Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. Обзор литературы 9
ГЛАВА 1. Нормальная микрофлора 9
1.1. Микрофлора кишечника и ее роль в обеспечении состояния здоровья организма хозяина
1.2. Нарушения колонизационной резистентности - дисбиозы и их классификация
ГЛАВА 2. Применение пробиотиков в практике здравоохранения
2.1. Пробиотики на основе Escherichia coli 18
2.2. Пробиотики на основе бактерий рода Bacillus 20
ЧАСТЬ II. Собственные исследования 24
ГЛАВА 1. Материалы и методы 24
1.1. Материалы 24
1.2. Методы 25
1.2.1. Исследование культурально-биохимических свойств бактерий рода Bacillus
1.2.2. Исследование культурально-биохимических свойств микроорганизмов
1.2.3. Определение адгезивной активности
1.2.3.1. Метод определения адгезии микробов к эритроцитам 26
1.2.3.2. Метод определения адгезии микробов к эпителиальным клеткам кишечника лабораторных животных
1.2.4. Определение антагонистической активности 28
1.2.5. Оценка количественного и качественного состава микрофлоры
1.2.6. Моделирование экспериментального дисбиоза 29
1.2.7. Изучение органно-тканевой транслокации 29
1.2.8. Определение функциональной активности альвеолярных макрофагов
1.2.9. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов 33
1.2.10. Определение уровня цитокинов 34
1.2.11. Методы изучения безопасности
1.2.11.1. Изучение острой и хронической токсичности 36
1.2.11.2. Изучение безвредности 37
1.2.11.3. Изучение вирулентности 37
1.2.11.4. Изучение токсичности 3 8
1.2.11.5. Изучение токсигенности 38
1.2.12. Методы статистической обработки результатов исследований 38
ГЛАВА 2. Исследование биологических свойств и безопасности пробиотических культур in vitro и in vivo
2.1 Изучение культуральных, биохимических и морфологических свойств
2.2 Изучение безопасности штаммов 40
2.3 Изучение антагонистических свойств 45
2.4. Выбор оптимальной композиции штаммов 46
ГЛАВА 3. Моделирование экспериментального дисбио- за и его коррекция пробиотическими штаммами, а также их композицией
3.1. Моделирование дисбактериоза на мышах и его коррекция 49
3.2 Изучение адгезии микроорганизмов в условиях экспериментального дисбиоза
3.3 Изучение бактериальной транслокации в условиях экспериментального дисбиоза
3.4. Изучение факторов неспецифического иммунитета на модели 61
экспериментального дисбиоза
Заключение 71
Выводы 79
Список литературы
- Нарушения колонизационной резистентности - дисбиозы и их классификация
- Пробиотики на основе бактерий рода Bacillus
- Исследование культурально-биохимических свойств микроорганизмов
- Изучение антагонистических свойств
Введение к работе
Актуальность проблемы. В России более 90% населения страдает качественными и количественными нарушениями микробиоценоза кишечника, сопровождающимися ухудшением состояния здоровья человека [Воробьев А А , Бондаренко В М , 2004 г ] Указанный феномен связан с увеличением числа и выраженности этиологических факторов дисбиотических изменений (применение антибиотиков, инфекционные заболевания, ионизирующее излучение, стрессовые перегрузки, ухудшающийся экология и др ), а также с недостаточной эффективностью существующих терапевтических средств [Алешкин В А с соавт, 2002, Шендеров Б А , 2005, Феклисова Л В , 2005, К Orrhage et al, 1999, С Allon et al, 2000, EMM Quigley, В Floune, 2007]
Для коррекции измененного биоценоза желудочно-кишечного тракта применяются пробиотики, состоящие из живых микробных культур [Бондаренко В М , 2005, 2006] Данные препараты содержат штаммы либо эндогенной микрофлоры (бифидо-, лакто-бактерии, кишечная палочка, др ) предназначенные для восстановления нормофлоры в организме-хозяине, либо штаммы транзиторных микроорганизмов (например, апатоген-ных представителей рода Bacillus), используемых для подавления патогенных и условно патогенных микробов (УПМ)
Первыми препаратами, введенными в клиническую практику для коррекции дис-биозов, были пробиотики на основе кишечной палочки [Nissle А, 1959, Перетц Л Г, 1965] Механизм их действия обусловлен выраженной антагонистической активностью в отношении ряда патогенных и условно патогенных энтеробактерий и восстановлением колонизационной резистентности [Бережной В В соавт, 2002, Алешкин В А с соавт , 2002] Показано, что применение пробиотических культур Е coh сопровождается стимуляцией факторов специфического и неспецифического иммунитета [Ю К Зацепин, 1972, Н Б Касымова с соавт , 1982] Несмотря на высокий лечебный эффект данных препаратов при кишечных инфекциях, в случаях, сопровождающихся персистен-цией стафилококков и грибов рода Candida, они оказались неэффективными [Осипова И Г, 1997, Бухарин О В , 2006]
При таких ситуациях показано применение пробиотиков на основе живых апато-генных спорообразующих бактерий, поскольку они обладают более широким спектром антагонистической активности к патогенным и условно патогенным бактериям и грибам Выраженный антагонизм данные препараты проявляют в отношении Staphylococcus aureus и Candida albicans, которые в настоящее время являются этиологически значимыми в развитии микроэкологических нарушений, сопряженных, с различными патологиями [Осипова И Г, 2006] Некоторые авторы классифицируют споровые препараты как «природные антибиотики», ввиду продукции бациллами большого количества про-теолитических ферментов, биологически активных и антибиотикоподобных веществ, а также проявления иммуномодулирующих свойств [Слабоспицкая AT и др., 1990, Ни-китенко В И , 1991, Смирнов В В и др , 1995, Шендеров Б А и др, 1997, Поберий И А и др , 1998, Осипова И Г, Михайлова Н А , и др , 2003]
В литературе отсутствуют исчерпывающие систематизированные сведения о влиянии пробиотиков на основе кишечной палочки и апатогенных бацилл на функциональное состояние макрофагов, нейтрофилов, уровень цитокинов и иных факторов неспецифического иммунитета Учитывая, что в нарушениях микробиоценоза причинно-значимыми являются различные ассоциации УПМ, в частности энтеробактерий, стафилококки и грибы рода Candida, изучение возможности создания комплексного препарата, содержащего кишечную палочку и бациллы, представляет большой научно-
практический интерес
Учитывая вышеизложенное, на этапе доклинического изучения целесообразно исследовать биологические свойства пробиотических штаммов и их композиций на модели экспериментального дисбиоза
Цель и задачи исследования
Целью настоящего исследования явилось изучение биологических свойств Е coll М-17 и В subtihs 1719 и их композиции на модели экспериментального дисбиоза Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи
-
Исследовать безопасность бактериальных культур Е coll М-17 и В subtihs 1719 in vitro и in vivo
-
Изучить адгезивную и антагонистическую активность штаммов Е coh М-17 и В subtihs 1719, а также их композиций в различных количественных соотношениях
-
Изучить нарушения колонизационной резистентности (КР) (состав микрофлоры кишечника, адгезивную активность УПМ, транслокацию бактерий во внутренние органы и факторы неспецифического иммунитета) при экспериментальном дисбиозе
-
Провести сравнительное изучение корригирующих свойств штаммов Е coh М-17 и В subtihs 1719, а также их оптимальной композиции, при экспериментальном дисбиозе
Научная новизна
Впервые проведено комплексное изучение безопасности пробиотических штамма В subtihs 1719 in vitro и in vivo
Изучена антагонистическая и адгезивная активность различных соотношений пробиотических штаммов Е coh М-17 и В subtihs 1719 по отношению к патогенным и условно патогенным микроорганизмам На основе сравнительной оценки биологических свойств, с учетом совместимости штаммов, сконструирована оптимальная композиция
Впервые исследованы нарушения колонизационной резистентности при экспериментальном дисбиозе, вызванном пероральным введением антибиотика широкого спектра действия доксициклина, которые выразились следующим образом
в составе микрофлоры достоверно возрастало количество лактозонегативной кишечной флоры, энтеробактерий, грибов р Candida, уменьшалось количество лак-тобацилл,
возрастала адгезивная активность УПМ к кишечному эпителию за счет увеличения рецепторной способности последнего,
лактозонегативная кишечная флора транспонировалась во внутренние органы,
наблюдался незавершенный фагоцитоз
Использование модели экспериментального дисбиоза позволило выявить корректирующие особенности каждого пробиотического штамма и их оптимальной композиции
Практическая значимость
Полученные данные расширяют представления о биологических свойствах про-биотических штаммов Ecoh М-17 и В subtihs 1719, позволяют оптимизировать методические подходы при конструировании комплексного пробиотика, внедрение которого в практику здравоохранения позволит усовершенствовать медицинскую технологию коррекции дисбиозов различной этиологии
Положения, выносимые на защиту
-
Исследование биологических свойств пробиотических штаммов Е coh М-17 и Б subtihs 1719 in vitro и in vivo является необходимым условием подтверждения их безопасности
-
На основе сравнительной оценки адгезивной и антагонистической активности штаммов Е colt М-17 и В subtihs 1719 с учетом их совместимости сконструирована оптимальная пробиотическая композиция
-
Доказательством развития экспериментального дисбиоза при ведении антибиотика доксициклина является нарушение колонизационной резистентности и факторов неспецифического иммунитета
-
При сравнительном изучении свойств пробиотических штаммов Е coh М-17 и В subtihs 1719 выявлены специфические особенности их корректирующего действия на разработанной модели экспериментального дисбиоза
Апробация диссертации.
Основные положения были доложены на заседаниях кафедры микробиологии Медицинского факультета Российского Университета Дружбы Народов (Москва, 2004, 2005), на 8-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004), на 5-ом съезде «Научного общества гастроэнтерологов» (Москва 2005), Московской международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006)
Диссертация апробирована на заседании Ученого совета медицинского факультета Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов», Москва
По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 4 в изданиях, рекомендованных ВАК
Структура и объем диссертации.
Нарушения колонизационной резистентности - дисбиозы и их классификация
В России более 90% населения страдает патологиями, связанными с качественными и количественными нарушениями микрофлоры кишечника (8, 9), что связано с увеличением числа и выраженности этиологических факторов дисбиотических изменений (применение антибиотиков, инфекционные заболевания, ионизирующее излучение, стрессовые перегрузки, ухудшающийся экологический фон и др.), а также с недостаточной эффективностью существующих терапевтических средств (7, 72, 80, 89,115).
Термин «дисбактериоз», введенный в 1916 году немецким врачом A.Nissle имеет ряд синонимов: нарушение микроэкологии кишечника, дис-биоз кишечника, нарушение биоценоза кишечника и др. Различия в термино 13 логии в значительной мере обусловлены тем, что сама проблема имеет два аспекта: клинический и микробиологический.
Дисбактериозы способствуют развитию тяжелых рецидивирующих инфекционных заболеваний, иммунодефицитов, аллергопатологий, анемий, гастроэнтерологических и других соматических патологий (19, 72, 76, 80).
В отраслевом стандарте «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» дисбактериоз кишечника определен как клинико-лабораторный синдром, возникающий при целом ряде заболеваний и клинических ситуаций, которые характеризуются изменением качественного и/или количественного состава нормофлоры определенного биотопа, транслокацией различных её представителей в несвойственные биотопы, метаболическими и иммунными нарушениями, сопровождающимися у части пациентов клиническими симптомами (44,90,91).
Таким образом, дисбиоз не является отдельной нозологической формой и не может быть изолированным клиническим диагнозом, это синдром патологического состояния кишечника - микробиологический диагноз (8, 15,19).
Большинство исследователей трактуют дисбиоз как состояние срыва адаптации, нарушение защитных и компенсаторных механизмов. Развитию дисбиоза способствуют изменение привычного образа жизни, гиповитаминоз, истощение организма, применение антибиотиков, гормональная терапия, а также снижение иммунологической реактивности организма. Особенно выражены изменения микрофлоры кишечника при антибактериальной терапии (5,73).
В настоящее время нарушению микробного пейзажа кишечника придается большое значение при самых различных заболеваниях местного и общего характера. Дисбиоз регистрируется у подавляющего большинства больных с поражением желудочно-кишечного тракта инфекционной и неинфекционной природы, при хронических воспалительных и аллергических заболеваниях, онкологических процессах, у реконвалесцентов после перенесенных инфекционных заболеваний внекишечной локализации, при приеме антибиоти 14 ков, в процессе и после лучевой терапии. Нередко, изменение микрофлоры кишечника обнаруживается у проживающих в экологически неблагоприятных условиях, а также при нервных стрессах (8, 15, 16, 73, 128).
Нарушение микробиоценоза кишечника характеризуется исчезновением или уменьшением числа представителей нормальной микрофлоры и увеличением численности условно-патогенных микроорганизмов (энтеробакте-рий, стафилококков, грибов рода Кандида и др.). Вследствие чего создается ситуация, когда дисбиозные микробные ассоциации не могут выполнять защитные и физиологические функции (9, 33, 34, 73, 74, 76, 166).
Дефицит основных представителей микробиоты (бифидобактерий и лактобактерий) приводит к уменьшению уровня незаменимых питательных субстратов, увеличению токсического потока БАВ, что приводит к снижению адаптационных возможностей организма.
Биологическое равновесие нормофлоры устойчиво относительно и достаточно легко нарушается самыми различными факторами экзогенной и эндогенной природы, которые могут приводить к нарушению не только количественного и качественного состава нормофлоры, но и к усилению генетического обмена и формированию измененных клонов, несущих плазмиды лекарственной устойчивости, нередко включающие острова патогенности, детерминирующие адгезивные, цитотоксические и энтеротоксические свойства бактерий, что обуславливает отрицательные свойства факультативной дис-биозной микрофлоры (9, 50,104).
Она может быть источником инфекции, вызывая гнойно-септические и другие болезни, иметь сенсибилизирующую активность, проявляющуюся через аллергические реакции, иметь банк плазмидных генов, обеспечивающих формирование патогенных клонов, и обладать мутагенной активностью, стимулируя возникновение и развитие опухолей (9, 48).
Увеличение численности УПМ также оказывает отрицательное влияние на жизнедеятельность и состояние макроорганизма. Проявления отрицательного потенциала УПМ при дисбиозе ЖКТ отражены в таблице 1.1 (9).
Пробиотики на основе бактерий рода Bacillus
Изучение острой и хронической токсичности производственного штамма Е. coli М-17 показало, что независимо от способа введения материала на 1 сутки опыта, приблизительно у половины животных, выявлено усиление макрофагальной реакции и истощении коры в тимусе и у одной мыши (после в/бр введения) небольшая интерстициальная реакция в легких. На 7 сутки отмеченные изменения находили у 2-х из 15 животных.
При изучении хронической токсичности штамма Е. coli М-17 клинически все животные были здоровы. При макроскопическом изучении признаков патологии внутренних органов не обнаружено. Через сутки после 10 кратного введения препарата в дозе 1x107 микробных клеток у отдельных животных отмечена небольшая интерстициальная реакция в легких. Через 7 суток патологии не выявлено. Проведенные исследования свидетельствуют, что при введении разными способами и в разных дозах производственного штамма E.coli М-17 не выявлено их токсического действия.
У всех животных при макро - и микроскопическом исследованиях патологические изменения во внутренних органах и ЦНС, указывающие на наличие токсического действия у штамма Escherichia coli М-17 , даже при введении максимально переносимых, доз не обнаружены.
Данные по изучению острой токсичности штамма Escherichia coli М-17 свидетельствуют о том, что для лабораторных животных испытуемый штамм даже при введении максимально переносимых доз не обладает токсическими свойствами. Таким образом, полученные данные указывают на отсутствие у штамма Escherichia coli М-17 острой токсичности. Проведенные экспериментальные исследования показали, что изученный штамм после 20 - кратного введения испытуемого материала в дозе 2х107КОЕ/мл /мл при пероральном пути введения мышам линии black: 1) не вызывали гибели животных, не приводили к развитию во внутренних органах и ЦНС изменений, указывающих на наличие токсического действия, 2) не обладали местным раздражающим действием при пероральном способе введения (не отмечалось гиперемии, эрозий, кровоизлияний в корне языка и желудке). Таким образом, полученные данные указывают на отсутствие у изученного штамма хронической токсичности.
В контрольной группе животные клинически были здоровы. В тоже время изучение их внутренних органов показало, что у 7 из 20 мышей обнаружены разной степени изменения в легких с перибронхиальной воспалительной инфильтрацией, с возникновением очагов серозной пневмонии в ин-терстициальной ткани. У отдельных животных регистрировались признаки травматического повреждения стенки глотки и корня языка с выраженной воспалительной реакцией. Однако при изучении гистологических препаратов внутренних органов от 20 контрольных животных было установлено, что наиболее частой формой обнаруженной патологии было паразитарное поражение кишечника с вовлечением печени, а у 6 мышей в легких были выявлены тяжелые серозные и серозно-гнойные бронхопневмонии.
Пробиотические штаммы E.coli М-17 nB.subtilis 1719 не оказывают токсического действия на органы и ткани лабораторных животных даже при парентеральном введении больших доз, что подтверждает его полную безвредность.
Доклиническое изучение острой и хронической токсичности показало, что даже при введении доз, значительно превышающих человеческие, выбранные штаммы E.coli М-17 и B.subtilis 1719 не вызывали во внутренних органах и центральной нервной системе лабораторных животных изменений, указывающих на наличие токсического действия. Исследования показали, что пробиотический штамм B.subtilis 1719 не токсигенен, не токсичен и не вирулентен.
Антагонистическая активность является одним из важнейших механизмов защитного действия нормофлоры макроорганизма.
Рядом исследователей показано, что антагонистические свойства микробов кишечника, обусловлены продукцией ими веществ антибиотического характера с определенным целенаправленным спектром антибактериального действия: колицины (бактериоцины), ацидофилин, лактоцидин, лактолин, бревин и др.(58, 59, 73,123, 131, 145, 157).
Спектр микробного антагонизма у бактерий кишечной группы имеет особое значение, так как эти микроорганизмы в естественных условиях чаще всего сосуществуют с другими представителями нормофлоры в кишечнике человека.
Поскольку терапевтическая эффективность лечебного действия про-биотиков в значительной степени зависит от антагонистической активности производственных штаммов, её тестирование при контроле качества препаратов- пробиотиков является обязательным. При изучении штаммов E.coli М-17 и B.subtilis 1719 установлено, что они различаются по спектру антагонистических свойств. Штамм B.subtilis 1719 проявляет выраженный антагонизмом в отношении стафилококков, энтерококков, C.albicans, и умеренный антагонизмом в отношении шигелл, Proteus vulgaris, патогенных кишечных палочек (рис.2.1). Штамм E.coli М-17 обладает выраженной антагонистической активностью против патогенных кишечных палочек, шигелл, низкой в отношении стафилококков, в том числе S.aureus, C.albicans, Streptococcus.spp. (рис.1).
Исследование культурально-биохимических свойств микроорганизмов
На следующем этапе представляло интерес исследовать изменения проницаемости кишечной стенки для жизнеспособных микроорганизмов в условиях ЭД.
Барьерная функция, противодействующая проникновению во внутренние органы и кровь антигенов, эндотоксинов и жизнеспособных бактерий, содержащихся в просвете кишки является одной из важнейших функций стенки желудочно-кишечного тракта является.
В свете современных представлений процесс поступления эндогенных бактерий и/или их фрагментов с поверхности слизистых во внутреннюю среду организма происходит значительно чаще, чем предполагалось ранее. Накоплены многочисленные факты о проницаемости слизистых для микроорганизмов, постоянной миграции бактерий в кровь в составе макрофагов, о непосредственном попадании бактерий во внутреннюю среду организма при транслокации под действием большого числа факторов и о развитии транзи-торной бактериемии.
Особое значение придается специализированным микроскладчатым М-клеткам и энтероцитам, ассоциированным с лимфоидными фолликулами (FAE-клетки), которые представляют собой своего рода «ворота» для транслокации бактерий (в том числе патогенных), адгезии и транспорта растворимых и корпускулярных антигенов с помощью фаго-, пино-, или рецептор-опосредованного эндоцитоза.
При определённых состояниях организма (травма, стресс, шок, нарушения гемодинамики, эндотоксемия и др.), степень транслокации может значительно повышаться, вплоть до появления системной бактериемии и эндо-токсинемии, приводящих к дисфункции внутренних органов, сепсису.
Состав микрофлоры кишечника также влияет на степень бактериальной транслокации. Наиболее активно транслокации подвергаются представители нормальной микрофлоры, то есть бактерии-сапрофиты. Микрофлора биоценозов влияет на состояние иммунореактивности, регулируя адекватность ответа на инфекцию.
В литературе обсуждается концепция "поп bacterial clinical sepsis", когда бактерии вследствие бактериальной транслокации циркулируют между кишечником и печенью, не достигая свободного кровотока (гемокультура отрицательная), но поддерживают пролонгированную активацию воспалительного каскада на уровне макрофагов, цитокинов, иных медиаторов. Таким образом, бактериальная транслокация играет физиологическую роль, выполняя функцию антигенного стимулятора иммунной системы (73).
Для изучения транслокации бактерий в асептических условиях у подопытных животных брали образцы печени, селезенки, легких, почек, тимуса, а также периферической крови. Гомогенизированную суспензию полученных образов высевали на диагностические среды для обнаружения жизнеспособных микроорганизмов и оценки их количества (рис.3.3).
Органно-тканевая транслокация лактозонегативной кишечной флоры у мышей с экспериментальным дисбактериозом, lg КОЕ/г В высевах от мышей с ЭД наблюдался рост лактозоотрицательной флоры (преимущественно lac- E.coli). Наибольшее количество бактерий выявлено в легочной ткани (104 КОЕ/г), посевы из почек мышей содержали 102 КОЕ/г, образцы тимуса и печеночной ткани по 10і КОЕ/г; в крови и селезенке микробов не обнаружено. Для контроля делали высевы тех же органов от здоровых животных, при этом транслокации жизнеспособных бактерий не выявлено.
Бактериальная транслокация лактозонегативной кишечной палочки происходила на фоне достоверного повышения доли последней в просветной и особенно в пристеночной микрофлоре кишечника подопытных животных. Наиболее вероятными органами-мишенями для развития септических осложнений при дисбиозе, следует признать легкие и почки.
Полученные экспериментальные данные свидетельствуют об увеличении проницаемости стенки желудочно-кишечного тракта для сапрофитных и условно патогенных микроорганизмов при ЭД кишечника, на фоне повышения адгезивной способности кишечного эпителия, что может свидетельствовать о снижении резистентности макроорганизма.
Наблюдаемая бактериальная транслокация лактозонегативной кишечной палочки происходила на фоне достоверного повышения процентного содержания последней в просветной и, особенно, пристеночной микрофлоре кишечника подопытных животных.
Поступление во внутреннюю среду организма микробных антигенов при ЭД вероятно, обуславливает изменение активности факторов неспецифического иммунитета, направленных на поддержание гомеостаза и элиминацию последних.
Реализация барьерной функции кишечной стенке по отношению к антигенам микроорганизмов и пищи неразрывно связана с функционированием иммунной системы кишечника, в которую входят фагоцитирующие клетки и лимфоидные структуры (GULT).
Поступающие через кишечную стенку антигены взаимодействуют с рецепторами (Toll-like рецепторы, иные паттерн-распознающие структуры) макрофагов и лимфоидных клеток, что приводит к изменению их функционального состояния и формированию ответа, направленного на поддержание гомеостаза. Центральным элементом иммунной системы являются фагоцитирующие клетки, реализующие функцию защиты от бактериальной инвазии за счет прямого воздействия (распознавание, поглощение и переваривание), а также через антигенпрезентацию и продукцию биологически активных веществ (36, 56).
Известно, что бактерии - представители нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта при парентеральном введении повышают функциональную активность фагоцитов лабораторных животных.
Учитывая, что легкие являются основным органом-мишенью для бактериальной транслокации при ЭД, исследовано функциональное состояние альвеолярных макрофагов мышей при пероральном введении штаммов E.coli М-17 и B.subtilis 1719 и их комбинации вариант II у здоровых животных (табл. 3.5) и мышей с ЭД (табл 3.6).
Пероральное введение пробиотических штаммов у здоровых животных оказывало стимулирующее действие на функциональную активность макрофагов, усиливая поглотительную и переваривающую способность клеток. При ЭД без коррекции отмечалось значительное снижение переваривающей способности альвеолярных макрофагов (ИПС) при сохранной поглотительной функции (ФЧ). Это может быть расценено как незавершенный фагоцитоз.
Изучение антагонистических свойств
Маркером нарушения КР у животных, получавших доксициклин, помимо изменений в составе фекальной микрофлоры, служит транслокация кишечной флоры во внутренние органы. На следующем этапе представляло интерес исследовать изменения проницаемости кишечной стенки для жизнеспособных микроорганизмов в условиях ЭД. Для изучения транслокации бактерий в асептических условиях у подопытных животных брали образцы печени, селезенки, легких, почек, тимуса, а также периферической крови. Гомогенизированную суспензию полученных образцов высевали на диагностические среды для обнаружения жизнеспособных микроорганизмов и оценки их количества.
В высевах от мышей с ЭД наблюдался рост лактозоотрицательной флоры (преимущественно lac" E.coli). Наибольшее количество бактерий выявлено в легочной ткани (104 КОЕ/г), посевы из почек мышей содержали 102 КОЕ/г, образцы тимуса и печеночной ткани по 101 КОЕ/г; в крови и селезенке микробов не обнаружено. Для контроля делали высевы тех же органов от здоровых животных, при этом транслокации жизнеспособных бактерий не выявлено.
Бактериальная транслокация лактозонегативной кишечной палочки происходила на фоне достоверного повышения доли последней в просветной и, особенно, в пристеночной микрофлоре кишечника подопытных животных. Наиболее вероятными органами-мишенями для развития септических осложнений при дисбиозе, следует признать легкие и почки.
Полученные экспериментальные данные подтверждают факт увеличения проницаемости стенки желудочно-кишечного тракта для сапрофитных и условно патогенных микроорганизмов при ЭД кишечника, на фоне повыше 76 ния адгезивной способности кишечного эпителия, что может свидетельствовать о снижении резистентности макроорганизма.
Поступление во внутреннюю среду организма микробных антигенов при ЭД не могло не изменить активность факторов неспецифического иммунитета, направленных на поддержание гомеостаза и элиминацию последних.
Изучена взаимосвязь между состоянием биотопа кишечника и функциональным состоянием фагоцитов, цитокинового профиля у здоровых животных при введении штаммов B.subtilis 1719, E.coli М-17, композиции вариант II, а также при ЭД и его коррекции.
Известно, что бактерии - представители нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта при парентеральном введении повышают функциональную активность фагоцитов лабораторных животных (64).
Учитывая, что легкие являются основным органом-мишенью для бактериальной транслокации при ЭД, исследовано функциональное состояние альвеолярных макрофагов мышей при пероральном введении штаммов E.coli М-17 и B.subtilis 1719 и их комбинации вариант II у мышей с ЭД и здоровых животных.
Пероральное введение пробиотических штаммов у здоровых животных оказывало стимулирующее действие на функциональную активность макрофагов, усиливая поглотительную и переваривающую способность клеток. При ЭД без коррекции отмечалось значительное снижение переваривающей способности альвеолярных макрофагов (ИПС) при сохранной поглотительной функции (ФЧ). Это может быть расценено как незавершенный фагоцитоз (36, 70).
Помимо макрофагальных клеток, исследовали состояние нейтрофилов периферической крови, а именно, их окислительно-восстановительную способность к NADPH-зависимой продукции активных форм кислорода в НСТ-тесте у здоровых животных, у мышей с ЭД, а также его коррекции.
Установлено достоверное повышение активности нейтрофилов при ЭД относительно интактных животных (на 30%). Уровень цитохимической ак 77 тивности нейтрофилов у здоровых животных и мышей с ЭД получавших перо рально B.subtilis 1719, а также композицию вариант П, достоверно не различался с таковым у животных, не получавших препараты.
Применение штамма Е. coli М-17 в дозе 1,0x109 ОЕ/мл достоверно снижало способность к «кислородному взрыву» нейтрофилов здоровых животных и животных с ЭД
С целью определения роли регуляторных медиаторов в реализации неспецифического ответа макроорганизма, исследовали цитокиновые события, происходящие при введении пробиотических культур, а также при ЭД и его коррекции.
На первом этапе изучали цитокиновый профиль (TNF-a, IL-lp, IL-6, IL-4, IL-12, IFN-y, IL-10, IL-2) в течение первых суток после введения пробиотических штаммов E.coli М-17, B.subtilis 1719 и композиции вариант II здоровым животным.
Исследование цитокинового профиля в течение первых суток после пе-рорального введения здоровым животным изучаемых пробиотических штаммов показало, что значимые цитокиновые события развивались не ранее 6 часов после введения культур. Установлена способность штамма B.subtilis 1719 индуцировать экспрессию про- и противовоспалительных цитокинов, что свидетельствовало о его иммуностимулирующих и иммуномодулирую-щих свойствах.
Изучение экспрессии цитокинов при ЭД и его коррекции осуществляли на примере провоспалительного фактора некроза опухоли (TNF-a) и противовоспалительного интерлейкина IL-10. Фактор некроза опухоли TNF-a является ключевым провоспалительным медиатором системного действия и более чем трехкратное повышение его содержания при ЭД относительно ин-тактных животных (83,1+9,1 pg/ml и 23,5+3,2 pg/ml соответственно) может быть расценено как системная воспалительная реакция в ответ на микроэкологические нарушения в биотопах желудочно-кишечного тракта (3, 14, 56, 68, 70).
![Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов Salmonella Enteritidis, экспрессирующих НВс-антиген вируса В с эукариотического и прокариотического промоторов [Электронный ресурс]](/i/i/4503/199818.png "Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов Salmonella Enteritidis, экспрессирующих НВс-антиген вируса В с эукариотического и прокариотического промоторов [Электронный ресурс] Донин Михаил Васильевич")
