вагинита, а также в профилактике гнойно-септических осложнений в послеоперационном периоде (25, 104, 114).
Споробактерин создан на основе антагонистически активного штамма В. subtilis 543, который подавляет жизнедеятельность бактерий родов Staphylococcus, Streptococcus, Escherichia, Proteus, Klebsiella, Salmonella, Actynomyces и грибов рода Candida (46, 67, 93). Выявлен статистически достоверный терапевтический эффект от использования Споробактерина у хирургических больных с гнойными ранами. При лечении препаратом 134 больных с дисбиозом I-IV степени в течение 10-90 дней у 90,3% пациентов достигнуты выраженные улучшения в сторону нормализации состава микробиоценоза кишечника (92). Споробактерин применялся также при лечении гнойных ран, пневмонии, остеомиелита, сепсиса, пиелонефрита у 276 человек (92).
Помимо монопрепаратов, существуют комплексные препараты, созданные на основе взаимного дополнения двух и более штаммов бактерий рода Bacillus. Примером такого препарата является Биоспорин, содержащий В. subtilis и В. licheniformis, которые отличаются друг от друга по физиолого-биохимическим свойствам, антагонистической активности, способности адаптироваться в различных отделах желудочно-кишечного тракта (86, 108). Показания к применению Биоспорина широкие: острые кишечные инфекции, гнойные раны, аллергические состояния, бактериальный вагиноз (69, 92, 95, 112). При лечении Биоспорином шигеллезов и сальмонеллезов у более 1000 пациентов наблюдалась полная элиминация возбудителей (112).
Витаспорин - также комбинированный пробиотик на основе двух штаммов В. subtilis 11В ВКМ В и 2218Д имеет показания для применения, аналогичные Бактиспорину.
На основе биомассы 3 штаммов Bacillus - В. subtilis ВКПМ В-7092, В. subtilis ВКПМ В-7048 и В. licheniformis ВКПМ В-7038 разработан препарат Ветом, предназначенный для лечения бактериальных и вирусных инфекций (89).
Возможность создания ассоциированных препаратов из нескольких культур Bacillus позволяет расширить их спектр действия (112, 220, 229). Исследования совокупного антагонистического эффекта бактерий рода Bacillus и условно-патогенных Е. coli показали, что в соотношении 1:1 обе культуры оказывали максимальный ингибирующий эффект в отношении патогенных и условно-патогенных микробов (39,122).
Перспективным считается применение пробиотиков избирательного действия на основе бактерий рода Bacillus, обладающих направленным действием к возбудителю, которые могут использоваться при наличии генерализованных форм моноинфекций. Примером избирательного действия может служить штамм В. subtilis 1119, обладающий максимально стабильным антагонистическим действием против бактерий К. pneumonia ssp. rhinoscleromatis. Штамм предложен в качестве основы для конструирования нового пробиотика (17).
Синегнойная палочка является одним из основных возбудителей гнойно-воспалительных процессов в условиях стационара, обладает высокой устойчивостью к неблагоприятным факторам среды, сохраняет жизнеспособность во многих антисептических растворах, применяемых в медицине (5, 65, 77, 101, 103). Инфекции, вызванные P. aeruginosa, плохо поддаются антибактериальной терапии в связи с множественной резистентностью возбудителя, как природной, так и передаваемой R-плазмидами (4, 38, 100, 103, 113). Среди механизмов лекарственной устойчивости называют блокаду транспорта антимикробных препаратов к внутриклеточной мишени за счет анатомических особенностей поверхностных структур и инактивация ферментами: пенициллинов и цефалоспоринов — бета-лактамазами, аминогликозидов ацетилтрансферазой и нуклеотидазой. Несмотря на успехи в антибактериальной терапии синегнойной инфекции, достигнутые за последние десятилетия, P. aeruginosa остается одним из наиболее проблематичных возбудителей нозокомиальных и внебольничных инфекций (96). Проблема борьбы с P. aeruginosa обуславливает поиск перспективных противосинегнойных препаратов, в том числе на основе продуцентов природных антимикробных субстанций. Хорошо известно, что если для лечения бактериальных инфекций существует широкий арсенал лекарственных средств, то для вирусных болезней набор таких препаратов весьма ограничен. Известно также, что многие вирусные инфекции осложняются бактериальными и, наоборот (112).
В последнее время получены рекомбинантные штаммы бацилл, обладающие способностью продуцировать интерферон, который обеспечивает противовирусную защиту. На основе штамма В. subtilis 2335, входящего в состав Биоспорина и штамма В. subtilis ВКПМ В-7048 созданы рекомбинантные варианты, способные синтезировать человеческий интерферон типа а-2 (8, 89).
В ветеринарии широко используются препараты на основе спорообразующих бактерий: Субалин, Споровит, Интестевит, Субтилис, Ирилис и другие. Их применяют для лечения гнойно—некротических процессов, маститов, эндометритов у животных, а также для коррекции микробного пейзажа кишечника и лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта (49, 64, 87, 126). Установлен также противовирусный эффект этих препаратов. Например, показано, что применение Субалина оказывало защитный эффект при фиппозной инфекции у 73% животных, а при экспериментальном герпетическом менингоэнцефалите — у 65% особей (112).
В настоящее время определены требования к штаммам, отбираемым в качестве производственных культур микроорганизмов: спектр и уровень антагонистической активности, способность к адгезии к эпителиоцитам кишечника, технологичность, т.е. способность к быстрому накоплению биомассы, устойчивость к лиофильному высушиванию, жизнеспособность при хранении (18, 22, 37, 50, 107, 112, 122, 154). Важно иметь стабильные генетические характеристики, в частности, отсутствие R-плазмид, детерминирующих множественную устойчивость к антибиотикам (26, 79). Особое внимание уделяется критериям безопасности используемых штаммов для здоровья человека (18, 50, 79, 83, 111, 112, 154, 166, 169, 198).
Одним из требований при отборе перспективных штаммов пробиотиков является его таксономическая идентификация с применением самой современной и валидированной методологии (18, 50, 79, 97). Для этого исследуются специфические для штамма пробы, полученные либо из общей хромосомальной ДНК, либо только из рибосомальной РНК.
Многолетнее применение лечебно-профилактических препаратов из живых эшерихий, лакто- и бифидобактерий выявило их невысокую эффективность при коррекции некоторых дисбиотических состояний в виду недостаточного антагонизма в отношении ряда условно-патогенных бактерий (стафилококков, энтерококков) и грибов (112). В таких случаях показано использование спорообразующих бактерий рода Bacillus. Уникальность и многообразии биохимических процессов, происходящих в клетках бацилл, и выделяемых ими метаболитов, обусловливают широкий спектр и выраженность их антагонистической активности в отношении патогенных и условно-патогенных микробов (47). При этом важной особенностью бацилл является отсутствие антагонизма в отношении представителей нормальной микрофлоры, что, в определенной степени, связано с их филогенетической общностью (39)
Статистическая обработка результатов исследований
В ходе экспериментов посевы производили на мясо-пептонный агар (МПА) и мясо-пептонный бульон (МПБ) (НПО «Питательные среды», Россия). Модифицированную среду Гаузе №2 применяли для оценки антагонистических свойств бацилл и изучения безопасности штамма В. pumilus «Пашков». Культуральные свойства выделенного штамма изучали на питательном агаре с добавлением 7% NaCl, на 5% кровяном агаре определяли наличие гемолизинов, на яичном бульоне тестировали лецитиназную активность, на среде Мюллера-Хинтона («HiMedia», Индия) — антибиотикоустойчивость.
Сахаролитические ферменты штамма В. pumilus определяли на средах Омелянского с индикатором бромтимоловым синим и карбогидратами — глюкозой, ксилозой, маннитом, лактозой, сахарозой, мальтозой, салицином и эскулином. Утилизацию цитрата и пропионата выделенным штаммом тестировали на среде Козера, способность восстанавливать нитраты - на бульоне с нитратами; определение в среде ацетоина (реакция Фогеса-Проскауэра) проводили на среде Кларка; способность продуцировать сероводород изучали на среде Клиглера; каталазную активность выявляли в реакции с 3% НгОгіспособность вырабатывать индол — на питательном бульоне с индикаторной бумагой; фермент уреазу — на среде с мочевиной (по Кристенсену), способность гидролизовывать крахмал и казеин — на картофельном и казииновом агарах.
Для культивирования бацилл применялись среды известного состава, используемые в производстве споровых пробиотиков и средах, рекомендуемых в литературе:
Среда № 9 (г/л): железо (II) сернокислое 7-водное - 0,01 («Реахим», Россия); магний сернокислый 7-водный - 0,1 («Реахим», Россия); хлористый марганец - 0,01 («Лабтех», Россия); кальций хлористый - 0,08 («Лаверна», Россия); пептон сухой ферментативный для бактериологических целей - 5,0 («HiMedia», Индия); глюкоза - 10,0 («Биотехнология», Россия); дрожжевой экстракт - 3,0 («HiMedia», Индия); рН 7,3+0,2
Среда № 5 (г/л): калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный -0,3 («Лабтех», Россия); аммоний сернокислый двузамещенный — 2,0 («Мосреактив», Россия); натрий лимоннокислый 5,5-водный - 2,0 («Лаверна», Россия); медь сернокислая 5-водная - 0,005 («Химмед», Россия); цинк сернокислый 7-водный - 0,004 («Химмед», Россия); железо (II) сернокислое 7-водное - 0,0005 («Реахим», Россия); кальций хлористый -0,165 («Лаверна», Россия); марганец (II) сернокислый 5-водный - 0,05 («Реахим», Россия); магний сернокислый 7-водный - 0,3 («Реахим», Россия); пептон сухой ферментативный для бактериологических целей - 5,0 («HiMedia», Индия); рН 7,3+0,2
Среда ВК-2 (г/л): хлористый марганец - 0,01 («Реахим», Россия), кальций хлористый - 0,5 («Лаверна», Россия); натрий хлористый — 5,0 («Sigma», США); натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный - 2,0 («Реахим», Россия); калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный - 2,0 («Лабтех», Россия); глюкоза 10,0 («Биотехнология», Россия); пептон сухой ферментативный для бактериологических целей - 10,0 («HiMedia», Индия); рН 7,3+0,2
Среда Спицайзена (г/л): аммоний сернокислый двузамещенный — 2,0, («Мосреактив», Россия); калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный -18,3 («Химмед», Россия); цитрат натрия 2-водный — 1,0 («Химмед», Россия), магний сернокислый 7-водный - 0,2 («Реахим», Россия); глюкоза - 10,0 («Биотехнология», Россия); дрожжевой экстракт - 1,0 («HiMedia», Индия); пептон сухой ферментативный для бактериологических целей 5,0 («HiMedia», Индия); рН 7,3+0,2 L-бульон (г/л).триптон - 10,0 («HiMedia», Индия); дрожжевой экстракт - 5,0 («HiMedia», Индия); натрий хлористый— 10,0 («Sigma», США). 2.1.3. Животные
Эксперименты выполнены на беспородных белых мышах обоего пола, массой 14-16 г в соответствии с Методическими рекомендациями (109). При проведении работ с животными руководствовались «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».
Прочие материалы - формалинизированные эритроциты человека 1(0) Rh+ группы, полученные из ГИСК им. Л. А. Тарасевича; - для определения чувствительности бацилл к антибиотикам применяли бумажные индикаторные диски с антибиотиками разных групп: бензилпенициллином, оксациллином, ампициллином, карбенициллином, цефалексином, цефазолином, цефуроксимом, цефотаксимом, цефтриаксоном, эритромицином, кларитромицином, триметопримом с сульфаметоксазолом, офлоксацином, ципрофлоксацином, канамицином, амикацином, тетрациклином, клиндамицином, левомицетином, рифампицином, бацитрацином, фузидином, новобиоцином (НИЦФ, г. Санкт-Петербург, Россия). фильтраты культуральных жидкостей (КЖ) штаммов: В. pumilus «Пашков», В. subtilis ЗН, В. subtilis 534, В. subtilis 1719. - культуры клеток: перевиваемая клеточная линия Vero Е6, полученная из Учреждения Российской Академии медицинских наук Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН (Москва), классический вариант Vero-к из коллекции ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов», Vero-ECC из Европейской коллекции клеточных культур. Культуры клеток выращивали в среде ДМЕМ («ПанЭко», Россия), содержащей 5% эмбриональной телячьей сыворотки («Ну Clone», США) и 50 мкг/мл гентамицина.
Определение чувствительности к антибиотикам и плазмидного профиля штамма В. pumilus «Пашков»
Проведенные эксперименты показали, что через 24 часа культивирования во всех опытных вариантах, содержащих штаммы спорообразующих бактерий, наблюдалось полное отсутствие роста дрожжей, тогда как во всех контрольных вариантах дрожжи выросли в виде колоний. Общий фунгистатический эффект (ОФЭ) за 20 суток роста значительно снижался независимо от вида бацилл. Однако за последующие 5 суток (на 25 сутки учета) дальнейших изменений этого показателя не происходило.
Из представленных данных величин максимальных специфических фунгистатических эффектов (СФЭ), выявленных на 7 сутки культивирования, следует, что все изучаемые штаммы бацилл проявляли высокую антифунгальную активность по отношению к клинически значимым штаммам дрожжей. Наибольшую устойчивость к действию бацилл проявляли культуры дрожжей родов С. haemuloni, С. tropicalis и Rhodotorula spp. Наименее устойчивыми оказались культуры С. albicans (оба штамма) и Debaryomyces hansenii. Полученные данные обнаружили, что В. pumilus «Пашков» проявил высокие и очень высокие антагонистические свойства в отношении условно-патогенных, патогенных бактерий и дрожжевых грибов. Сравнительное изучение тестируемых штаммов рода Bacillus показало, что выделенный штамм В. pumilus «Пашков» не уступает по спектру и выраженности отмеченных свойств другим представителям спорообразующих бактерий.
Положения о безопасном использовании спорообразующих бактерий в качестве пробиотических штаммов требуют изучения адгезивной активности (18,22,37,97, 107,154).
Адгезия микроорганизмов является первым этапом их взаимодействия с макроорганизмом и играет важную роль в колонизации биотопов последнего. Процессы адгезии к кишечному эпителию микроорганизмов -представителей нормальной микрофлоры наряду с антагонистическими свойствами последней по отношению к патогенной и условно-патогенной флоре определяют формирование резистентности.
В качестве универсальной модели для изучения адгезии клеток широко используется модель человеческих эритроцитов, на поверхности цитоплазматической мембраны которых располагаются более 20 различных гликопротеидов, включая гликофорин, идентичный гликокаликсу эпителиальных клеток.
Ниже приведены показатели адгезивной активности изучаемого штамма на эритроцитах человека (табл. 3.3.). Таблица 3.3. Адгезивная активность штамма В. pumilus «Пашков» на эритроцитах человека
Примечание: СПА — средний показатель адгезивности; К - коэффициент, процент эритроцитов, имеющих на своей поверхности прилипшие микробы.
Опыт показал, что адгезивные свойства штамма бактерий В. pumilus «Пашков» соответствовали низкому уровню адгезии. Определение чувствительности к антибиотикам и плазмидного профиля штамма В. pumilus «Пашков»
Антибиотикоустойчивость штамма — кандидата в пробиотические, является одним из важных свойств, определяющих возможность его применения совместно с антибактериальными препаратами (79). Мы изучали антибиотикорезистентность штамма В. pumilus «Пашков» по отношению к 22 антибиотикам различных химических групп. Полученные данные представлены в табл. 3.4.
Примечания: У - устойчив; УЧ - умеренно-чувствителен; Ч - чувствителе Из данных таблицы видно, что штамм проявлял устойчивость к оксациллину, ампициллину, цефуроксиму, цефотаксиму, цефтриаксону, эритромицину, тетрациклину, клиндамицину, левомицитину, рифампицину, бацитрацину, фузидину, новобиоцину и оказался чувствителен к цефалексину, триметоприму с сульфаметоксазолом, амикацину.
Частой причиной лекарственной устойчивости у бактерий является наличие плазмид, несущих гены, контролирующие антибиотикорезистентность, поэтому проведено определение плазмидного профиля штамма бактерий В. pumilus «Пашков». Результаты экспериментов представлены (рис. 3.1).
Безопасность пробиотических культур для макроорганизма является важной характеристикой при выборе штаммов для разработки бактерийных препаратов на их основе (18, 79, 83, 111, 154, 169, 198).
Изучение совокупности свойств, таких как вирулентность, токсичность, токсигенность и безвредность позволяет оценить отсутствие потенциально вредного влияния культуры на макроорганизм (табл. 3.5.1, 3.5.2,3.5.3,3.5.4). Таблица 3.5.1. Результаты исследования токсичности штамма В. pumilus «Пашков» при однократном в/б введении мышам
Из таблицы 3.5.3. видно, что штамм В. pumilus не обладал вирулентностью в испытанных концентрациях. Все животные оставались живыми в течение периода наблюдения (5 суток), ни у одного из них не выявлено признаков заболевания. Таблица 3.5.4. Результаты изучения безвредности штамма В. pumilus «Пашков»
ОцеНБ :а безвре дности лг гамма В. pumilus «Пашков» при введении возрастающих доз культуры при пероральном введении показала, что однократное введение per os больших доз (10x109 и 20 xl О9 КОЕ/мл) штамма не приводило к гибели животных. В. pumilus «Пашков» вызывал несущественное снижение веса животных в первые сутки после введения, в последующие дни вес животных нарастал. Данные опыта свидетельствуют о безвредности изучаемого штамма.
Во всех контрольных группах животных, получавших 0,9% NaCl, при оценке всех показателей безопасности, гибели животных также не отмечено.
Таким образом, исследования по оценке безопасности показали, что штамм бактерий В. pumilus «Пашков» является нетоксичным, нетоксигенным, авирулентным и безвредным. 3.6. Характеристика рибосомальной РНК штамма В. pumilus «Пашков»
Основные требования при разработке пробиотических препаратов на основе спорообразующих бактерий включают в себя таксономическую идентификацию до вида с применением современной и валидированной методологии (18, 79, 97). Показатели различий олигонуклеотидных последовательностей рРНК используют в целях определения таксономии микроорганизмов. При этом нуклеотидная последовательность 16S рРНК, являющаяся наиболее консервативным элементом бактерий, используется для составления генетического «паспорта» и вносится в базы банков культур. На основании базы данных GenBank провели анализ нуклеотидных последовательностей, кодирующих 16S рРНК у всех представленных в настоящее время штаммов В. pumilus. В результате подобрана структура праймеров для ПЦР-амплификации последовательности ДНК, кодирующей большую часть 16S рРНК В. pumilus, размером около 1,5 тыс. нуклеотидных пар. Как и следовало ожидать, данный продукт был получен в результате ПЦР(рис3.2.).
Оценка специфической активности продуктов синтеза штамма В. pumilus «Пашков» в отношении бактерий Pseudomonas aeruginosa
На следующем этапе работы определены инфекционные титры четырех энтеровирусов: вирус полиомиелита I типа (polio-1), вирусов Коксаки В нетипированных с 1 по 6 типы (Сох В 1-6), ECHO 3 и ECHO 6. Клеточный монослой заражали различными разведениями вирусов от 10" до 10" , инкубировали в термостате и через 47 и 72 часа учитывали результаты по ЦПД. Титром вируса считали его наибольшее разведение, вызывающее ЦПД в половине зараженных культур клеток (в 2 лунках из 4 с данным разведением вируса) и выражали в цитопатических дозах (ЦГТД5о) в 0,5 мл. Для контроля лунки с культурой клеток в поддерживающей среде (среда ДМЕМ с 2% ЭТС) оставляли незараженными. Данные титрования вирусов представлены в табл. 5.2.
Выявление цитотоксичности культуральной жидкости, полученной в результате культивирования В. pumilus «Пашков»
До начала изучения противовирусной активности БАВ, содержащихся в КЖ, полученной при культивировании штамма В. pumilus «Пашков» на новой питательной среде в отношении четырех видов энтеровирусов, мы оценили токсичность препарата для используемой клеточной культуры Vero Е6. Цитотоксичность оценивали по изменению морфологии фибробластов и проницаемости клеточных мембран с помощью теста исключения красителя трипанового синего. В опытах использованы концентрации КЖ от неразведенной до 1:80. О цитотоксическом действии каждого из разведений КЖ судили по концентрации, вызывающей гибель 50% клеток на 3-й сутки после внесения — хронической цитотоксичности или ЦД50. Определяли также концентрацию, вызывающую гибель 50% клеток в течение 24 часов, соответствующую острой цитотоксичности (ОЦД 50), и максимально переносимую дозу (МПД), соответствующую концентрации КЖ, которая не влияла на жизнеспособность клеток на протяжении 7-ми суток воздействия КЖ. Данные опытов по оценке ОЦД50, ЦД50 и МПД для каждого разведения КЖ представлены в табл. 5.3.
Данные табл. 5.3. свидетельствуют, что неразведенная КЖ В. pumilus «Пашков» не обладала острой цитотоксичностью (81,5% жизнеспособности клеток через 24 ч) и хронической цитотоксичностью (92,9% жизнеспособности клеток через 72 ч). Максимально переносимая доза при добавлении неразведенной КЖ составляла 68,1%. С увеличением разведения КЖ изучаемые показатели снижались и наименее выраженные цитотоксические эффекты (ОЦД50=99,1%, 1ДД50=100%) экспериментально зарегистрированы для разведения препарата 1:80.
В следующей серии экспериментов оценили противовирусную активность КЖ в отношении четырех энтеровирусов. На монослой клеток Vero Е6, выращенных на 24 - луночных планшетах, после удаления ростовой среды и однократного промывания ФБР вносили различные дозы энтеровирусов (от 100 log ТЦД50/о,5мл ДО 12,5 log ТЦЦ 5о/о,5мЛ) с последующим культивированием в термостате с 5% С02 в течение 1 час. После удаления неадсорбировавшегося вируса, монослой клеток дважды промывали ФСБ и вносили различные разведения КЖ. В опытах использовали КЖ в разведениях, не оказывающих цитотоксического воздействия на клетки (от неразведенной до 1:640). Учет результатов эксперимента проводили через 48 и 72 часа с момента инфицирования клеток по ЦПД, основываясь на результатах контроля доз вирусов. В табл. 5.4.1. представлены результаты данного эксперимента.
Наибольшую противовирусную активность в лечебной схеме проявили неразведенная КЖ и разведения 1:5-1:10. При заражении четыремя видами вирусов в концентрации 100 1оТЦЦ50/о,5мл КЖ достоверно подавляла развитие ЦПД до разведения 1:20 в каждом случае. При заражении вирусом полиомиелита I типа в концентрации 100 1оТЦД5о/о,5мл отсутствовало развития ЦПД при всех исследуемых разведениях КЖ. Так, снижение ЦПД на 50% относительно контроля наблюдалось при использовании разведений КЖ 1:160-1:640. При более низких инфицирующих дозах вируса полиомиелита I типа все разведения КЖ подавляли развитие ЦПД на 100% в течение 72 часов. Более низким, но достаточно выраженным противовирусным действием в лечебной схеме обладала КЖ в отношении вируса ECHO 6. Так разведения КЖ 1:80-1:640 при дозе вируса 100 logTJ4H5o/o,5Mfl подавляли развитие ЦПД на 30-60% относительно контроля. При более низких концентрациях вируса 100% подавление ЦПД наблюдалось при использовании разведений КЖ до 1:320. Наименее выраженный противовирусный эффект наблюдался при добавлении КЖ к культуре клеток, зараженной вирусом Сох В (1-6). Из табл. 5.4.1. видно, что при дозах вируса 100-50 1оТЦД5о/о,5мл разведение КЖ 1:20 подавляла ЦПД не более, чем на 50% по сравнению с контролем, в то время, как при более низких дозах разведение 1:20 обеспечивала отсутствие ЦПД на 100%. Разведения КЖ, начиная с 1:160 не проявили противовирусных свойств в лечебной схеме в отношении вируса Сох В (1-6) ни в одной из исследуемых доз вируса.
Таким образом, по совокупности результатов тестирования противовирусной активности исследуемых разведений КЖ по лечебной схеме выявлена эффективная защита клеток Vero Е6, инфицированных четыремя типами энтеровирусов.
Из результатов, представленных в табл. 5.4.2. следует, что лечебный эффект КЖ В. pumilus «Пашков» в отношении вируса полиомиелита I типа четко зависит от дозы вируса. При дозах вируса 12,5-25,0 log ТЦД50/о,5мл 100% защита инфицированных клеток после обработки КЖ проявлялась при максимально исследованном разведении 1:640 и сохранялась в течение 72 ч. При заражении культуры клеток высокими дозами вируса 50-100 logTI 5o/o,5 мл полная защита клеток наступала при обработке ЮК в разведениях 1:80-1:160, соответственно, а частичная защита сохранялась при разведениях препарата 1:160-1:320, соответственно, в течение 48 часов наблюдения.
Полученные результаты свидетельствуют, что наиболее эффективное лечебное действие КЖ проявлялось в отношении вируса полиомиелита I типа и ECHO 6, и менее в отношении вируса Коксаки В (1-6).
В следующих экспериментах оценивали противовирусную активность КЖ В. pumilus «Пашков» в отношении различных доз энтеровирусов по профилактической схеме. На монослой клеток вносили разведения КЖ от неразведенной до 1:160 в поддерживающей среде (ДМЕМ с 2% ЭТС) и инкубировали при 37 С в течение 24 часов. Затем КЖ удаляли и вносили различные дозы вирусов от 100 до 12,5 logTLU 5o/o,5Mn с дальнейшей инкубацией при 37 С в течение 1 часа. Противовирусную активность оценивали по ЦПД (табл. 5.5.1.).
![Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов Salmonella Enteritidis, экспрессирующих НВс-антиген вируса В с эукариотического и прокариотического промоторов [Электронный ресурс]](/i/i/4503/199818.png "Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов Salmonella Enteritidis, экспрессирующих НВс-антиген вируса В с эукариотического и прокариотического промоторов [Электронный ресурс] Донин Михаил Васильевич")
