Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 8
2.1. Общие сведения о возбудителях бруцеллеза 8
2.2. Иммуногенез при применении живых противобруцеллезных вакцин ... 16
2.3. Иммуномодуляторы и их влияние на иммуногенные свойства противобруцеллезных вакцин 26
2.4. Специфическая профилактика бруцеллеза крупного рогатого скота 32
3. Материалы и методы исследований 41
4. Результаты исследований 49
4.1. Кул ьтурально-морф о логические свойства штамма В. abortus R-1096...49
4.2. Остаточная вирулентность, длительность приживаемости, антигенные свойства и контагиозность штамма R-1096 на морских свинках 54
4.3. Стабильность свойств штамма R-1096 при пассажах через организм морских свинок 59
4.4. Иммуногенная активность штамма В. abortus R-1096 при вакцинации и ревакцинации морских свинок и влияние иммуномодуляторов на эти показатели 63
4.5 Испытание живой вакцины из штамма В. abortus R-1096 на крупном рогатом скоте 95
5. Обсуждение результатов исследований 101
6. Выводы 1 12
7. Практические предложения 1 14
8. Список использованной литературы 115
9. Приложения 14(
- Иммуногенез при применении живых противобруцеллезных вакцин
- Иммуномодуляторы и их влияние на иммуногенные свойства противобруцеллезных вакцин
- Остаточная вирулентность, длительность приживаемости, антигенные свойства и контагиозность штамма R-1096 на морских свинках
- Иммуногенная активность штамма В. abortus R-1096 при вакцинации и ревакцинации морских свинок и влияние иммуномодуляторов на эти показатели
Введение к работе
23833 і
Актуальность проблемы. В отдельных регионах страны остаётся актуальной проблема бруцеллёзной инфекции, приносящей не только большой экономический ущерб животноводству, но и представляющей угрозу здоровью населения.
На территории России в 50-е годы прошлого столетия широко изучали и применяли для специфической профилактики бруцеллеза крупного рогатого скота и других видов животных вакцину из агглютиногенного штамма В.abortus 19. Использование этой вакцины на крупном рогатом скоте в регионах со сложной эпизоотической обстановкой обеспечивало снижение заболеваемости животных и оказывало благоприятное влияние на эпидемиологическую обстановку. Однако улучшить эпизоотическую ситуацию по бруцеллёзу в целом по стране в результате её применения не удалось. Были обнаружены отрицательные свойства данного биопрепарата, в частности, его высокая агглютиноген-ность (О.И. Морякова, ПА Триленко).
Более эффективной в данном отношении оказалась вакцина из слабоагг-лютиногенного штамма В. abortus 82, широко применяемая в стране с 1974 года. Так, благодаря её использованию по определенным схемам в Российской Федерации число неблагополучных пунктов сократилось с 5305 в 1974 г. до 83 в 2002 г., т.е. в 64 раза, многие регионы полностью оздоровлены отданного заболевания (В.М. Авилов, К.М. Салмаков, АА Новицкий, 2000).
Однако в ряде оздоровленных хозяйствах некоторых областей при многократных ревакцинациях этой вакциной обнаруживается значительное количество животных с положительными поствакцинальными серологическими реакциями на бруцеллёз, которые необходимо дифференцировать, затрачивая время и средства (А.М. Фомин, К.М. Салмаков, 2003).
Поствакцинальная дифференциальная диагностика довольно трудоёмка, но она может быть решена. В связи этим в оздоровленных областях перспективно использование инагглютиногенных вакцин, так как при их применении практически отсутствуют препятствия для поствакцинальной диагностики в любые сроки (П.А Триленко, 1976; С.К. Димов и др., 1992). Эффективность инагглютиногенных вакцин связана не только с иммунитетом, но и с их провоцирующими свойствами. Но у данных биопрепаратов есть недостаток - низкая иммуногенность. В последнее время появилась возможность повысить иммуно-генность инагглютиногенных вакцин с помощью различных неспецифических иммуностимулирующих средств.
В 1964 году профессором КМ. Салмаковым ВНИВИ с помощью бактериофага был получен штамм В. abortus R-1096. Этот штамм в последние годы изучали исследователи нашего института в качестве антигена, аллергена и как вакцину (AM. Фомин, 1975; К.М. Салмаков, 1977; М.Х. Лутфуллин, 1983; Д.А. Хузин, 1983 и др.). Их исследования показали, что штамм R-1096 обладает свойствами вакцинного штамма. Однако эти исследования носили не систем-
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА СПтрбцгг л .
ный характер. При этом штамм R-1096 авторы использовали также в качестве контроля при изучении других биопрепаратов.
Всё вышесказанное определило направление наших исследований.
Цель и задачи исследований. Цель исследований — изучить иммунобиологические свойства вакцинного штамма В. abortus R-1096, влияние иммуно-модуляторов на формирование и течение противобруцеллёзного иммунитета у лабораторных животных, привитых этой вакцинной, испытать этот биопрепарат на крупном рогатом скоте в производственных условиях. Для реализации намеченной цели были поставлены следующие задачи:
-
Изучить культурально-морфологические свойства штамма R-1096.
-
Изучить антигенные свойства, длительность приживаемости, остаточную вирулентность и контагиозность штамма R-1096 на морских свинках.
-
Исследовать стабильность штамма R-1096 при пассажах через организм морских свинок.
-
Изучить иммуногенез и иммуногенные свойства штамма R-1096 при вакцинации и ревакцинации на морских свинках и влияние иммуномо-дуляторов на эти показатели.
-
Испытать вакцину из штамма R-1096 на крупном рогатом скоте в производственных условиях.
Научная новизна. Впервые в лабораторных условиях наиболее полно изучены иммунобиологические свойства вакцинного штамма В. abortus R-1096. Установлено, что культуры бруцелл этого штамма являются инагглютинабиль-ными по S-антигену бруцелл. Приживаются в течение 2-х месяцев в организме морских свинок, сохраняют стабильность свойств при 10-ти кратных пассажах через организм этих животных, вызывают активный вакцинный процесс в дозе 1000 м.к. Не обладают контагиозностью.
Показаны высокие иммуногенные свойства вакцины из штамма R-1096 при ревакцинации морских свинок по фону вакцины из штамма 82.
Установлено стимулирующее влияние тиосульфата натрия на иммуногенные свойства этой вакцины на морских свинках.
Получены положительные результаты при производственной апробации вакцины из штамма R-1096 для профилактики бруцеллёза крупного рогатого скота на заключительном этапе борьбы с этой инфекцией.
Практическая значимость. Всестороннее и детальное изучение штамма В. abortus R-1096 позволило с уверенностью считать его вакцинным. Полученные данные облегчили практическое применение вакцины из штамма R-1096 для провокации заболевания при проведении оздоровительных мероприятий в неблагополучных хозяйствах и профилактических мероприятий в оздоровленных хозяйствах с целью поддержания эпизоотического благополучия в стадах по этой инфекции без поствакцинальной серопозитивности.
Основные положения, выносимые на защиту:
- Иммунобиологические свойства вакцинного штамма В. abortus R-1096.
Влияние иммуномодуляторов на иммуногенез и иммуногенные свойства этого штамма в условиях эксперимента.
Результаты апробации вакцины из штамма R-1096 в производственных условиях.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на заседаниях ученого совета ВНИВИ в виде ежегодных отчетов (2001-2003); научно-производственной конференции (Казань, 2001); Межрегиональной научно-практической конференции (Барнаул,2002); Международной научно-практической конференции (Покров, 2002); Всероссийской научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань, 2002).
Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, доложены, обсуждены и одобрены на межлабораторном совещании сотрудников ВНИВИ (Казань, 2003).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 научных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 162 страницах компьютерного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, практические предложения, список использованной литературы и приложения.
Иммуногенез при применении живых противобруцеллезных вакцин
Течение и формирование иммунного ответа у животных, привитых живыми вакцинами, проходит в несколько фаз.
Первая фаза - адаптации, характеризуется отрицательными высевами бруцелл от иммунизированных животных. Эта фаза, которая длится несколько часов, соответствует периоду адаптации и началу размножения бруцелл в клетках ближайшего лимфатического узла.
Вторая фаза - регионарная, характеризуется размножением бруцелл, высеваемых при бактериологическом исследовании исключительно из регионарных лимфатических узлов, продолжительность этой фазы может быть до нескольких дней. В регионарную фазу иммуногенеза происходит интенсивное размножение вакцинной культуры в организме вследствие недостаточной фагоцитарной активности нейтрофилов и макрофагов. Через сутки после вакцинации неи-трофилы активно фагоцитируют бруцелл, однако последние остаются неизмененными и, размножаясь внутри фагоцитов, приводят к дегенеративным изменениям и разрушениям клеток. Первичный очаг воспаления в ответ на введение бруцелл характеризуется выраженной макрофагальной реакцией и частичной деструкцией микроорганизмов в микро- и макрофагах (ММ. Желудков, М.И. Чернышева и соавт., 1992).
Размножение бруцелл в микро- и макрофагах, недостаточная лизирующая способность фагоцитов приводят к диссеминации бруцелл вакцинной культуры по организму (П.А. Вершилова и соавт., 1974). Первичный воспалительный очаг, в котором происходит размножение бруцелл, является источником поступления вакцинной культуры в кровяное русло. Третья фаза - гематогенное распространение, когда в результате прорыва лимфатических барьеров бруцеллы по гемо- и лимфотоку разносятся по органам. Захват бруцелл микро- и макрофагами периферической крови в фазу гематогенной генерализации играет роль в распространении инфекции в организме. Многие авторы указывают, что интенсивность расселения и длительность пребывания бруцелл вакцинного штамма тесно связаны с развитием напряженного иммунитета (П.А. Вершилова и соавт., 1974). Сроки размножения и сохранения вакцинной культуры в организме зависят от введенной дозы и степени остаточной вирулентности штамма (М.И. Чернышева, 1962). Период размножения и диссеминации вакцинной культуры сопровождается синтезом специфических антител, уровень которых и продолжительность антителообразования обусловливаются дозой и остаточной вирулентностью штаммов.
При гуморальных иммунных реакциях факторами противоинфекционного иммунитета являются антитела всех подклассов и лимфокины, а неспецифических - разнообразные белки и пептиды, содержащиеся в крови и в жидкостях организма (комплемент, лизоцим и другие) (А.А. Коломыцев, В.А. Гаврилов, В.М. Евсеев, 1990). В начальной стадии развития иммунного ответа синтезируются иммуноглобулины класса М (Ig М), а в более поздние стадии - иммуноглобулины класса G (Ig G), причем титры Ig G значительно ниже титров Ig М -антител (СЕ. Rise, В. Boyes, 1971; J.E. Rose, М.Н. Roepke, Р.С. Wilkinson, 1966).
Четвертая фаза - множественных локализаций — характеризуется высевом бруцелл из отдельных узлов и органов. Эта фаза характеризуется развитием определенных морфологических сдвигов в лимфоузлах и органах иммунизированных животных - выраженной гиперемией ретикулоэндотелиальных элементов в лимфоузлах, селезенке, печени, в отдельных случаях - гранулем с некрозом (вакцинные штаммы с остаточной вирулентностью) (Г. А. Объедков, 1989).
Пятая фаза - угасания нестерильного иммунитета, характеризуется элиминацией бруцелл из организма. В период угасания нестерильного иммунитета, т.е. в фазу элиминации бру-целл вакцинного штамма из организма, наблюдается снижение титров специфических антител.
Сроки элиминации зависят от степени остаточной вирулентности культур, и в связи с этим увеличивается и нестерильная фаза иммуногенеза (П.Л. Вер-шилова и соавт., 1974; М.М. Желудков и соавт., 1992).
Завершается иммуногенез шестой - стерильной фазой иммунитета, характеризующейся отрицательными высевами из лимфатических узлов и органов у иммунизированных животных. Исследованиями G.G. Janney и соавт. (1962) и I.E. Moulton и соавт. (1958) установлено, что в клетках лимфоидной ткани и макрофагах в течение длительного времени, включая и стерильную фазу иммунитета, находится специфический антиген, активирующий иммунную систему.
На основании многочисленных работ советских и зарубежных исследователей известно, что иммунитет к бруцеллезу можно воспроизвести живыми вакцинами. Живые вакцины, приготовленные из бруцеллезных культур ослабленной вирулентности, как правило, воспроизводят более прочный и длительный иммунитет (С.Ф. Чевелев и соавт., 1983; М.И. Чернышева, 1962; F.C. Eisen-schent et al., 1995; J.A.M. Muskens, L.Z. Bercovich, CP.R.M. Damen, 1996 ).
В настоящее время имеется немало работ, посвященных изучению поствакцинального процесса в опытах на лабораторных и сельскохозяйственных животных (овцы, козы, крупный рогатый скот). Среди живых вакцин из гладких форм бруцелл наибольшее признание во всем мире получили штаммы B.abortus 19, 104-М, которые также применяются и в нашей стране. Среди препаратов из диссоциированных живых бруцелл в регионах России в настоящее время в качестве официального препарата применяется вакцина из штамма B.abortus 82. В качестве эксперимента широкого производственного испытания находятся вакцины из штаммов B.abortus 82-ПЧ, 75/79-А. В эксперименте и в производственных условиях проходят испытания инактивированные вакцины B.abortus 45/20, В-1. Вакцинный штамм B.abortus 19 был выделен в США Буком в 1923 году из молока коровы (I.M. Buek, 1930). В условиях хранения при комнатной температуре штамм значительно снизил вирулентные свойства. W.E. Cotton et а! (1936) отобрали из него наиболее иммуногенный клон. С момента получения по настоящее время культуру штамма 19 и вакцину из него всесторонне изучали многие зарубежные и отечественные исследователи, получая при этом неоднозначные результаты. Подробная характеристика применения вакцины из штамма 19 на крупном рогатом скоте дана P.Nicoletti (1977). Автор отмечает эффективность вакцинации штаммом 19 взрослого поголовья, как в полевых условиях, так и в контролируемом опыте. Практически ликвидируется клиническое заболевание и значительно снижается опасность заражения здорового скота. От воздействия возбудителя 65-75% вакцинированных животных приобретают полную защиту. Аборты после применения вакцины из штамма 19 зависели от дозы, способа ее введения, срока беременности и составили менее 1%.
Иммуномодуляторы и их влияние на иммуногенные свойства противобруцеллезных вакцин
Важное место в борьбе с бруцеллезом крупного рогатого скота, наряду с общими мерами, занимает специфическая профилактика заболевания с применением вакцин, приготовленных из различных штаммов бруцелл. С момента обнаружения возбудителя бруцеллеза изучено и испытано много различных вакцин, но штамма, полностью предохраняющего от заболевания, пока не найдено.
Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что наиболее эффективными для предупреждения заболевания бруцеллезом являются живые вакцины. Первые опыты по активной профилактике с применением вирулентного штамма бруцелл были проведены В. Bang на крупном рогатом скоте для предотвращения абортов, однако было установлено, что у привитых животных происходит выделение бруцелл с молоком.
В разных странах в комплексе мер борьбы с бруцеллезом крупного рогатого скота широко применяется вакцина из штамма В. abortus 19. В нашей стране ее широко использовали с 1952 г. для вакцинации телок, а с 1955 г. - взрослого поголовья. Широкое применение вакцины в различных регионах страны позволило значительно снизить распространение заболевания и оздоровить многие районы, области и республики страны от бруцеллеза крупного рогатого скота.
Об эффективности применения вакцины из штамма 19 в производственных условиях нет единого мнения. Так, одни (В.Б. Бельченко, 1966; А.Т. Жунушов, В.И. Ким, 1991) утверждают, что применение штамма 19 в комплексе противо-бруцеллезных мероприятий на крупном рогатом скоте в регионе со сложной эпизоотической обстановкой обеспечивало снижение заболеваемости животных и оказывало благоприятное влияние на эпидемиологическую обстановку, способствовало локализации бруцеллезной инфекции в хозяйстве и сокращению затрат на проведение мероприятий.
Кроме того, А.С. Гринин (1964) сообщает, что в стадах крупного рогатого скота, многократно привитого вакциной из штамма 19, в большинстве случаев не наблюдается клинического проявления бруцеллеза, но бактериологическими исследованиями у части животных устанавливается бруцеллоносительство.
Н.П. Старунова и соавт. (1993) установили, что применение в неблагополучных пунктах вакцины из штамма 19 приводит к резкому возрастанию в сыворотке крови противобруцеллезных антител в диагностических титрах. По мнению авторов, это связано с агглготиногенностью самой вакцины и за счет провокации скрытых форм болезни в стадах. Улучшить эпизоотическую ситуацию по бруцеллезу в хозяйствах в результате применения данной вакцины им не удалось.
В результате многочисленных исследований и применений данной вакцины было обнаружено много отрицательных свойств, в частности, ее высокая агглютиногенность (О.И. Морякова, 1957; П. И. Островидов, 1966; Б. Дарда-нов,1998).
Предложенный агглютиногенный вакцинный штамм В. abortus 104-М, по данным Х.С. Котляровой (1950), обладает выраженными иммуногениыми свойствами. Изучением данного штамма в экспериментальных и в производственных условиях занимались К.В. Шумилов, 1980; К.В. Шумилов, 1985; А.А. Клочков, 1980; И.А. Косилов и др., 1985. Авторы установили, что штамм 104-М является стабильным по всем культурально-морфологическим свойствам, не обладает абортогенными свойствами для крупного рогатого скота и не передается от вакцинированных животных к непривитым. По сравнению с вакциной из штамма 19, утверждают авторы, штамм 104-М более агглютиногенен, (А.А. Клочков, В.А. Ромахов и др., 1981) и имеет несколько повышенную вирулентность (К.В. Шумилов и др., 1984; В.И. Мельниченко, 1985). Высокая агглютиногенпость вакцин из штаммов 19 и 104-М мешает проведению поствакцинальных серологических исследований на бруцеллез, что значительно снижает их противоэпизоотическую эффективность.
В ряде научно-исследовательских учреждений нашей страны проведены заслуживающие внимания исследования по созданию противобруцеллезной вакцины, прививка которой обеспечивала бы получение достаточно прочного иммунитета без серопозитивности. Одной из них является вакцина из штамма В. abortus 82, предложенная К.М. Салмаковым. Вакцина из штамма 82, как любой биопрепарат, имеет свои достоинства и недостатки, и чтобы добиться успеха в борьбе с бруцеллезом, необходимо строго соблюдать порядок ее применения.
В результате использования вакцины из штамма 82 впервые 5 лет (1974-1978 п\) в регионах резко снизилась общая заболеваемость и количество положительно реагирующих на бруцеллез животных, число абортов уменьшилось в 2 раза.
Дальнейшее изучение из штамма 82 показало (И.А. Косилов и др., 1987; B.C. Бронников, Б.Ю. Кассал, 1990), что ее применение без выполнения комплекса организационно-хозяйственных мероприятий не может дать желаемых результатов. Высокие результаты достигаются в тех областях и краях, где тщательно осуществляются общие мероприятия, проводятся регулярные обследования стад, соблюдаются схемы и порядок применения вакцины.
Эффективность применения вакцины из штамма 82 зависит от начала сроков серологического исследования после ее введения (Э.А. Алиев, 1980; И.Д. Александров и др., 1988; Н.В. Филиппов и др., 1991). По мнению исследователей, ранние исследования через 3-5 месяцев после иммунизации способствовали более быстрому оздоровлению неблагополучных хозяйств.
Недостатком вакцины является ее абортогенность при введении беременным, ранее не прививавшимся против бруцеллеза животным. Так, A.M. Зелененький и др. (1977), Е.М. Степанов и др. (1983) при однократной иммунизации коров отмечали поствакцинальные аборты до 3 месяцев в размере 14% от привитых животных в стадах с острым течением бруцеллеза.
Т.А. Перегудов и соавт. (1987) для снижения абортогенных свойств живой вакцины из штамма 82 рекомендуют применять ее в инактивированной форме.
Для предотвращения абортогенности B.C. Степин и соавт., (1981), В.В. Черкасов и соавт. (1980), А.П. Ростов (1980) предложили двухэтапный способ вакцинации штаммом 82; суть метода заключается в последовательном введении 1/100 дозы, затем, через 30-45 дней, полной дозы, что проф ил актирует поствакцинальные аборты, выявляет животных с латентным течением болезни и создает более напряженный противобруцеллезный иммунитет.
Штамм 82-ПЧ является слабоагглютиногенным, при применении на стельных коровах не вызывает абортов. При исследованиях на морских свинках обладает достаточно высокими иммуногенными свойствами, хорошо приживается в организме вакцинированных животных (О.Т. Муллакаев и соавт., 1993, 1996; О.Т. Муллакаев, 1996). Количественный подсчет бляшкообразующих клеток в периферической крови подопытных животных дал авторам основание делать заключение о том, что эта вакцина менее реактогенна по сравнению со штаммами 19 и 82.
По исследованиям Э.А. Шуралева и соавт. (1999) иммуногенез у кроликов, вызванный введением вакцины из штамма 82-ПЧ, характеризовался активацией неспецифических факторов иммунитета, что выражалось в увеличении содержания в крови Т - и В -лимфоцитов и уровня а- и у- глобулинов. У морских свинок вакцинация штаммом 82-ПЧ приводила к быстрому обсеменению бру-целлами (в течение 30 суток), после чего наблюдалась их элиминация (к 3-му месяцу).
Остаточная вирулентность, длительность приживаемости, антигенные свойства и контагиозность штамма R-1096 на морских свинках
Бактериологическое исследование показало, что культуры выделялись в основном из отдаленных лимфатических узлов и органов. При убое морских свинок через 24 дня после иммунизации индекс инфицированное колебался в пределах 25 - 50 %, причем выше он был при убое животных, привитых исходной культурой и культурами 9-го и 10-го пассажей. Практически неизмененным остался и ИВС. Культуры всех пассажей сохранили положительные показатели в РА на стекле с R-сывороткой и отрицательные с S-сывороткой.
Результаты исследований культурально-морфологических свойств культур штамма R-1096 исходной и 10-го пассажа представлены в таблице 5.
Из таблицы видно, что исходная культура и культура 10-го пассажа ведут себя однотипно и представляют собой коккобактерии, красятся по Грамму отрицательно, по Козловскому - в красный цвет; дают положительную РА на стекле с R-сывороткой и отрицательную с S-антисывороткой, вызывают образование сероводорода, не нуждаются в повышенном содержании углекислого газа, дают положительную термоагглютинацию, вызывают ярко выраженную пробу (+-н ь) в трипафлавине, не растут на средах в присутствии пенициллина в концентрации 100 ЕД./мл., хорошо растут на средах с тионином и фуксином.
При окраске культур по Уайт-Вилсону отмечено, что они ведут себя идентично. Колонии при окрашивании однородны, приобретают фиолетовый цвет. Исследования показали, что в результате изучения культур штамма R-1096 исходного и 10-кратно пассированных через организм морских свинок -получены идентичные результаты. Это дает нам основание считать штамм R-1096 стабильным.
В опыте 4 изучали иммуногенез у морских свинок, привитых вакцинными штаммами В. abortus 82, 82-ПЧ и R-1096 с ксимедоном при раздельном их введении, а также иммуногенные свойства этих биопрепаратов с использованием культуры вакцинного штамма 82 в качестве инфицирующего агента.
Данные серологического исследования морских свинок и показатели клеточного иммунитета через 1 месяц после прививки представлены в таблице 6. Из таблицы 6 видно, что ксимедон, введенный морским свинкам через 3 недели после вакцинации, по разному влиял на показатели гуморального иммунитета в зависимости от штамма бруцелл и примененной реакции. Во-первых, все животные, независимо от штамма, реагировали отрицательно во всех серологических реакциях с S-бруцеллезными антигенами. Ксимедон не влиял на эти показатели.
У морских свинок, привитых вакциной из штамма 82, титр антител в РСК с R-антигеном был несколько ниже, чем у животных, которым был введен ксимедон, соответственно 80,0±40,0, 93,3±61,1. Тогда как в ИФА, наоборот были выше титры антител в первой группе. У животных, привитых вакцинами из штаммов 82-ПЧ и R-1096, наоборот, введение ксимедона способствовало понижению титров антител в РСК с R-антигеном и повышению такового в ИФА с R-антигеном в обеих группах животных.
Самые высокие титры антител в РСК и ИФА с R-антигеном были установлены в седьмой группе животных, привитых вакциной из штамма R-1096 на ланолин о-масляном адъюванте. В РСК они составили 280,0±І83,5, в ИФА 9940,0+1331,3.
Оп сон о- фагоцитарная реакция в этот срок у большинства морских свинок в целом была слабо выраженной, но фагоцитарное число во всех группах было выше у свинок, которым вводили ксимедон. Ясно выраженную реакцию наблюдали лишь в одной группе животных, привитых вакциной из штамма 82-ПЧ с ксимедоном, у которых фагоцитарное число составляло 29,7+8,4. При самых высоких титрах антител в седьмой группе животных, было самое низкое фагоцитарное число, которое равнялось 17,7±1,3.
Спустя 2 месяца с момента вакцинации морских свинок (таблица 6) в серологических реакциях с S-антигеном вновь во всех группах были получены отрицательные результаты. В показаниях реакций с R-антигеном произошли некоторые сдвиги. Так в первой группе титры антител в РСК с R-антигеном стали выше, чем во второй, а в ИФА, наоборот, титр антител вырос во второй группе, что совершенно отличается от показателей этих реакций при исследовании через 1 месяц после вакцинации.
В третьей и четвертой группе животных титры антител в РСК с R-антигеном стали равными, но ниже, чем в предыдущем исследовании, в ИФА они значительно выросли. У животных пятой и шестой групп количество антител не претерпело значительных изменений. В седьмой группе показания РСК с R-антигеном значительно снизились, а в ИФА практически остались на прежнем уровне. Опсоно-фагоцитарная реакция у большинства животных стала ясно выраженной. У морских свинок, привитых вакциной из штамма 82, она была выше в группе животных, иммунизированных вакциной без ксимедона. У животных, привитых вакциной из штамма 82-ПЧ, фагоцитарное число было идентично в третьей и четвертой группах. Значительная разница в данном показателе была у животных, привитых вакциной из штамма R-1096. Здесь применение ксимедона значительно повысило фагоцитарное число, которое в пятой группе составляло 20,6+1,7, а в 6-й - 30,6+2,6. Ясно выраженной ОФР была в седьмой группе. Спустя 2 месяца со дня прививки оставшихся морских свинок контамини-ровали подкожно культурой штамма 82 в дозе 1 млн. м. к. Культуру штамма использовали в качестве заражающего агента вместо культуры вирулентного штамма бруцелл. Показатели иммунитета в различных группах морских свинок представлены в таблице 7, из которой видно, что все животные контрольной группы были обсеменены культурой контаминанта в генерализованной форме с ИИ, равном 57,5+8,54%. Сыворотки крови их негативно реагировали в РБП, РА, РСК и ИФА с S-антигенами, а в РПГА титры антител составили 20,0+0,0. Титры антител в РСК с R-антигеном составили 140,0+20,0, а в ИФА они были высокими. У животных, привитых вакциной из штамма 82-ПЧ, ксимедон повысил иммуногенные свойства биопрепарата. Если в первой группе иммунитет составлял 50%, а ИИ 6,7+3,7%, то во второй группе эти показатели равнялись соответственно 66,7% и 3,3+2,3%. При этом во второй группе ни было, ни одного животного с генерализованной формой обсеменения организма культурой штамма 82. У морских свинок, привитых вакциной из штамма R-1096, иммунитет составил 80,0%, при этом ИИ равнялся 2,0+2,0, а у животных, привитых вакциной с ксимедоном, иммунитет был почти в 2 раза ниже, который составил 42,9%. Животные, иммунизированные вакциной из штамма R-1096 на ланолино-масляном адъюванте, в 100% случаев освободились от культуры инфицирующего штамма. Иммунитет у обеих морских свинок был стерильным, В целом считаем, что иммунные свойства противобруцеллезных вакцин можно проверять с использованием культуры вакцинного штамма 82 в качестве заражающего агента в дозе 1 млн. м. к.
Иммуногенная активность штамма В. abortus R-1096 при вакцинации и ревакцинации морских свинок и влияние иммуномодуляторов на эти показатели
Бруцеллез - эта хроническая инфекция сельскохозяйственных и диких животных, которая все еще остается серьезной проблемой и представляет угрозу здоровью населения. Несмотря на достижения науки и передового опыта, на борьбу с бруцеллезом требуются значительные материальные затраты.
В настоящее время в нашей стране в комплексе противобруцеллезных мероприятий для иммунизации крупного рогатого скота широко применяют живые вакцины из штаммов В. abortus 19 и 82. Но каждая из этих вакцин имеет недостатки. Вакцина из штамма 19 обладает выраженной агглютиногенностью. В связи с этим, ею допускается прививать только молодняк и однократно. Коровы прививаются лишь в стадах, не имеющих перспективу оздоровления от бруцеллеза. Живая бруцеллезная вакцина из штамма 82 является эффективным средством для иммунопрофилактики бруцеллеза крупного рогатого скота. Массовое применение этой вакцины (К.М. Салмаков, 1980) снижает заболеваемость крупного рогатого скота бруцеллезом в 3,5 раза. Штамм 82 обладает выраженной иммуногенностью, имеет слабые агглютиногенные свойства, что дает возможность оздоравливать хозяйства от бруцеллеза в более короткие сроки (А.А. Новицкий и др., 1986; Л.А. Малышева, 1998). Вакцина применяется на молодняке и коровах в неблагополучных и благополучных по бруцеллезу хозяйствах.
Однако вакцина из штамма 82 в иммунизирующей дозе 100 млрд. м. к. абортогенна при первичном применении ее на беременных коровах и нетелях. Это делает нежелательным ее применение на маточном поголовье, не имеющем иммунного фона против бруцеллеза. Кроме того, и в оздоровленных областях при многократных ревакцинациях коров этой вакциной обнаруживается значительное количество животных с поствакцинальными серологическими реакциями на бруцеллез, которые необходимо дифференцировать. Практически эта проблема решима, но требует затрат времени и средств (A.M. Фомин, К.М. Салмаков, 2003).
В связи с этим вопросы специфической профилактики бруцеллеза остаются актуальными. Оптимальным вариантом решения этой проблемы является использование противобруцеллезных вакцин, способных создавать у животных иммунитет достаточной напряженности при слабовыраженной серопозитивно-сти.
Многие исследователи пытались понизить антигенные свойства применяющихся вакцин, изменяя схемы и методы иммунизации. Однако широкой поддержки они не получили (А.В. Селиванов, 1963; В.А. Мироненко, 1986; А.А. Лим и соавт., 1989; А.А. Новицкий и соавт., 1989; Н.Х. Мамаев и соавт., 1997).
Опыт борьбы с бруцеллезом крупного рогатого скота свидетельствует о том, что при оздоровлении того или иного региона от данной инфекции нельзя сразу же прекращать ревакцинацию животных. С учетом этого в таких регионах на коровах перспективно использование инагглютиногенных вакцин, при их применение практически отсутствуют препятствия для поствакцинальной диагностики в любые сроки (П.А. Триленко, 1976; С.К. Димов и др., 1992; Т.К. Касимов, В.И. Ким и др., 2002).
Авторы, однако, отмечают, что ни одна из предлагаемых инагглютиногенных вакцин не имела преимуществ по иммуногенности перед вакцинами, изготовленными из типичных штаммов бруцелл.
Вместе с тем И.Ф. Таран и Е.И. Замахаева (1971) утверждают, что в ускоренном оздоровлении хозяйств от бруцеллеза при помощи вакцинации решающее значение имеет тщательность и кратность комплексных исследований животных, как перед вакцинацией, так и в период заключительных оздоровительных работ. Вакцину, считают они, следует рассматривать как вспомогательный фактор, снижающий инфекционность очага, чем и облегчается сам процесс оздоровления хозяйств.
К тому же результаты проведенного испытания профилактической эффективности иммунизации крупного рогатого скота адъювант - вакциной изштамма В. abortus KB 17/100, проведенного В.В. Калмыковым и A.M. Бобылевым (2000) в Саратовской области, свидетельствует о том, что новая инагглю-тиногенная вакцина позволяет выявлять животных, больных бруцеллезом в латентной форме, предохраняет здоровых животных от заражения и препятствует распространению болезни.
В 1964 году в лаборатории по изучению бруцеллеза ВНИВИ (г. Казань) профессором К.М. Салмаковым был получен инагглютиногенный штамм В. abortus R-1096, который является инагтлютиногенным, не обладает абортогсн-ностью, но низко иммуногенен.
Этот штамм в лабораторных условиях за последние годы изучали в качестве антигена, аллергена и как вакцину (В.П. Корунов, 1974; К.М. Салмаков, 1977; A.M. Фомин, 1975 и др.). Но авторы использовали штамм R-1096 в качестве контроля при изучении других биопрепаратов, как типичную R-форму бруцелл.
В связи с этим нами была поставлена задача - изучить иммунобиологические свойства вакцинного штамма В. abortus R-1096, Первоначально изучали культурально-морфологические свойства штамма по общепринятой схеме ФАО/ВОЗ. В качестве контролен при этом использовали вакцинные штаммы В. abortus 19, 82, 82-ГГЧ и референтные вирулентные штаммы В. abortus 544, B.suis 1330 и В. melitensis 16 М.
При изучении свойств штамма R-1096 отмечено, что в пробирке на скошенном агаре при посеве в первые сутки он образует колонии прозрачного цвета, которые затем начинает мутнеть. При посеве в бульон наблюдается просветление бульона, а на дне образуется осадок. При окрашивании по Уайт-Вилсону колонии однородны, их окраска не изменяется с .возрастом и увеличе-нием в размере: на 3-сутки колонии имели фиолетовый цвет, на 4-сутки — окраска колонии не изменилась. Штамм R-1096 находится в R-форме. Культура штамма агглютинируется в пластинчатой РА на стекле с бруцеллезной R-сывороткой и дает отрицательную реакцию с S-сывороткой, монорецепторны 104 ми «Л» и «М» сыворотками. Ие лизируется фагом «Тб», даст положительные пробы с трипафлавином и термоагглютинации. Культура штамма растет во всех разведениях тионина и фуксина, дает образование сероводорода и слабочувствительна к пенициллину.
Штамм R-1096 обладает остаточной вирулентностью, обеспечивающей распространение бруцелл и временное сохранение их в организме. Исследования проведены в опытах на морских свинках. Животных иммунизировали в дозах 10, 50, 100, 1000, 10 тыс., 100 тыс., 1 млн., 1 млрд. м. к. в I мл., убивали животных через 1 месяц. Через 30 дней индекс инфицированности у морских свинок, привитых исходной культурой, составил при введении 1000 м. к. -22,5±18,4 %, 10 тыс. м. к. - 2б,7±14,8 %. На введение меньших доз ИИ соответственно был ниже. Сыворотки крови животных, независимо от дозы введения, не реагировали с биофабричным антигеном в РА, РБП, РПГА, РСК и ИФА, а в РСК и ИФА с R-антигеном давали положительную реакцию на дозу 10 м. к. и выше.
![Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов Salmonella Enteritidis, экспрессирующих НВс-антиген вируса В с эукариотического и прокариотического промоторов [Электронный ресурс]](/i/i/4503/199818.png "Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов Salmonella Enteritidis, экспрессирующих НВс-антиген вируса В с эукариотического и прокариотического промоторов [Электронный ресурс] Донин Михаил Васильевич")
