Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Роль пилей первого типа в экологии микроорганизмов 12
1.1.1. Адгезии FimH как представитель класса лектинов 12
1.1.2. Роль пилей первого типа в адаптации микроорганизмов 13
1.1.3. Пили первого типа в историческом аспекте 14
1.2. Современные представления о пилях первого типа Е. coli 16
1.2.1. Морфология и структура пилей первого типа
1.2.2. Структурные компоненты пилей первого типа 17
1.2.3. Генетическая структура //m-кластера. Строение, функция отдельных генов в функционировании кластера
1.2.4. Регуляция экспрессии пилей первого типа 20
1.2.5. Биогенез фимбрии: секреция и процессинг субъединиц, сборка органеллы
1.2.6. Варианты рецепторной специфичности адгезина FimH 23
1.3. Структурно-функциональные свойства пилей первого типа 25
1.3.1. Фенотипическая гетерогенность FimH штаммов Е. coli. Взаимодействие с фибронектином.
1.3.2. Три варианта адгезивного фенотипа FimH. 26
1.3.3. Количественные разновидности в пределах М-фенотипа 28
1.3.4. Количественные различия, возникающие за счет вариабельной способности связываться с одиночными маннозильными остатками
1.4. Роль вариантов FimH в тканевом тропизме 31
1.4.1. Прочность фиксации на Ман-БСА коррелирует с результатами модельных опытов на уроэпителиальных клетках
1.4.2. Варианты FimH и количественные различия в связывании с З
ассиметричными участками мембран уроэпителия in situ
1.4.3. Варианты FimH, отличные по способности Е. соН 33 колонизировать мочевой пузырь мыши in vivo
1.4.4. Мутации FimH, повышающие уровирулентность, 34 препятствуют адгезии к клеткам орофарингеального эпителия
1.5. Варианты FimH и эволюция вирулентности 36
1.5.1. Филогенетический анализ аллелей FimH 36
1.5.2. Патоадаптивные мутации 38
1.5.3. Значение и перспективы дальнейшего изучения адгезина 40 FimH пилей первого типа
Глава 2. Материалы и методы 42
2.1. Штаммы микроорганизмов, плазмиды и конструкции 42 гибридов
2.2. Среды, антибиотики и реактивы, используемые в работе 44
2.2.1. Среды 44
2.2.2. Антибиотики 44
2.2.3. Реактивы 44
2.3. Методы исследования бакгериальной адгезии 45
2.3.1. Исследование агрегации дрожжей 45
2.3.2. Исследование агглютинации эритроцитов 46
2.3.3. Исследование роста (Growth assay, ИР) 46
2.3.4. Обогащение культуры микроорганизмов 48
2.3.5. Радионуклеотидное исследование адгезии 48
2.3.6. Исследование адгезии к клеткам защечного эпителия. Инвертированное исследование адгезии
2.3.7. Исследование адгезии к эритроцитам в условиях непрерывного потока
2.3.8. Исследование адгезии к уроэпителиальным клеткам 53
2.4. Иммунологические методы 54
2.5. Методы работы с ДНК. 55
2.5.1. Выделение плазмидной ДНК 55
2.5.2. Обработка ДНК 55
2.6. Методы введения генетического материала в клетку 57
2.6.1. Классическая (кальциевая) трансформация клеток E.coli ДНК
2.6.2. Электропорация 57
2.7. Метод управляемой молекулярной динамики 60
2.8. Математическая и статистическая обработка данных 61
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение 62
3.1. Сравнительный анализ адгезивных вариантов FimH штаммов кишечной палочки. Выявление нового адгезивного фенотипа пилей первого типа.
3.1.1. Биологическая значимость структурно-функционального анализа адгезина FimH
3.1.2. FimH-FocH гибриды и их связывание с олиго- и мономаннозными рецепторными субстратами
3.1.3. Чувствительность связывания с РНКазойБ и 1М-БСА к ингибированию метил-а-О-маннопиранозидом
3.1.4. Свойства гибридных FimH-FocH адгезинов при взаимодействии с эукариотическими клетками
3.1.5. Определение конфигурации рецептор-связывающего сайта 1 М-специфического адгезина.
3.1.6. Индуцирование 1М фенотипа FimH точечной мутацией 78
3.1.7. Проверка морфологии пилей первого типа и экспрессии FimH мутантным клоном MS260
3.1.8. Новый адгезивный фенотип для понимания роли 83
фенотипической гетерогенности FimH
3.2. Изучение адгезивных свойств пилей первого типа штаммов Escherichia coli в условиях потока
3.2.1. Физиологический смысл рецептор-специфической адгезии бактерий
3.2.2. Реакция агглютинации эритроцитов в статических и динамических условиях
3.2.3. Связывание эритроцитов в камере непрерывного потока в зависимости от приложенной силы потока
3.2.4. Моделирование конформационных изменений структуры FimH, вызванных приложенной силой
3.2.5. Экспериментальное подтверждение корректности управляемого компьютерного моделирования
3.2.6. Функциональное значение адгезии, усиливаемой потоком 103
Заключение 107
Выводы 110
Список литературы
- Пили первого типа в историческом аспекте
- Исследование агрегации дрожжей
- Классическая (кальциевая) трансформация клеток E.coli ДНК
- Изучение адгезивных свойств пилей первого типа штаммов Escherichia coli в условиях потока
Пили первого типа в историческом аспекте
Способность адгезироваться к поверхностям является принципиально важной для выживания бактериальных видов. Действительно, по сравнению с бактериями, которые живут, прикрепившись к органической или неорганической поверхности, часто в составе биофильм-комплекса, очень небольшое число из них может быть найдено в природе в независимо существующей форме за пределами лаборатории [27]. За прошедшие тысячелетия сформировалось много различных типов адгезивных структур, способных осуществлять прикрепление микроорганизмов [30, 63, 72, 111]. Один из наиболее изученных классов адгезивных структур обычно обозначается общим термином фимбрия [34].
Фимбрии представляют собой филаментозные белковые структуры, расположенные на поверхности бактериальной клетки. Первичная функция этих орга-нелл, насколько в настоящее время известно, заключается в обеспечении прикрепления микроорганизмов к несущей поверхности. Фимбрии, которые также называют пилями [14, 15], широко распространены и типичны для членов семейства Enterobacteriaceae. Описано большое количество структурных и функциональных типов пилей [63, 72, 111].
Среди семейства Enterobacteriaceae в зависимости от действия маннозидов на адгезивное взаимодействие выделяют два основных типа фимбрии, чувствительных к D-маннозе (МЧ) и устойчивых к D-маннозе. МЧ-фимбрии называют также обычными или фимбриями первого типа. Маннозо-устойчивая группа включает несколько различных типов фимбрии, таких как Р-фимбрии (специфичные к Galcd-4Gal) [89, 93], S-фимбрии (специфичные к сиаловым кислотам) [106], фимбрии 3-го типа (специфичные к коллагену V типа) [145] и другие.
Поскольку адгезивная функция большинства фимбрии может быть ингиби-рована простыми сахарами, то их относят к лектинам [134].
Лектин-опосредованные биологические взаимодействия обычно происходят через специфическое связывание с комплексом олигосахаридных лигандов [125]. Олигосахарид-специфическое узнавание обеспечивается мультивалентным ме 13 ханизмом лектин-рецепторного взаимодействия как результат присутствия многочисленных субсайтов или подъединиц в структуре лектина [125]. Полагают, что мультивалентное рецепторное связывание обеспечивает высокую афинность и специфичность для взаимодействий клетка-клетка или лиганд-рецептор.
Для одних типов фимбрий пектиновая субъединица представлена очень малым числом копий и расположена только (или преимущественно) на конце полимерной оси.. Для других фимбрий первичная структурная субъединица сама собой же представляет адгезии [29].
Основная задача настоящей работы - изучение структуры и функции одного из лектинов Escherichia coli, FimH субъединицы пилей первого типа. Хотя лек-тин FimH представляет собой лишь минорный компонент фимбриальной суперструктуры, он играет важную роль в инициации биогенеза фимбрий [76] и почти полностью отвечает за связывающую активность [136]. Однако, ввиду расположения фимбриального лектина, минорного компонента пили первого типа, преимущественно на ее кончике, рассмотрение структуры и функции FimH должно вестись в контексте его структурной организации.
Пили первого типа, несущие FimH лектин, экспрессируются на поверхности практически всех Е. coli и большинства других членов семейства Enterobacteriaceae (например, Klebsiella, Enterobacter и Salmonella) [3, 54]. Широкая распространенность пилей первого типа свидетельствует об их чрезвычайной важности для популяции энтеробактерий. Но этот факт представляет больше проблем, чем решений, особенно в эпидемиологических исследованиях роли различных типов фимбрий Е. coli и вызываемых ими заболеваний [64].
Пили первого типа продуцируются большинством всех нормальных и патогенных изолятов. Этот факт долгое время заставлял исследователей считать, что адгезивные органеллы не могут быть решающим фактором в патогенезе заболеваний, ассоциированных с Е. coli. Кроме того, роль пилей первого типа в экологии Є. со// также долго дискутировалась. Раньше доминировало убеждение, что пили первого типа вносят непосредственный вклад в персистенцию кишечной палочки в первичной нише кишечника. Но эта идея была опровергнута исследованиями McCormick и сотрудников в конце 80-х - начале 90-х годов, когда была показана индифферентность пилей первого типа для интестинальной колонизации [100, 101]. Интересно однако, что инкубация Е. соїі в кишечной слизи стимулирует продукцию пилей первого типа in vitro [85].
В то же время исследовательской группой McCormick, а затем Bloch было показано, что неспособность продуцировать пили не отражается негативно на колонизации толстого кишечника, когда введено значительное число бактерий [10, 100]. Однако, когда небольшое число Е. соїі инокулировано в орофарингеальную полость, отсутствие фимбриальной экспрессии оказывает негативный эффект на переходную колонизацию орофарингеальной полости. Очевидно, это необходимо бактериям для успешного преодоления сложного желудочного барьера. Возможно, что повышение плотности популяции соїі до существенного уровня индуцирует экспрессию необходимых генов или краткосрочное непрерывное поступление бактерий увеличивает вероятность их прохождения через желудочный барьер. Однако в этом непрямолинейном, но принципиальном пути, пили играют важную роль в приобретении доступа к первичной нише кишечника [10, 50].
Многочисленные исследования за последние 20 лет показывают, что пили первого типа, действительно, важны в развитии инфекции мочевыводящих путей (ИМП), в частности, цистита, несмотря на то, что эта роль часто подвергалась сомнению. Несколько недавних публикаций гораздо более ясно доказывают, что пили первого типа в самом деле необходимы для колонизации мочевого пузыря [26, 86, 137].
Точный механизм, посредством которого пили первого типа служат важным адгезивным фактором в принципиально различных нишах - орофарингеальной полости и мочевом пузыре, оставался загадкой до недавнего времени [136, 137, 138, 139, 140].
Пили первого типа названы так потому, что были описаны первыми среди фимбриальных структур бактериальных клеток. Также им был присвоен номер один, поскольку это наиболее распространенный тип фимбрий среди Е. соїі и большинства других членов семейства Enterobacteriaceae. Способность кишечной палочки агглютинировать эритроциты Guyot описал еще в начале века [52], а в 1940-х годах - Rosenthal наблюдал способность Е. coli агглютинировать и другие типы клеток [127]. Интересно, что Rosenthal сравнивал агглютинирующую активность . coli с таковой фитоагглютининов и нашел между ними сходство, хотя в то время лектиновая природа фитоагглютининов еще не была достоверно установлена.
Появление электронного микроскопа позволило впервые реально взглянуть на бактериальные поверхностные структуры, которые могли быть вовлечены в реакцию агглютинации эритроцитов. Одно из наиболее ранних изображений фим-брии появилось среди результатов электронно-микроскопического изучения пи-лиирования, выполненных Houwink и van Iterson в 1949 году [59]. "Новые" орга-неллы упоминались только в приложении к статье. Доказательством превосходных наблюдательских способностей исследователей того времени служит то, что даже в том небольшом комментарии авторы рассуждали правильно, идентифицируя тонкие прямые филаменты, исходящие от поверхности Е. coli, как органеллы прикрепления. Разумно полагать, что филаментами, показанными в тех исследованиях, были пили первого типа, поскольку изображения передают их принципиальное структурное сходство, а также по причине широкой распространенности этих пилей среди coli.
Исследование агрегации дрожжей
Все внутренние узлы филогенетической сетки представлены субъединицами FimH с относительно низкой мономаннозосвязывающей способностью (соотношение М1/МЗ составляет от 0.08 до 0.15), в то время как узлы, расположенные дистально, заняты преимущественно аллелями с отличным МН фенотипом (соотношение М1/МЗ - от 0.17 до 0.93). Аллели МН происходят от ML аллелей, путем приобретения различных несинонимических мутаций; они не формируют новой генетической линии, указывая, что мутации являются случайными. Положение МН аллелей на внешних узлах и высокое сходство нуклеотидных последовательностей показывает, что эти варианты являются производными от ML аллелей. Вероятно, что аллели МН элиминируются из популяции периодически, по причине их большей чувствительности к действию ингибиторов, и, соответственно, меньшей эффективности распространения среди носителей.
Однако, поскольку небольшое число МН изолятов обнаруживается среди нормальной кишечной флоры, то, очевидно, они устраняются из популяции не сразу, хотя оценить период полужизни мутантов (т.е., годы, десятки, сотни лет и т.д.) пока не представляется возможным. Механизмы, посредством которых штаммы минимизируют вредные воздействия, не ясны. Эти штаммы могут передаваться от одного хозяина к другому либо в обход орофарингеальной области, что предстоит еще выяснить, либо преодолевают барьер, приобретая определенные компенсаторные механизмы. Эти компенсаторные механизмы могут вовлекать гены других адгезиков, таких как Р, S или Dr, или более крупные генетические элементы, например, островки патогенности [53].
В настоящее время доминирует теория эволюции бактериальных патогенов, смысл которой состоит в том, что эволюционная адаптация микроорганизмов к патологической нише обитания осуществляется благодаря приобретению патогенами факторов вирулентности, которыми комменсалопаразитические штаммы не обладают [28, 40, 129]. В частности, сейчас обсуждается концепция, согласно которой вирулентность прогрессирует путем горизонтального переноса крупных участков ДНК. Эта идея стала настолько популярной, что в значительной степени вытеснила теорию вероятности развития патогенов из непатогенных комменсало-паразитических штаммов путем модификации существующих генов посредством селективного отбора среди мутантов, возникших случайным образом.
Поскольку ясно, что генный перенос островов патогенности играет роль в эволюции патогенов, был предложен термин "патоадаптивная" мутация [137]. Этот термин указывает на связь с "устаревшей" идей, что патогены могут возникать путем адаптивных мутаций генов комменсальных штаммов.
К настоящему моменту адаптивные мутации fimH гена представляют наиболее показательный пример патоадаптивных мутаций, выявленных до сих пор. Выше были приведены доказательства что, эти мутации способствуют персистен-ции Е. соїі в мочевыводящем тракте, но, вероятно, снижают при этом эффективность пероральной передачи.
На самом деле, общепризнанной считается теория, что мутации, затрагивающие специфичность определенной функции, оптимизированной за миллионы лет, с большей доле вероятности окажутся невыгодными, токсичными, для микроорганизма в его эволюционно первичной нише [71]. Этим "поврежденным" комменсалам для выживания в первичной нише нового хозяина, где патоадаптивные мутации оказываются вредными, вытесняющими, компенсаторные адаптации могут быть применимы.
Согласно этой теооии, можно было бы предположить, что приобретение больших (островки патогенности) или малых {рар оперон) генетических элементов на самом деле направляется инициирующими патоадаптивными мутациями (таких, как замена ML феи - па FimH на МН) для повышения адаптированности клонов к патологической нише, либо для компенсации вредных воздействий внутри первичной ниши. 1.5.3. Значение и перспективы дальнейшего изучения адгезина FimH пилей первого типа.
На сегодняшний день очевидно, что пили первого типа - наиболее распространенный адгезии энтеробактерий. Они намного более сложные по строению, чем это казалось ранее. FimH исходно является комменсальной структурой. Но адаптивные мутации, возникающие в гене лектина, оказывают драматический эффект на тропизм Е. coli и смену фенотипа микроорганизмов на более вирулентный. Результаты изложенных выше экспериментов, характеризующих адаптивные свойства различных фенотипических вариантов FimH, суммированы в таблице 3.
Эволюционные взаимоотношения исходный производный Спектр связывания с клетками узкий широкий Устойчивость к ингибированию сильная слабая Степень приспособленности к комменсальной нише высокая низкая Степень приспособленности к патологической нише низкая высокая Материалы, представленные в этой главе, имеют несколько аспектов. Во-первых, эти данные представляют рациональное объяснение роли пилей первого типа для колонизации как первичной комменсальной ниши, так и патологической. Это всегда оставалось загадкой из-за широкого спектра и разнообразия физиологических сред, вовлеченных в процесс колонизации - орофарингеальная полость, кишечник, мочевой пузырь. Они убедительно показывают, что все новые эпидемиологические исследования, оценивающие вклад роли пилей первого типа в возникновение и развитие заболеваний, должны включать фенотипы FimH микробов, выделенных от больного. Во-вторых, необходимо учесть, что если адаптивные мутации возникают в fimH гене штаммов Б. coli, то вероятно, аналогичные феномены возникают среди других представителей семейства энтеробактерий, экспрессирующих пили первого типа.
В-третьих, вероятно, подобного рода патоадаптивные мутации присутствуют среди других видов бактериальных фимбрий. Так, интересно было бы рассмотреть варианты PapG адгезина в приложении к этой схеме, поскольку известно, что адгезины PapG класса отличаются между собой по рецепторной специфичности. Кроме того, было документально подтверждено, что функциональные модификации этих адгезинов оказывают эффект на взаимодействие с клеточными культурами, а также на видовой тропизм [144]. Варианты PapG адгезина демонстрируют меньшую структурную гомологию, чем FimH, и предстоит еще выяснить, являются ли они вариантами одного аллеля.
В-четвертых, эти исследования иллюстрируют, что бактериальные лектины могут служить уникальным инструментом для изучения рецепторной архитектоники клеток макроорганизма, как это имело место при выявлении ранее неизвестного мозаицизма зонтичных клеток мочевого пузыря.
Классическая (кальциевая) трансформация клеток E.coli ДНК
Чтобы определить далее специфику гибридных FimH-FocH вариантов, мы проверили их способность связываться с эукариотическими клетками в четырех последовательных экспериментах, которые ранее использовались для определения FimH-рецепторной специфичности [136, 137]. Агрегация дрожжей и связывание с клетками защечного эпителия осуществлялись как ЗМ, так и 1М/ЗМ вариантами FimH. Напротив, образование розетки эритроцитами морской свинки и адгезия к эпителиальным клеткам мочевого пузыря специфически происходила только со штаммами, экспрессирующими 1М/ЗМ FimH вариант адгезина.
Бактерии, обладающие FimH1"184-FocH196"290 адгезином, были способны к сильному связыванию в 1М-специфичных лунках исследования, покрытых манно-зилированнным БСА (таблица 4), что соответствует явной 1М-связывающей способности гибридного адгезина. Однако, этот штамм показал только незначительные положительные результаты в ЗМ-специфическом исследовании (по связыванию с РНКазойВ) указывая, что FimH1 184-FocH196"290 адгезии почти лишен ЗМ-рецептор связывающей способности. Очевидно, хотя сильная моновалент-связывающая способность гибридного адгезина обеспечивает бактериальное связывание с очищенным ЗМ рецептором, РНКазойБ, ЗМ- рецепторы на поверхности дрожжей или буккальных клеток не могут быть использованы в достаточной степени, чтобы выполнить агрегацию клеток.
Типыфимбриальныхадгезинов Мономанноз-специфические исследования Олигоманноз-специфические исследования
Штаммы, экспрессирующие FimH1 158-FocH169-290 и FimH1"170-FocH181-290 гибриды, имели тот же самый профиль связывания с клетками, как и FimH1"184-FocH196"290 гибрид, в то время, как FimH1"217-FocH228 290 гибрид имел профиль, подобный "дикому" FimH-K12 (табл. 4).
Таким образом, адгезивные профили, проявляемые FimH-FocH гибридами, содержащими фрагменты с 1 по 158, 170 и 184 аминокислоты соответственно, в исследованиях связывания с субстратами, ингибировании маннозой и клеточном взаимодействии, отчетливо показывают, что эта группа химерных адгезинов обладает отличной способностью осуществлять бактериальное связывание посредством моновалентного 1М-специфичного механизма, но лишена мультивалентной ЗМ-специфичной связывающей активности. Такие адгезины с 1М-связывающим фенотипом представляют абсолютно новый класс, который отличается от естественно существующих ЗМ- и 1М/ЗМ-специфичных FimH вариантов комменсальных и уропатогенных штаммов Е. coli.
Мы обнаружили новые свидетельства наличия мультивалентной ЗМ и моновалентной связывающей способности гибридного адгезина FimH-FocH. Гибрид 73
ные адгезины, несущие остатки 1-201 и 1-217 из FimH, показали отличную от "дикого" варианта FimH Е. coli штамма К-12 ЗМ-специфичность и измененную 1М-специфичность. Это неудивительно, поскольку присоединенная С-концевая часть FocH высоко гомологична соответствующему участку FimH (см. рис. 5), который в первую очередь вовлечен во взаимодействие с молекулярным шапероном FimC [23]. Напротив, FimH-FocH гибриды, включающие 1-139 аминокислоты FimH (или меньше) были абсолютно нефункциональны в проведенных тестах. Как демонстрировалось ранее, структурная целостность 133-141 аминокислотного региона FimH лектин домена (который показывает очень низкую гомологию с соответствующим участком FocH) критически важна для функционирования FimH и составляет часть обязательного рецепторного кармана [23,131].
Наиболее важные результаты этого исследования были получены с использованием 1-158, 1-170 и 1-184 аминокислотных FimH-FocH гибридных адгези-нов. По сравнению с "диким типом" FimH-K12, эти гибриды демонстрируют значительно повышенную способность связывать иммобилизированный 1М-БСА субстрат и осуществлять бактериальную адгезию в 1М-специфическом исследовании взаимодействия с клетками (связывании с эритроцитами и адгезии к клеткам уро-эпителия).
Гибридные адгезины, несущие остатки 1-201 и 1-217 из FimH, показали отличную от "дикого" варианта FimH Е. coli штамма К-12 ЗМ- и измененную 1М-специфичность. Это было неудивительно, поскольку присоединенная С-концевая часть FocH высоко гомологична соответствующему участку FimH (см. рис. 5), который в первую очередь вовлечен во взаимодействие с молекулярным шапероном FimC [23]. Напротив, FimH-FocH гибриды, включающие 1-139 аминокислоты FimH были абсолютно нефункциональны в проведенных тестах. Как было показано ранее, структурная целостность 133-141 аминокислотного региона FimH лектин домена (который показывает очень низкую гомологию с соответствующим участком FocH) критически важна для функционирования FimH и составляет часть обязательного рецепторного кармана [23, 131]. Наиболее важными оказались результаты, полученные при использовании 1-158, 1-170 и 1-184 аминокислотных FimH-FocH гибридных адгезинов. По сравнению с "диким типом" FimH-K12, эти гибриды демонстрируют значительно улучшенную способность связывать иммобилизированный 1М-БСА субстрат и осуществлять бактериальную адгезию в 1М-специфическом исследовании взаимодействия с клетками (связывании с эритроцитами и адгезии к клеткам уроэпителия). В то же самое время, связывание этих гибридов с ЗМ-содержащим субстратом РНКазойБ, было в 200 раз более чувствительно к ингибированию 1М-производными амМ, чем мультивалентное ЗМ-специфичное связывание, опосредованное FimH-K12 и другими природно существующими FimH вариантами. Кроме того, бактерии, экспрессирующие эти гибридные адгезины, были неспособны адгезировать в исследовании клеточного взаимодействия, что легко осуществляется ЗМ- или ЗМ/1М-специфичными вариантами FimH (агрегация дрожжей и связывание с клетками буккального эпителия). Поэтому, мы считаем, что 1-158, 1-170 и 1-184 аминокислотные FimH-FocH гибриды показывают принципиально новый, 1М-специфичный фенотип связывания, и, по сути, лишены способности к мультивалентному ЗМ-специфичному взаимодействию FimH-рецептора.
Интересно, что 1-156 аминокислотный лектин домен FimH полностью инкорпорирован в гибридные структуры, и, поэтому структурные изменения области пилин домена ответственны за функциональную модификацию. Пилин домен, как считается, обеспечивает инкорпорирование субъединицы FimH в фимбриальную структуру [23]. Фимбриальные, структурно-обусловленные изменения в FimH специфичности были описаны в предыдущих исследованиях. Показано, что экспрессия FimH адгезина кишечной палочки в составе пилей первого типа гетерологич-ных видов, приводит к видо-специфичным функциональным изменениям адгезина [94, 146]. Поэтому, 1М-связывающий фенотип соответствующих FimH гибридов, мог быть детерминирован измененной конформацией FimH-FocH гибридных субъединиц в пределах фимбриальной оси, то есть, как результат определенных дистальных эффектов на сайтах связывания FimH, расположенных в пределах лектин домена.
Можно полагать, например, что функциональные свойства лектин домена могут быть изменены при взаимодействии с пилин доменом FimH или другими фимбриальными субъединицами, то есть в составе четвертичной структуры FimH. Альтернативно, приобретение сильной моновалентной связывающей способности, с одновременной потерей мультивалентной связывающей способности, может происходить из-за прямого видоизменения дополнительного, структурно ограниченного кармана связывания неизвестной природы, расположенного в пределах пилин домена.
Изучение адгезивных свойств пилей первого типа штаммов Escherichia coli в условиях потока
Существует, по крайней мере, два механизма, которые могли бы объяснить, как вызванные силой и/или мутацией структурные изменения в области линкернои цепи, усиливают связывание с клеточными рецепторами. Во-первых, конформационные изменения в области соединения лектин и пилин доменов могут распространяться вдоль лектин домена и вызывать изменение конформации ре-цептор-связывающего сайта от "низко-афинной" к "высоко-афинной". Подобный механизм был предложен для связывающего белка тромбоцитов, фактора Вил-лебранта. В этом случае на кристаллических структурах было показано, как отдаленная точечная мутация вызывает каскад структурных изменений, достигающих дистально расположенный сайт связывания [21]. Чтобы приложить подобный механизм к нашему исследованию, потребовалось бы дополнительное знание природы рецептора эритроцитов, узнаваемого FimH, и кристаллической структуры мостика между FimH и рецептором.
Вторым возможным механизмом для объяснения потоковой активации может быть то, что вызванные силой конформационные изменения в линкернои цепи FimH формируют некий дополнительный "неизвестный" сайг связывания, пока не идентифицированный в кристаллической структуре. Таким образом, задачей будущих исследований должно быть выявление точного молекулярного механизма адгезии, усиливаемой потоком.
FimH варианты с низким уровнем 1М-связывания, потоко-зависимые, наиболее распространены среди Е. соН. Возможное преимущество у этих вариантов бактерий заключается в том, что этот тип связывания позволяет бактериям прикрепляться к колонизируемой поверхности в условиях высокого потока, а также двигаться и распределяться вдоль поверхности путем периодического отрыва или перекатывания при низком потоке. Другое возможное преимущество вытекает из факта, что в условиях потока сила тяги на поверхности связавшихся бактерий -существенна, в то время как эта же сила на поверхности растворенных молекул с низким молекулярным весом - незначительна. Если сила усиливает адгезию, то поток будет преимущественно поддерживать связывание поверхностно-расположенных рецепторов, чем ингибирование растворенными молекулами. Таким образом, активированная потоком адгезия, вероятно, обеспечивает механизм устойчивости бактерий к действию растворенных молекул ингибитора, которые в противном случае оказались бы эффективны в блокировании адгезии.
Мы исследовали, как способность FimH отвечать на действие потока, влияет на чувствительность к ингибированию в динамических условиях. При этом сравнили способность агрегировать эритроциты FimH-f/8-V156P мутанта с диким типом FimH-f /S при различных концентрациях а-метил-маннозида, конкурирующего ингибитора FimH адгезии. В отсутствии ингибитора дикий тип FimH-r78 адгези-ровал эритроциты на более низком уровне, чем мутант, но в присутствии ингибитора на более высоком уровне, чем мутант (рис. 16В). Таким образом, зависимость дикого типа F\mH-f18 от потока коррелирует с повышенной устойчивостью к ингибированию в условиях потока. Соответственно, при определенных обстоятельствах потоко-зависимый тип адгезии может оказываться одним из принципиальных адаптивных свойств.
Физиологическая роль Е. соН интестинального происхождения, экспресси-рующих пили первого типа, заключается в переходной колонизации орофаринге-ального эпителия, что, вероятно, необходимо для успешного пассажа бактерий через желудочный барьер и колонизации кишечника [10]. На поверхности орофа-рингеальной слизистой бактерии подвержены влиянию сильного потока слюны и глотательных движений, наряду с высокой концентрацией растворенных высокоманнозилированных компонентов слюны. С другой стороны, FimH-y 96, который проявляет потоко-независимый тип адгезии, - естественно существующий вариант, а высокий уровень связывания FimH с 1 М-рецепторами типичен для уропато-генных штаммов. Потоко-независимый тип адгезии мог быть наиболее выгоден при быстрой массивной колонизации поверхностей, независимо от окружающего потока и присутствия относительно низкой концентрации растворенных маннозилированных компонентов, например, в ходе колонизации эпителия мочевого пузыря и почечной ткани. Естественное существование таких вариантов адгезина является отражением продолжающейся адаптивной молекулярной эволюции Е. coli. Мы видим, как механизм потоко-зависимого связывания заменяется на альтернативный, потоко-независимый тип. Таким образом, было бы интересно определить селективные преимущества различных FimH связывающих типов на примере различных моделей.
Анатомические особенности мочевыводящего тракта делают его доступным для контаминации кишечной микрофлорой. Из более четырехсот видов микробов, обитающих в кишечнике, кишечная палочка обладает определенными преимуществами при колонизации мочевыводящих путей. Однако далеко не каждому представителю этого вида удается освоить новую экологическую нишу. Только те варианты микробов, которые способны преодолеть механическое удаление постоянным потоком мочи, могут сформировать уропатогенную популяцию Е. coli. Очевидно, ключевым моментом в распространении Е. coli из естественной среды обитания на новые территории является функциональное изменение адгезинов, обеспечивающих микробу надежное прикрепление к уроэпителию в условиях постоянного потока жидкости. Оказалось, что штаммы, выделенные из кишечника, связываются с клеткой-мишенью через ЗМ рецепторы, в то время как уропатогенные варианты оказываются способными взаимодействовать и с 1М рецепторами. В процессе генетического анализа был расшифрован механизм возникновения этого патоадаптивного признака уропатогенных штаммов Е. coli.
В ходе нашего исследования был выявлен принципиально новый фенотипический вариант адгезина: этот вариант обладал моновалентным 1М связыванием и не был способен к взаимодействию с ЗМ специфическими субстратами. Этот фенотип был получен при замене аминокислотных остатков с 185 по 279 в пределах пилин домена адгезина FimH соответствующим сегментом фимбриального адгезина FocH пилей F1C типа. Кроме того, 1М специфичный фенотип возникал в случае одной аминокислотной замены, Глу89Лиз, в лектин домене FimH. Такой моновалентный фенотипический тип адгезина не был обнаружен среди природно существующих штаммов кишечной палочки, но послужил удобной моделью для изучения лиганд-рецепторных взаимоотношений.
