Содержание к диссертации
Введение
1.0 Обзор литературы 10-29
1.1. Этиологическая роль штаммов Escherichia coli при инфекционных осложнениях у онкологических больных 10-13
1.2. Факторы патогенности бактерий Escherichia coli 14-28
2.0 Материалы и методы 29-40
3.0 Собственные иссследования 41-81
3.1.Частота встречаемости штаммов Е.соИ у онкологических больных с инфекционными ослооюнениями 41-44
3.2. Серологический пейзаж: штаммов Е.соИ, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями 44-45
4.0 Факторы патогенности штаммов Е.соИ, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями 45-52
4.1. Адгезивные свойства 45-47
4.2. а-гемолитическая активность 47-49
4.3. Тиол-зависимая гемолитическая активность 49-50
4.4. Лецитиназная активность 50-52
5.0 Персистирующие свойства штаммов Е.соИ, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями 52-56
5.1. Антилизоцимная активность 52-53
5.2. «Антиинтерфероновая» активность 53-54
5.3. Антикомплементарная активность 55-56
6.0 Тестирование факторов вирулентности штаммов Е.соИ, выделенных от онкологических и неонкологических больных с инфекционными осложнениями на различных биологических моделях 56-66
6. 1. Легочная модель 57-58
6.2. Отек лапки мышей 58-59
6.3. Лигированная петля тонкого кишечника кролика ... 59-61
6.4. Кожно-некротическая проба 61-65
6.5. Протистоцидный тест 65-66
7.1. Устойчивость штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями к антибак териальным препаратам 66-70
7.2. Фагочувствителъностъ штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями 70-72
8.0 Генетические детерминанты некоторых факторов патоген ности штаммов E.coli, выделенных от онкологических боль ных с инфекционными осложнениями 72-82
Заключение 82
Выводы
Практическая значимость 104
Список литературы
- Факторы патогенности бактерий Escherichia coli
- Серологический пейзаж: штаммов Е.соИ, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями
- «Антиинтерфероновая» активность
- Лигированная петля тонкого кишечника кролика
Введение к работе
Актуальность проблемы
Одной из актуальных проблем современной онкологии является разработка эффективных методов профилактики и лечения инфекционных осложнений [Дмитриева Н В и соавт 2001, Волкова 3 В , 2005, Boogaerts М А , 1995], поскольку это связано повышением риска присоединения инфекциоино-воспалительных осложнении бактериальной природы у онкологических больных В основе механизмов развития инфекционных осложнений, по мнению многих исследователей, лежит угнетение иммунной системы, повреждение естественных защитных барьеров организма, наличие обструктивных изменении, интоксикация и обширные оперативные вмешаїельства, часто сопровождаемые массивной кровопотерей [Смолянская A3, 1986, Іупицьт НН, 1999, Дмитриева НВ и соавт 2001, Митрохин С Д , 2003, Волкова 3 В , 2005]
В спектре осложнений, наблюдаемых у онкологических больных, бактериальные инфекции встречаются примерно в 50% случаев и часто носят хронический рецидивирующий характер и являются причиной ранней гибели больных [Беляков В Д , 1989, Orskov 1, 1995, Hilah F , 2000]
В последние годы произошли значительные изменения в спектре возбудителей, вызывающих инфекционные осложнения у онкологических больных По данным лигераіурьі известно, что в 60-70-х годах прошлого стотетия возникновение инфекционных осложнений у онкологических больных было обусловлено грамположительными бактериями, в частности стафилококками и стрептококками, а в настоящее рремя преобладаю! условно-патогенные ірамотрицательньїе лггеробактерии (кишечные палочки, еннеиюипые палочки, протеи, цитробактсры эшеробактеры, серрации, клебеие ьчы) [Смочярская А 3 , 1986, Дмитриева Н В , 2001, Ахдіова РК, 2003, Кассичь НВ, 2006] Особый интерес в изучении причин инфекционных осложнений у онкологических больных заслуживает Escherichia coll, которая, будучи кишечным комменсалом, является частой причиной инфекций кишечного тракта, мочевыделительной и дыхательной систем, ЛОР-органов, кожи и мягких тканей [Бетобородов В Ь , 2000, Бондаренко В М , 2003, Яковлев С В , 2004, Johnson J , 2003]
По мнению многих исследователей Е сок, выделенные при инфекционных процессах у онкологических больных несут комплекс генетически
детерминированных кластеров (pap, hly, 1th, stx, eae, ehxA, astA, eaf plasmid, bfp), локализованных в структурных элементах хромосомной природы и в конъюгативных плазмидах, и являются этиологически значимыми [Мавзютов АР, 2001, David G, 1998, Suh J-K, 1998, Yvonne ML, 2004] В связи с этим, возрастает интерес к изучению этиологической роли условно-патогенных энтеробактерий, в частности Е coli, при инфекционных осложнениях у онкологических больных
Чувствительность к развитию инфекционного процесса связана не только с изменением иммунної о статуса орі аннзма, но и с изменением биологических свойств бактериальной флоры [Воробьев АА, 2003, Ахатова РК, 2003] Поэтому для эффективного лечения больных с осложнениями бактериальной природы помимо поиска новых эффективных антибактериальных препаратов возникает необходимость одновременного выяснения биологических свойств выдетенпых бактерий, коюрые позвотяют в каждом конкретном случае определить этиологическую причинность возбудителя в инфекционно-ассоциированных процессах [Булгаков АК, 2001, Mellata М , 2003] Особенно большое внимание заслуживают клоны микроорганизмов с множественной лекарственной резистентностью, которые одновременно могут обладать комплексом факторов патогенности Расхождения результатов в изучении генетических детерминант и феногипических, признаков у Е сок, требуют более детального рассмотрения этих аспектов в исследовании этиологической значимости возбудителей инфекционных осложнений у онкологических больных
Исходя из выше из гаженного, возникает насгояіельная необходимость проведения комплексных исследований, направленных на профилактику и лечение инфекционных осчожнений у онкотогических ботьных, на основе изучения некоторых биологических свойств условно-патогенных энгеробактерий, в частности Е coli
Цель исследования
Провести изучение некоторых биопогических свойств бактерий Е colt, выде іенньїх у онкологических больных при инфекционных осложнениях
Задачи исследования 1 Изучить частоту встречаемости штаммов Е coli при инфекционных осложнениях у онкологических и неонколої ических больных
Дать сравнительную характеристику некоторых биологических свойств штаммов Е coli, выделенных от онкологических и неонкологических больных с инфекционными осложнениями
Определить спектр лекарственной устойчивости выделенных штаммов Е сок и провести поиск перспективных антибактериальных биологических препаратов, на примере поливалентных фагов
Изучить природу генетических детерминант, контро чирующих адгезивную, іемоїитичсскую, LT-энтерогоксигенную акгивносги Е coli, выдетенных от онкологических и неонкологических больных с инфекционными осложнениями различной локализации
Научная новизна
Изучение микробного пейзажа, выделенных микроорганизмов, показало превалирование этнологически значимых штаммов Е coli у онкологических больных при инфекционных осложнениях
Клинические штаммы бакіерий Е сок, выделенные от онкологических ботьных с инфекционными осложнениями обладают, широким спектром лекарственной устойчивости
Штаммы бактерий Ecoh, выделенные от онкологических больных при инфекционных осложнениях, чаще обладали персистирующими (АЛА, АИА, АКА), адгезивной, ЬГ - энтеротоксигенной, а-, тиот - зависимой гемолитической, тецитиназной активностями, что доказывает их этиологическую значимость
Гены адгезивности (рарС), ЛТ--штеротоксигенной (IthB), а-гемолитической активностец (ЫуА) у Е coli вчодят в состав «островов патогенности» и локализованы на хромосомах и плазмидах Детекция і снов вирулентности показала превалирование час гош их встречаемо;, у штаммов Е coli, выделенных от онкологических бо іьньїх при инфекционных осложнениях, чем у неонкологических больных
Штаммы Escherichia сок №280 и Escherichia coli №281, выделенные от онкологических больных с инфекционными осложнениями в ассоциации с Serratia marcescens и Staphylococcus aureus обладающие комплексом факторов патогенности, были депонированы в ФІ УН ГНИИСК им Л A TapaceRiwa (справки №01 - 07/472 о і 13 12 2005і и №01 - 07/473 or 13 12 2005i ) и запатентованы в ФІ У ФИПС (патенты №2293764 и №2293765 от 26 01 2006)
6 Практическая и теоретическая значимость
Отработаны оптимальные подходы выяснения этиологической значимости бактерий Е сок, выделенных от онкологических больных при инфекционных осложнениях, когорые внедрены в работу бактериологической лаборатории Республиканского онкологического диспансера Опредеіение генетических маркеров вирулентности у бактерий, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями, позволяют дифференцировать патовары среди условно-пагогенной флоры и решить вопрос необходимости назначения эффективной антибактериальной терапии В качестве антиэшерихиозпою нрегіарага рекомендован «Поливалентный пиобагпериофаг жидкий» произволеіва ФГУП НПО «Микроген «Иммунопрепарат» г Уфа Депонированные в ФГУН ГНИИСК имени Л Л Тарасевича штаммы Ecoli могут быть испотьзованы в качестве эталонных культур и суперпродуценгов термолабильною ЛТ - энтсротоксина при получении биологических препаратов (сывороток и анатоксинов)
Положения, выносимые на защиту.
Штаммы бактерий Е coll чаще встречаются у онкологических больных при инфекционных осложнениях, чем у неонкологических больных, и обладают более выраженной адгезивной, античизоцимнои, антиинтерфероновой, антикомішеменіарной, ЛТ - энтеротоксигенной, а-, тиол-зависимой гемолитической, прогииоцидной активностями и вирулентностью
У штаммов Еcoh генетическими детерминантами вирулентности являются структурные этементы хромосомной природы, а ЛТ - энтеротокешенности -конъюгативпая тазмида массой 60 МДа
«Поливалентный пнобактериофаг очищенный жидкий», выпускаемый ФГУП «НПО «Микроген» филиал «Иммунопрепарат» г Уфа является перспективным антиэтерихиозным биологическим препаратом
Апробация работы
Диссертация обсуждена на совместном заседании кафедр микробиологии, вирусологии и иммунологии БГМУ, общей гигиены, биочогии и медицинской генетики, инфекционных болезней с курсом эпидемиологии, ЦПИЛ БГМУ, ведущих научных сотрудников ФГУП НПО «Микроген» филиал «Иммунопрепарат», научных
сотрудников лаборатории мопекулярной биологии и биотехнологии Института биохимии и генетики УНЦ РАН к правления Башкирского отделения Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Уфа (2007) Материалы диссертации доложены на Всероссийской научной конференции с международным участием «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке разработка производство и применение», посвященная 100-летию «Иммунопрепарат», г Уфа (2005), на 70-й юбилейной итоговой Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины» Уфа (2005), на VI Общероссийской научной конференции с международным учасіисм «Успехи современною естествознания», «Дагомыс» г Сочи (2005), на X межд> народной научной конференции «Здоровье семьи-ХХ1 век», Бангкок-Паїтайя, Таиланд (2006), на 4-й ежегодной конференции «Инфекции и сопроводительная терапия в онкологии» Москва (2006)
Внедрение результатов в практику
Материалы исследований, освещающие биологические свойства штаммов Еcoll и генетический контроль факторов патої енноети, внедрены в практические и лекционные курсы на кафедре микробиотогии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО «БГМУ» Росздрава и в работу бактериологической лаборатории Республиканской клинической больницы им Г Г Куватова
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ
Объем и структура диссертации
Факторы патогенности бактерий Escherichia coli
История изучения энтеробактерий насчитывает уже 195 лет (со времени выделения Serratia marcescens Бартоломео Бизио с кукурузной каши-поленты). Основанием для выделения семейства Enterobacteriaceae послужили фундаментальные исследования Коха, Пастера, Ру, Мечникова и других, открывших "золотую эру" бактериологии [62].
Основной представитель рода Escherichia - E.coli был впервые обнаружен в 1885 г. Т. Эшерихом, в честь которого этот род бактерий и получил свое название. Согласно IX определителю Берги род Escherichia входит в семейство Enterobacteriaceae и включает 5 видов: Escherichia coli, Escherichia fergusonii, Escherichia hermanni, Escherichia vulneris и Escherichia blattae [62,71].
E.coli является одним из изученных видов не только для этого рода, но и всего семейства Enterobacteriaceae. Интерес к этим бактериям обусловлен их важным значением как в нормальной жизнедеятельности макроорганизма, так и ролью в развитии ряда инфекционно-воспалительных заболеваний у человека [43,181,194].
E.coli относится к убиквитарным микроорганизмам. Признанными естественными хозяевами являются человек и теплокровные животные (домашние и дикие млекопитающие, птицы). В то же время не исключается возможность длительного существования эшерихий в почвенных и водных экосистемах, где они вступают в различные экосимбиотические отношения с представителями соответствующих биоценозов (рыбы, беспозвоночные и прочие) [43,71,155]. Прежде всего, убиквитарность E.coli обусловлена их по-лигостальностью - наличием у данных бактерий большого количества естественных хозяев из разных таксономических групп, что не позволяет считать E.coli абсолютно антропофитным, то есть предпочитающим для своего обитания только организм человека [32,43,172]. Эшерихии - облигатные представители микрофлоры человека. Типичным биотопом для этих бактерий является толстый кишечник и илеоцекаль-ная область подвздошной кишки, где они пребывают в постоянном взаимодействии с другими индигенными микроорганизмами, формируя в их совокупности динамическую систему — микробиоценоз кишечника [74,191]. Эндогенная флора - это тщательно сбалансированный симбиоз для каждого индивидуума, и, тем не менее, 80% инфекций у онкологических больных вызваны именно эндогенной флорой, половина из которой являются внегоспи-тальными [34,56, 97] .
Этиологическая роль кишечной палочки в инициации ряда инфекцион-но - воспалительных заболеваний у человека доказана многими учеными [101,139,221]. Появление Е.соїі в иных органах (вышележащие отделы кишечного тракта, кровь, мочеполовая и дыхательная системы) расценивается как признак кишечного дисбактериоза или симптом внекишечных эшерихио-зов [19,28,43,149].
Особенно важно то, что развитие экстраинтестинальных воспалительных процессов обусловлено не только патогенными свойствами эшерихии, но и наличием ряда факторов способствующих развитию инфекционного процесса [39,40,48].
Онкологические больные являются группой риска в отношении развития инфекционных осложнений. Существуют множество механизмов защиты организма против инфекции. Их развитие - это результат длительного эволюционного пути. Они представляют собой мощный барьер, препятствующий проникновению патогенов внутрь организма, размножению их и, как следствие, развитию заболевания. Степень необычного повышения чувствительности больного к окружающей его микрофлоре зависит от того, какой из механизмов его иммунной защиты поврежден, насколько тяжелы имеющиеся расстройства и как они взаимодействуют между собой [34,152]. Риск развития внекишечного эшерихиоза у онкологических больных на порядок выше в связи с наличием ряда причин: опухолевой интоксикации, истощения, ане 12 мий, длительностью оперативных вмешательств, обширной кровопотерей в ходе операций, а также предшествующей химио- и лучевой терапии [48,51,52,151].
Инфекции являются основной причиной смертности онкологических больных, особенно в состоянии гранулоцитопении после курсов цитостати-ческой терапии [48,139.148]. В зависимости от локализации инфекционные осложнения развиваются у 12-50% онкологических больных, а при лейкозах этот показатель приближается к 75% [47,122,129].
По данным исследователей в 70-80-ые гг. прошлого столетия причиной возникновения инфекций у онкологических больных явились грамположи-тельные бактерии: стафилококки, стрептококки и энтерококки, а в конце столетия причиной более 65% инфекций в онкологии служили грамотрицатель-ные бактерии, среди которых преобладали E.coli, различные виды клебсиелл, энтеробактеров и псевдомонад [6,48,224].
По данным Дмитриевой Н.В. и соавт. [50] спектр инфекционных осложнений у онкологических больных включает: пневмонии (39%), глубокие и поверхностные раневые инфекции (31%), мочевые инфекции (8%), лихорадку неясного генеза (в том числе фебрильную нейтропению) (6% ), сепсис (4%) и прочие. Зачастую определить причину инфекционного осложнения невозможно, однако некоторые авторы считают, что наиболее частыми возбудителями являются: E.coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus spp., Candida albicans, Aspergillus species. [6,51].
Серологический пейзаж: штаммов Е.соИ, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями
Определение токсигенности культур проводили на изолированной петле тонкого кишечника кролика [29]. Кроликам /1.5-2.0 кг/, предварительно голодавшим в течение суток, под барбитуровым наркозом /тиопентал натрия 10 мг/кг веса/, послойно вскрывали брюшную полость. На тонкой кишке кролика готовили 5 изолированных участков длиной 12 см с такими же ин-тактными участками, не считая дистального и проксимального отделов, которые не были использованы в исследованиях. После введения в изолированные петли по 1 мл испытуемых и контрольных проб, брюшную полость зашивали послойно. Через 16-18 часов животных умерщвляли воздушной эмболией, вскрывали брюшную полость и рассчитывали индекс дилятации отношением объема экссудата к длине изолированной петли /замеряли длину лигированного отрезка и объема жидкости/. Положительной считали кишеч 36 ную реакцию / V/L / при коэффициенте 1,0 и более. Результаты фотографировали цифровой фотокамерой «Olympus» С-760.
Тест "отека лап" для определения LT- энтеротоксина проводили по методу Ю.П. Вартанян с соавт. [29]. Для этого в подушечку левой лапы мыши вводили центрифугат 20-ти часовой бульонной культуры Е.соїі в объеме 0.05 мл. Через 24 часа мышей умерщвляли эфиром и ампутировали задние лапки на уровне голеностопного сустава и взвешивали на торсионных весах. По разнице масс опытной и контрольной лап определяли показатель отека лап. За положительный результат считали показатель равный 65 мг и более. В качестве контроля использовали стерильный бульон Хоттингера и гретый при 56С и 85С центрифугат бульонной культуры Е.соїі.
Кожно-некротическую пробу проводили путем внутрикожного введения 0,250 мл 2-х миллиардной суточной агаровой культуры Е.соїі. Результат учитывали через 3, 12, 24 часа и на 3, 7, 10, 14, 21 день после введения.
Методические приемы, использованные для молекулярно- биологических исследований факторов вирулентности 2.4.1. Выделение плазмидной ДНК проводили по методу Kado СТ., Liu S.T. /1981/ [166]. В 6 мл мясопептонного бульона в течение ночи выращивали культуру Е.соїі при 28-30С, осаждали центрифугированием в рефрижераторе при 7-8 тыс. об/мин. в течение 20 минут. Осадок суспендировали в пробирке Eppendorf содержащий 40 мкл буфера «ТАЕ» /Трис-7,2г, ЭДТА-1,1г, ледяная уксусная кислота-2мл, вода дистиллированная-1500 мл/ добавляли 200 мкл лизирующей смеси /Трис-ЗООмг, Sds-Зг, Н2О-100мл, рН-12,6/ и прогревали всю смесь в водяной бане при 56 С в течение часа. Затем одновременно добавляли 2 объема смеси фенол хлороформа /рН 7,6/ и 0,2 объема 5М хлористого натрия и энергично встряхивали для получения равномерной суспензии. Смесь охлаждали и центрифугировали при 12 тыс. об/мин. в течение 15 минут при 4С. Верхнюю прозрачную водную фракцию осторожно отбирали автоматической пипеткой в новые пробирки Eppendorf и добавляли 1/10 объема ЗМ ацетата натрия и 2 объема охлажденного 96% этанола, осто 37 рожно перемешивали и ставили в морозильник на несколько часов. Затем в холоде центрифугировали при 12 тыс. об/мин. в течение 15 минут, центрифу-гат осторожно сливали и ставили пробирки на фильтровальную бумагу вверх дном на 10 минут, на осадок добавляли холодный 70% этанол в количестве 500 мкл, вращали пробирки и повторно ставили вверх дном на фильтровальную бумагу. Оставшийся осадок суспендировали в 50 мкл буфера «ТАЕ», где плазмидная ДНК растворялась и была готова к электрофорезу.
Краситель /бромфеноловый голубой-0,07г, Sds-7r, глицерол-ЗЗмл, Н20-60мл/ вносили в пробу в соотношении 1:6 в 0,8% горизонтальный гель /агароза фирмы "Amresco V, электрофорез проводили в трис-ацетатной буферной системе при силе тока 60 мА. По окончании разгонки нуклеиновых кислот гель окрашивали в водном растворе бромистого этидия "Сигма"(Ю мкг/мл) при комнатной температуре в течение 15 мин. Гель промывали в дистиллированной воде. Фотографирование осуществляли цифровой фотокамерой «Olympus» С-760 под оранжевым светофильтром.
В качестве источников реперных плазмид использовали эталонные культуры E.coli Кіг, несущие плазмиды с известной молекулярной массой: рВг 322 /2.8 Md/, R a /96 Md/ o /60 Md/, R27 /112 Md/, S. typhimurium NRe, /плазмиды с м.м. 120; 53; 4,0; 3,2; 1,4 Md/, P.vulgaris Rts -1 /120Md/ Вес плазмид вычисляли в соответствии с рекомендациями Hansen, Olsen (1978) по калибровочной кривой, составленной на ЭВМ "АРМ-ШК". 3.4.2. Выявление конъюгативных плазмид проводили по методической рекомендации, составленной коллективом авторов Мамонтова Т.Н., Белокрысен-ко С.С. с соавт. /утвержденной МЗ СССР в 1983 году / [60].
Исследуемую суточную культуру штамма - донора и штамма - реципиента засевали раздельно в бульон Хоттингера и инкубировали при 37 С в течение 18 часов. Утром ночные культуры донора и реципиента разводили 1:10 теплым бульоном Хоттингера (32 С) и раздельно подращивали в течение 40 минут. Затем готовили конъюгационную смесь, смешивая 4 мл бульона Хоттингера донора (рН 7,2 - 7,4) и 0,5 мл реципиента. Смесь инкубировали в на 38 клонном положении в течение 16-18 часов при 32 С и 42 С. В дальнейшим брали 0,1 мл смеси и засевали на три чашки Петри с селективной средой таким образом, чтобы получить изолированные колонии. В контроле делали посевы отдельно культур донора и реципиента, которые на среде селекции не должны давать роста. Посевы инкубировали при 32 С в течение 24-48 часов. Выросшие колонии трансконъюгатов дважды засевали на свежие среды селекции для очистки от клеток донора и реципиента. У трансконъюгатов проверяли наличие неселективных маркеров, передавшихся одновременно с маркерами, по которым вели первичный отбор. Для проверки неселективных маркеров, трансконъюгаты после очистки засевали короткими штрихами в чашки Петри с агаром и ставили в термостат при 32С на ночь. Выросшие культуры перепечатывали на чашки с различными антибиотиками с помощью репликатора покрытого лоскутом стерильного бархата. Чашки инкубировали в течение ночи при 30-32 С. В контроле делали посевы отдельно культур донора и реципиента, которые на среде селекции не должны давать роста. 2.4.3. Полимеразная цепная реакция.
Бактерии были тестированы методом ПЦР на наличие генов вирулентности: фимбриального антигена РарС, а-гемолизина HlyA, термолабильного эн-теротоксина Lth. Для выполнения работы использовались пары праймеров, подобранные по данным последовательностей «островов» патогенности ДНК Escherichia coli "GenBank" (www.ncbi.nih.gov) и синтезированы в НПФ «Ли-тех» г. Москва (Россия) (таб 1).
Амплификация проводилась при использовании 20 мкл реакционной смеси следующего состава: 50мМ КС1Д0 мМ трис-HCl (рН 8,4), 2,5 мМ MgCl2, 0,1% тритон-Х-100, 0,2 мМ каждого из ёАТФ, оТТФ, (1ТТФ, сЩТФ, 2,0 мкМ/л праймера, 1,5 U Taq ДНК-полимеразы, 5 мкл бактериального лизата. Программы и праймеры для амплификации представлены в таблице 1.
«Антиинтерфероновая» активность
В соответствии с уровнем эволюционного развития условно-патогенных энтеробактерий, к которым относится и E.coli, каждый представитель находится на различных этапах взаимоотношений «хозяин-паразит» и характеризуются различными потенциалами патогенности. Последнее свойство, определяется наличием факторов патогенности, особенно влияющих на сопротивляемость организма. Для преодоления иммунобиологического барьера многие бактерии приспособились продуцировать ряд продуктов жизнедеятельности, которые способствуют их проникновению, выживанию и колонизации в тканях макроорганизма [43,56,92].
По современным воззрениям, адгезивность бактерий рассматривается как один из ведущих факторов патогенности. Большей частью адгезивность обусловлена наличием пилей, которые подразделяются на несколько типов. Поскольку энтероциты и другие эпителиальные клетки обладают общими рецепторами с эритроцитами, применение последних может быть использовано для определения адгезинов у бактериальной клетки. Пили, содержащие адгезины, по отношению к Д-маннозе разделяются на два типа - маннозочув-ствительные (MS) и маннозорезистентные (MR) [36,146].
Исходя из выше изложенного, мы сочли необходимым провести сравнительное изучение адгезивной активности бактерий Е.соИ, выделенных от онкологических и неонкологических больных с инфекционными осложнениями.
Изучение адгезивной активности проводили на предметном стекле по методу З.Г. Габидуллина (автор, св-во №1312098 от 22.01.87) с использованием 3% суспензии эритроцитов цыпленка, содержащей 0,6 % концентрации Д-маннозы и без неё, что позволило выявить наличие у бактерий Е.соИ способность прикрепляться к клеткам макроорганизма.
Были изучены 56 штаммов Е.соИ, выделенных от онкологических и 67 культур, изолированных от неонкологических больных с инфекционными осложнениями. Результаты исследований представлены в таблице 4.
Было выявлено, что из всех культур Е.соИ, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями, 73,2±5,9% обладали способностью давать Д-маннозочувствительную реакцию гемагглютинации (MS), тогда как среди культур Е.соИ, изолированных от неонкологических больных, 46,2±6,1% давали положительную реакцию (р 0,05).
Изучение Д-маннозорезистентной гемагглютинирующей активности (MR) показало, что среди штаммов Е.соИ, выделенных при инфекционных осложнениях от онкологических больных 57,1±6,6% обладали этим свойством, в то время как культуры, изолированные от неонкологических больных лишь в 35,8±5,8% случаях вызывали MR - гемагглютинацию.
Адгезивные свойства бактерий E.coli с эритроцитами цыпленка (р 0,05). Штаммы E.coli, выделенные от онкологических больных Штаммы E.coli, выделенные от неонкологических больных Д - маннозорезистентная реакция гемагглютинации Д - маннозочувсгвительная реакция гемагглютинации Д - маннозорезистентная реакция гемагглютинации Д - маннозочувсгвительная реакция гемагглютинации Абс. М±т, % Абс. М±т, % Абс. М±т, % Абс. М±т, % 32 57,1±б,б 41 73,2±5,9 24 35,8±5,9 31 46,2±6,1 Одновременно нами была проведена оценка адгезивной активности штаммов Е.соїі в опытах на формалинизированных эритроцитах 1(0) группы крови человека, в соответствии с методом, описанным Брилисом В.И. и соавторами [20].
Результаты исследования среднего показателя адгезивности (СПА) показали, что Е.соїі, выделенные от онкологических больных с инфекционными осложнениями у 23 (41,1±6,5%) штаммов проявляли высокий уровень адгезивной активности, 12 (21,4±5,4%) - средний, 6 (10,7±4,1) - низкий и 15 (26,8±5,9%) - не проявляли адгезивную активность, тогда как среди культур, выделенных от неонкологических больных в 10 (14,9±4,2%) случаев проявлялся высокий уровень, 11 (16,5±4,5%) - средний, 10 (14,9±4,2%) - низкий и 36 (53,8±6,1%) - не проявляли адгезивную активность (р 0,05).
Было выявлено, что штаммы, имеющие высокий СПА в реакции ге-магглютинации с эритроцитами цыпленка давали положительную Д-маннозорезистентную реакцию гемагглютинации.
Полученные результаты показывают, что штаммы Е.соїі, выделенные от онкологических больных с инфекционными осложнениями, чаще обладают адгезивной активностью, чем штаммы Е.соїі, изолированные от неонкологических больных.
Исследования последних лет показывают, что к числу таких продуктов относятся бактериальные гемолизины [35,171,203]. Гемолизины относят к факторам патогенности, наличие которых может быть использовано в качестве показателя потенциальной цитотоксичности, выделенных условно-патогенных энтеробактерий. Функционально определяют несколько групп гемолизинов, среди которых у энтеробактерий превалирует а -, и тиолзави-симый гемолизины, а также - энтерогемолизин [55,81,82,109,150].
Лигированная петля тонкого кишечника кролика
На фоне успешного лечения многих онкологических заболеваний в последние годы повсеместно отмечается увеличение удельного веса инфекционных осложнений и особенно возрастание роли последних в смерти больных. Выраженный клинический полиморфизм, связанный со вторичным иммунодефицитом у онкологических больных, определяет большую значимость изучения биологических свойств возбудителей инфекционных осложнений [6,43,46,47,49,161].
Бактериальный сепсис и септический шок являются, безусловно, основной причиной летальности среди онкологических больных. Инфекционные осложнения значительно чаще развиваются у онкологических больных на III-IV стадиях заболевания. Причём, особую роль в этиологической структуре занимают условно-патогенным энтеробактерии, к которым относится и Е.coli [70,80,216,220].
Этиологическая роль кишечной палочки в инициации ряда инфекцион-но - воспалительных заболеваний у человека показана многими исследователями [43,49,155]. Появление Е.соїі в вышележащих отделах желудочно-кишечного тракта, в крови, в мочеполовой и дыхательной системах, расценивается как признак дисбактериоза или симптом внекишечных эшерихиозов [19,28,43,149].
Риск развития внекишечного эшерихиоза у онкологических больных на порядок выше в связи с наличием взаимно сопряженных факторов: опухолевая интоксикация, истощение, анемия, длительностью оперативных вмешательств, обширной кровопотерей в ходе операций, а также предшествующей химио- и лучевой терапии [6,48,49,50,51].
По данным Дмитриевой Н.В. и соавт. [50] спектр инфекционных осложнений у онкологических больных включает: пневмонии (39%), глубокие и поверхностные раневые инфекции (31%), мочевые инфекции (8%), лихорадку неясного генеза (6%), сепсис (4%) и другие. Зачастую определить причину инфекционного осложнения невозможно, однако некоторые авторы считают, что наиболее частыми возбудителями являются: E.coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., Pseudomonas spp., Staphylococcus epidermidis, Enterococcus spp., Candida albicans, Aspergillus spp. [52].
Изучив микробный пейзаж штаммов выделенных от онкологических и неонкологических больных, мы выявили, что E.coli является частой причиной инфекционных осложнений у онкологических больных, чем у неонкологических больных. Так если удельный вес E.coli в инфекционных осложнениях у онкологических-больных составил 33,1±4,7% (56), то у неонкологических больных - 23,8±4,6% (67) (р 0,05).
По мнению некоторых исследователей из множества факторов пато-генности ни один из них не может быть достаточным в проявлении патогенносте микроорганизмов, поскольку они часто могут изменяться независимо друг от друга [36,92]. Нами была изучена частота проявления некоторых биологических свойств УПЭ, на примере клинических штаммов E.coli, выделенных от онкологических и неонкологических больных с инфекционными осложнениями.
Все выделенные штаммы E.coli на поверхности МЛА в течение суток вырастали в виде полупрозрачных колоний с гладкой поверхностью и ровными краями размером около 3-4 мм. На среде Эндо давали рост в виде красно-малиновых колоний с металлическим блеском, при этом лишь два штамма были лактозонегативными и вырастали в виде бледновато-матовых выпуклых колоний с ровными краями. При культивировании штаммов бактерий E.coli в жидкой питательной среде, образовывалось равномерное помутнение, с выпадением слабого осадка в течение 20-24 часов. Бактериоскопия в раздавленной и висячей капле показала, что клетки обладают поступательными и маятникообразными движениями.
При посеве на полужидкий агар, бактерии диффундировали в среду через 12-24 часов при температуре 37 С. На окрашенных по Граму препаратах, бактериальные клетки представляли собой мелкие грамотрицательные палочки. Штаммы бактерий E.coli обладают весьма пестрой антигенной структурой. Для внутривидовой дифференциации штаммов разработаны ряд схем, основанных на изучении О -, К - и Н - антигенов.
Мы провели исследования по изучению поверхностных антигенов путем применения коммерческих поливалентных ОК-сывороток и типовых О-сывороток (НПО «Биомед») в реакции агглютинации на стекле.
При изучении реакции агглютинации с типовыми эшерихиозными О-сыворотками было выявлено, что среди штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями, 12 штаммов относились к серогруппе Об, 8 - к 08, 4 - к 080, 3 - к 025, по 1 - к 0128ас, 085, 0111, ОП9 соответственно, тогда как среди культур E.coli, изолированных от неонкологических больных, 10 штаммов относились к серогруппе 055, 8 -085, 5 - к 025, 4 - 0128ав, 2 - к 08, 2 - 06 и 1 к 027.
Данные этих исследований показывают, что наибольшую эпидемиологическую значимость в развитии инфекционных осложнений у онкологических и неонкологических больных представляют ОКА, ОКБ и ОКЕ серо-группы. При этом штаммы выделенные от онкологических больных преимущественно принадлежали к Об, 08, 080, 025 серогруппам, тогда как штаммы изолированные от неонкологических больных - к 055, 085, 025, 0128ав. Вероятно, штаммы этих серогрупп чаще обладают необходимым комплексом факторов патогенности для развития инфекционного процесса.
Все микроорганизмы обладают способностью прикрепляться к органическим и неорганическим поверхностям [85,131,138]. Учитывая, что у патогенных бактерий первым этапом развития инфекционного процесса является лиганд - рецепторное взаимодействие, обусловленное адгезией микроорганизмов на специфических рецепторах чувствительных клеток макроорганизма, для выявления адгезинов у бактериальных клеток используют реакцию гемагглютинации с эритроцитами различных видов животных и птиц. Исходя из этого, мы сочли необходимым провести сравнительное изучение адгезив-ности E.coli, выделенных от онкологических больных и неонкологических больных. В качестве клеток-мишеней для выявления адгезинов, и выяснения природы структур бактериальной клетки, определяющих у E.coli адгезивную активность, использовали эритроциты цыпленка [36].
