Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1 .Современное состояние микроэкологии организма человека, взаимодействие микроорганизмов друг с другом и с макроорганизмом 14
1.2. Роль пробиотиков в нормализации микроэкологического состояния макроорганизма 23
Глава 2. Материалы и методы 36
2.1. Материалы 36
2.1.1. Штаммы микроорганизмов 36
2.1.2. Фильтраты культуральных жидкостей 39
2.1.3. Питательные среды 39
2.1.4. Препараты 39
2.1.5. Отраслевой стандарт бифидумбактерина 39
2.1.6. Лабораторные животные 39
2.2. Методы 40
2.2.1. Контроль коммерческих препаратов 40
2.2.2. Изучение взаимодействия штаммов и продуктов их метаболизма 40
2.2.3. Оценка морфологической гетерогенности микробной популяции методами позитивного окрашивания и ультратонких срезов 41
2.2.4. Морфометрический анализ 42
2.2.5. Исследование антагонистической активности препаратов 42
2.2.6. Изучение безопасности бификола на моделях «острой» и «хронической» токсичности 43
2.2.7. Патоморфологическое исследование 45
2.2.8. Статистические методы исследования 46
Глава 3. Изучение взаимодействия В. bifidum шт.1 и Е. coli шт. М-17, и влияния продуктов их метаболизма на рост каждого при совместном культивировании штаммов 47
3.1 Изучение взаимовлияния бифидобактерий и кишечной палочки на рост каждого при совместном культивировании 48
3.2. Влияние продуктов метаболизма бифидобактерий на рост Е. coli шт. М-17 50
3.3. Влияние продуктов метаболизма кишечной палочки на рост В. bifidum шт 1 55
Глава 4. Морфо-физиологические особенности клеток микробных популяций в составе бификола и препаратов бифидумбактерина, колибактерина 60
4.1. Электронно-микроскопическое исследование морфологической гетерогенности микробных популяций Е. coli шт. М-17и В. bifidum шт.1, выращенных в жидких питательных средах 61
4.2. Электронно-микроскопическое исследование бифидумбактерина (производитель - ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова, с. Петрово-Дальнее) 66
4.3. Электронно-микроскопическое исследование колибактериа (производитель - ОАО «Биомед» им. И. И. Мечникова, с. Петрово-Дальнее) 71
4.4. Электронно-микроскопическое исследование бификола 74
4.4.1. Морфометрический анализ препарата бификола (производитель - ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова, с. Петрово-Дальнее), полученного при раздельном культивировании В. bifidum шт. 1 иЕ. coli шт. М-17 74
4.4.2. Морфометрический анализ препарата бификола (производитель - НПО «Иммунопрепарат», г. Уфа), полученного при совместном культивировании В. bifidum шт. 1 и. coli шт. М-17 81
Глава 5. Изучение взаимодействия В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 в бификоле при оценке антагонистической активности in vitro ...92
5.1-. Характеристика бификола по специфической активности 92
5.2. Оценка взаимодействия бифидо- и коликомпонентов при контроле антагонистической активности бификола 96
5.2.1. Определение количественного содержания бифидобактерий и кишечной палочки в посеве бификола 96
5.2.2. Определение антагонистической активности бификола в аэробных условиях и с использованием анаэробной системы GENbox С02 с концентрацией углекислого газа в среднем 3-6 % (фирма bioMerieux sa - Франция) 98
5.2.3. Определение антагонистической активности бификола, В. bifidum шт. 1 с использованием анаэробной системы «OXOID» с концентрацией 5 % 02 и 10 % С02 (фирма «OXOID», Великобритания) 101
Глава 6. Изучение взаимодействия культур В. bifidum шт. 1 иЕ. coli шт. М-17 на модели «острой» и «хронической» токсичности комплексного препарата бификола и составляющих его монокомпонентов 106
6.1. Патоморфологическое исследование 108
6.1.1. Результаты исследования «острой» токсичности 108
6.1.2. Результаты гистологического изучения внутренних органов мышей после введения Е. coli шт. М-17 111
6.1.3. Результаты гистологического изучения внутренних органов мышей после введения В. bifidum шт. 1 114
6.1.4. Результаты гистологического изучения внутренних органов мышей после введения смоделированного бификола 117
6.2. Результаты исследования «хронической» токсичности 121
6.2.1. Результаты гистологического изучения внутренних органов контрольных мышей 122
6.2.2. Результаты гистологического изучения внутренних органов мышей после введения бифидумбактерина 123
6.2.3. Результаты гистологического изучения внутренних органов мышей после введения колибактерина 124
6.2.4. Результаты гистологического изучения внутренних органов мышей после введения смоделированного
бификола 124
Обсуждение 128
Выводы 140
Список литературы 141
Приложение
- Роль пробиотиков в нормализации микроэкологического состояния макроорганизма
- Влияние продуктов метаболизма кишечной палочки на рост В. bifidum шт 1
- Морфометрический анализ препарата бификола (производитель - ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова, с. Петрово-Дальнее), полученного при раздельном культивировании В. bifidum шт. 1 иЕ. coli шт. М-17
- Результаты гистологического изучения внутренних органов мышей после введения смоделированного бификола
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Постоянное влияние неблагоприятных факторов на жизнедеятельность человека, нередко превышающее компенсаторные возможности состояния системы «окружающая среда - макроорганизм микробиоциноз», способствует развитшо дисбиотического состояния и, как следствие этого, проявлению заболеваний инфекционной и неинфекционной природы. Известно, что представители нормофлоры принимают самое непосредственное участие в биохимических, метаболических и иммунологических процессах макроорганизма за счет продукции ими различных ферментов, витаминов, биологически активных (антибиотикоподобных) веществ и других, разных по действию, продуктов метаболизма (Воробьев А.А. с соавт., 1999; Шендеров Б.А., 2002; Бондаренко В.М., 2008). Поэтому для профилактики и лечения таких состояний в медицинской практике широко используют пробиотики.
Лечебное действие монопрепарата ограничено индивидуальным спектром биологической активности штамма, на основе которого изготовлен пробиотик. Для повышения и расширения лечебного действия пробиотиков в практику здравоохранения внедрены комплексные препараты, изготовленные на основе двух и более штаммов одного вида или разных видов представителей нормофлоры: бификол, ацилакт, аципол, флорин форте.
Отечественный комплексный препарат бификол разработан на основе двух видов микроорганизмов - Bifidobacterium bifidum штамм 1 и Escherichia coli штамм М-17 (Рахимова Н.Г., 1977). Несмотря на длительный срок выпуска препарата, серии бификола отличаются друг от друга по показателям количественного содержания живых бифидобактерий и кишечной палочки в дозе. Это может быть обусловлено несовершенством технологии изготовления бификола, использованием различных по составу питательных сред, изменением свойств микроорганизмов при совместном их культивировании, несовместимостью используемых штаммов и другими факторами.
Лечебная эффективность пробиотиков определяется совокупностью биологических свойств штаммов, входящих в их состав. Вместе с тем данные литературы свидетельствуют о том, что при совместном культивировании нескольких видов микроорганизмов возможно усиление или ослабление некоторых биологическими свойствами монокультур: кислотообразующей, антагонистической и
адгезивной активностей, резистентности к антибиотикам, продукции биологически активных веществ (Ганина В.И., 2001; Фадеева И.В., 2004; Несчисляев В.А.; 2005; Петров Л.Н., 2008). Механизм взаимодействия культур в смешанной популяции недостаточно изучен и привлекает внимание исследователей для решения технологических вопросов микробиологического производства.
В этой связи, исследования по изучению механизма взаимодействия культур В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 в бификоле в смешанной популяции при оценке их биологических свойств (биосовместимости, морфо-физиологического состояния клеток в бификоле, антагонистической активности in vitro и безопасности препарата in vivo) актуальны и имеют научную и практическую значимость для повышения качества коммерческого препарата.
Цель настоящей работы - изучение механизма взаимодействия В. bifidum шт. 1 и coli шт. М-17 в комплексном препарате бификол в опытах in vitro и in vivo.
Задачи исследования:
-
Изучение взаимовлияния культур бифидобактерий и кишечной палочки и продуктов их жизнедеятельности друг на друга при совместном культивировании.
-
Изучение морфологического состояния клеток В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 в коммерческих сериях бификола, бифидумбактерина и колибактерина.
3. Оценка антагонистической активности бификола и производственных
штаммов В. bifidum шт. 1, Е. coli шт. М-17 в аэробных и анаэробных условиях по
отношению к регламентированным и музейным тест-штаммам патогенных
микроорганизмов.
4. Изучение безопасности бификола в опытах in vivo на модели «острой» и
«хронической» токсичности, и оценка совместного действия двух компонентов
бификола на организм экспериментальных животных.
Научная новизна исследования:
На экспериментальной модели оценки совместимости штаммов В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 установлено стимулирующее влияние кишечной палочки и продуктов ее жизнедеятельности на рост бифидобактерий и ингибирующее действие бифидобактерий и продуктов их метаболизма на рост кишечной палочки.
Впервые изучено морфо-физиологическое состояние клеток В. bifidum шт.1 и Е. coli шт. М-17 в коммерческих лиофилизированных препаратах бификоле,
з бифидумбактерине, колибактерине. Сравнительный анализ электронно-микроскопических исследований выявил наличие взаимного антагонизма бифидобактерий и кишечной палочки в смешанной популяции при их совместном и раздельном культивировании в процессе производства бификола.
На основании результатов изучения взаимодействия культур в смешанной популяции в бификоле при испытании антагонистической активности в аэробных условиях и с использованием анаэробных систем разработана модификация метода контроля антагонистической активности бификола.
При изучении взаимодействия В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 в бификоле в опытах in vivo на моделях «острой» и «хронической» токсичности показана безопасность ассоциации штаммов в бификоле.
Теоретическая и практическая значимость исследования.
На модели бификола научно обоснована целесообразность: - изучения взаимодействия штаммов в комплексных препаратах с помощью различных методов исследования: оценки совместимости, антагонистической активности, кислотообразующей активности, безопасности;
изучения биологических свойств комплексных препаратов в сравнении со свойствами микроорганизмов, входящих в их состав, для оценки взаимовлияния их на основные показатели, определяющие качество готового комплексного препарата;
- изучения антагонистической активности комплексного препарата с использованием оптимальных условий культивирования для каждого компонента смешанной микробной популяции;
-изучения безопасности моно- и комплексных пробиотиков в опытах «острой» и «хронической» токсичности в сравнении со штаммами, входящими в состав препарата.
Электроннно - микроскопические методы исследования морфологического состояния клеток в коммерческих препаратах - бификоле, бифидумбактерине, колибактерине - расширяют существующие представления о взаимодействии культур в смешанных микробных популяциях; оценка морфо-физиологического состояния микроорганизмов в моно- и комплексном препаратах и соотношения физиологически активных и покоящихся форм клеток перспективна для прогнозирования развития микробных сообществ в процессе культивирования с заданными характеристиками.
Данные настоящей работы реализованы разработкой МУК «Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков» (разд. 2,3,4,6,8).
Результаты исследований могут быть использованы в практической и научно-исследовательской работе при разработке новых лечебно-профилактических препаратов пробиотиков, а также в работах, направленных на повышение качества комплексных препаратов и совершенствование технологии их изготовления. Основные положения, выносимые на защиту:
1. При совместном выращивании BMfidum шт.1 и E.coli шт. М-17 наблюдается сложный механизм их взаимодействия: бифидобактерии и продукты их метаболизма оказывают ингибирующее действие на рост кишечной палочки, а кишечная палочка и продукты ее метаболизма стимулируют рост бифидобактерии, что проявляется в накоплении биомассы.
2. С помощью электронно-микроскопических методов исследования моно- и
комплексного препаратов выявлен антагонистический механизм взаимоотношений
двух видов микроорганизмов в смешанной популяции бификола, выражающийся в
усилении фрагментации клеток бифидобактерии и появлении электронно-плотных
гранул, в агрегации клеток кишечной палочки и деструктивных изменений в них.
3. Взаимодействие двух культур в смешанной популяции бификола
проявляется по-разному при оценке антагонистической активности в аэробных и
анаэробных условиях, что диктует целесообразность при наличии в комплексных
препаратах представителей аэробных и анаэробных микроорганизмов
использования оптимальных условий для культивирования каждого
микроорганизма in vitro.
4. Комплексный препарат бификол по результатам испытания «острой» и «хронической» токсичности безопасен, что прояатяется в отсутствии признаков токсического действия препарата на центральную нервную систему, органы иммунной системы и другие внутренние органы подопытных животных.
Апробация работы и публикации. Диссертация апробирована и рекомендована к защите на заседании Ученого совета Федерального государственного учреждения науки Государственного научно-исследовательского
института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича Роспотребнадзора (ФГУН ГИСК им. Л. А. Тарасевича Роспотребнадзора), протокол №18 от 16.12.2008 г. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Юбилейной научно-практической конференции НИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, Москва, 1996; Международной научно-практической конференции памяти Г. И. Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования», Москва, 2002; Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы», Москва, 2004; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней»; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2008.
По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 1 в журнале, рекомендованном ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 154 страницах, содержит 22 таблицы и 46 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, четырех глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 133 источника, из них 73 отечественных и 60 иностранных, приложения.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена на базе лаборатории бактерийных вакцин и препаратов из нормофлоры в соответствии с планом НИР ФГУН ГИСК им. Л. А. Тарасевича, договоры № 737/089/024 и № 034/089/009 с Минздравом России - Отраслевая научно-исследовательская программа «Эпидемиология и микробиология» и с Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека № 73-Д в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Научные аспекты обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в Российской Федерации на 2006-2010 годы».
Роль пробиотиков в нормализации микроэкологического состояния макроорганизма
Идея использовать продукты питания, содержащие представителей молочно-кислых бактерий, для поддержания здоровья и продления жизни человека принадлежит И.И. Мечникову. Еще на рубеже двадцатого столетия им был впервые поднят вопрос о значении нормальной микрофлоры для организма человека, об антагонистических и симбиотических взаимоотношениях в микробных сообществах пищеварительного тракта, о возможностях и путях коррекции нарушенного микробиоценоза [34]. Среди жителей степей и гор, пользующихся постоянно натуральными продуктами, включая молочно-кислые продукты (сыры, йогурты), регистрируется больше всего долгожителей [7, 25, 28, 34]. В последние десятилетия важную роль в лечении и профилактике дисбиотических состояний отводят лечебным препаратам - пробиотикам [14, 16, 23, 24, 29, 35, 37, 42, 43, 44, 62, 66, 69].
По современной классификации пробиотики - живые микроорганизмы, оказывающие при естественном способе введения благоприятное воздействие на поддержание и сохранение здоровья человека [69, 70, 76, 132, 133].
Фундаментальные исследования биологической и медицинской науки позволили разработать и внедрить в медицинскую практику отечественные лиофилизированные бактериальные препараты, изготовленные на основе живых бифидобактерий, лактобацилл, кишечной палочки [16, 18, 29, 35, 37, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 55, 63, 66]. Выбор этих микроорганизмов был неслучайным и основывался на их ведущей роли в поддержании симбиотических взаимоотношений с макроорганизмом и в выполнении важных функций в поддержании здорового состояния макроорганизма, а также в регулировании межмикробных взаимоотношений индигенных микроорганизмов. Отличительной способностью бифидобактерий, лактобацилл и штамма Е. coli шт. М-17 является то, что они не содержат факторов патогенности, обеспечивающих адгезию, колонизацию и инвазию [31,40,86,93,95,96, 102, 109, 111, 112].
Среди отечественных лечебных препаратов, зарегистрированных в Российской Федерации, хорошо известны моно- и комплексные препараты — бифидумбактерин, колибактерин, бификол, лактобактерин, ацилакт, аципол, пробифор (бифидобактерии, сорбированные на угле), флорин форте, споробактерин, биоспорин [16, 23, 29, 35, 37, 44, 47, 55, 62, 63, 66].
Сфера приложения этих препаратов разнообразна: лечение дисбиотических состояний, ОКИ установленной и неустановленной этиологии, различных соматических и хронических инфекционных заболеваний ЖКТ и патологий верхних дыхательных путей, атопического дерматита, сопровождающихся дисбактериозом. Клиническими исследованиями доказано, что назначение пробиотиков способствует более быстрому снижению токсикоза, улучшению клиники течения заболевания и повышению иммунного статуса больного [16, 23, 24, 43, 44].
Первый отечественный препарат - бификол был разработан МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского и с 1975 г начат его выпуск [29, 47] . Бификол разработан на основе двух штаммов разных родов бактерий - В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17. Последний этап получения производственной биомассы предусматривал совместное выращивание этих культур. В одной дозе бификола содержится не менее 10 КОЕ живых клеток бифидобактерии и кишечной палочки каждого в отдельности, что соответствует их содержанию в естественном биотопе ЖКТ.
Бактериальные клетки микроорганизмов пробиотиков, попадая в организм человека в качестве транзиторной микрофлоры, должны, в первую очередь, подавлять рост патогенной и условно-патогенной микрофлоры, способствовать восстановлению собственной индигенной микрофлоры, и таким образом, скорректировать нарушенный баланс сложившегося сообщества микроорганизмов [9, 16, 23, 24, 25, 30, 42, 43, 44, 45, 67, 118, 119].
Результаты клинического исследования бификола свидетельствовали о его хорошей переносимости и большей эффективности по сравнению с бифидумбактерином при лечении острых и хронических заболеваний, связанных с нарушениями кишечной микрофлоры: хронических колитов, энтероколитов, дисбактериозов различной этиологии, а также случаев затянувшегося бактериовыделения и кишечной дисфункции по окончании острого периода дизентерии. У больных, получавших бификол, отмечена более ранняя репарация слизистой толстой кишки по сравнению с леченными фуразолидоном и бифидумбактерином [43, 47, 73].
При испытании комплексного препарата - бификола очищение организма больных с острой дизентерией от возбудителя наступало у 94,6 % через 6 суток от начала лечения, при приеме бифидумбактерина - у 81,3 % больных. Применение бификола в период реконвалесценции острой дизентерии в два раза снижало частоту формирования затяжных форм дизентерии по сравнению с больными, получавшими бифидумбактерин или соматическое лечение. Значительное улучшение состава микрофлоры у таких больных наступало после 3-4 недель от начала лечения пробиотиками. Выявлены также различия в сроках нормализации аэробной и анаэробной микрофлоры кишечника в зависимости от вида применяемого препарата: у больных, получавших бификол быстрее восстанавливалась аэробная микрофлора, а при приеме бифидумбактерина - анаэробная микрофлора [47].
Важным показателем качества и лечебного действия пробиотиков являются биологические свойства штаммов микроорганизмов, входящих в их состав. Преимущество комплексных препаратов, по сравнению с монопрепаратами, заключается в том, что полезные свойства каждого штамма в них позволяют расширить сферу их применения и повысить лечебную эффективность препаратов. Поэтому, использование пробиотиков многовидового микробного состава является наиболее перспективным подходом к бактериотерапии. Подтверждением этому является опыт использования комплексных препаратов бификола, флорина форте, ацилакта, аципола, биоспорина. Испытание комплексного пробиотика - бификола выявило его большую эффективность по сравнению с бифидумбактерином при изученных нозологических формах заболевания [47].
Бактериальные пробиотики представляют собой лекарственное средство, у которых действующим активным началом являются живые микроорганизмы. Для реализации лечебного действия пробиотиков необходимо сохранение в препарате физиологически активных клеток культур штаммов, используемых для их приготовления, и проявление ими в полном объеме всех полезных биологических свойств.
При разработке технологии производства бификола авторами был использован природный синергизм между бифидобактериями и кишечной палочкой и сохранено их оптимальное физиологическое количественное соотношение, аналогичное наблюдаемому в естественном биотопе [47]. Совместимость двух культур авторы изучали по следующим параметрам: сохраняемость содержания жизнеспособных клеток микроорганизмов двух штаммов, полученных при раздельном культивировании и объединенных на последнем этапе перед лиофилизацией или в жидкой смеси; стимулирующее влияние Е. coli шт. М-17 на рост В. bifidum шт. 1 в условиях «голодных» сред, затем при культивировании в средах Блаурокка и КД-5. На основании полученных результатов авторы сделали заключение об их совместимости [47].
Несмотря на длительный срок применения бификола, процесс его изготовления при совместном культивировании двух штаммов, недостаточно стандартен. Об этом свидетельствуют паспортные данные и результаты контроля специфической активности бификола в ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Это может быть обусловлено различием в технологии совместного культивирования двух культур (культивирование их в стационарных условиях в бутылях или при глубинном культивировании при периодическом или постоянном перемешивании) при изготовлении препарата, использование разных по составу питательных основ и сред, изменением свойств производственных штаммов при совместном культивировании и другими недостаточно изученными факторами. Так, по данным В.А. Несчисляева [35] при отработке технологии изготовления бификола, было выявлено, что при реакторном культивировании бифидобактерий в среде КД-5 содержание клеток бифидобактерий достигало 109 КОЕ/мл, а в смешанной культуре этот показатель составлял 10 КОЕ/мл. Эти данные, по мнению автора, подтверждают более высокую эффективность раздельного накопления биомассы штаммов в производстве комплексного препарата.
Влияние продуктов метаболизма кишечной палочки на рост В. bifidum шт 1
Для изучения влияния центрифугатов кишечной (ЦК) палочки на рост бифидобактерий 1 дозу колибактерина засевали в 9 мл среды КД-5а или Блаурокка. Культуру выращивали при температуре (37±1) С в течение 24 ч. После окончания культивирования культуру центрифугировали при 3500 об/мин в течение 10 мин. В 9 мл центрифугата засевали по 1 дозе коммерческого бифидумбактерина с содержанием 10 микр. кл./мл. Кроме того, использовали также суточную культуру бифидобактерий 1-го пассажа (109 микр. кл./мл): по 1 мл культуры засевали в 9 мл ЦК. Посевы инкубировали при температуре (37±1) С в течение 24 ч. По истечении срока инкубации выросшую культуру в ЦК высевали путем последовательных десятикратных разведений на среду Блаурокка с азидом натрия (для определения содержания бифидобактерий) и МПБ (для определения содержания кишечной палочки). Контролем служил высев бифидумбактерина и суточной культуры бифидобактерий на среду Блаурокка, а также высев ОСО бифидумбактерина для подтверждения ростовых свойств среды. Учет результатов проводили через 24 ч для кишечной палочки и 72-96 ч для бифидобактерий. Выбранный режим центрифугирования практически не освобождал культуральную жидкость от Е. coli шт. М-17. Выявлена стимуляция роста бифидобактерий по сравнению с контролем на порядок (10 микр.кл/мл в ЦК и 108 микр.кл/мл среда Блаурокка).
Для подтверждения полученных результатов проведено дополнительное освобождение КЖ от культуры кишечной палочки путем фильтрации через фильтр миллипор (размер пор 0,22 мкм). Предварительный высев фильтрата на среду Блаурокка и МПБ подтвердил отсутствие в нем живых E.coli шт. М-17.
Влияние фильтратов на рост бифидобактерий проводили по методике, описанной выше для центрифугатов. В 9 мл полученных суточных фильтратов засевали по 1 мл бифидумбактерина с содержанием 10 8 живых микр. кл/мл, а также по 1 мл суточной культуры бифидобактерий 1-го пассажа с содержанием 10 живых микр. кл/мл (каждую посевную дозу в отдельности). Контролем служил высев бифидумбактерина, суточной культуры бифидобактерий и ОСО бифидобактерий на среду Блаурокка. Учет результатов проводили через 24 - 96 ч. Из представленных на рис. 3.2 данных видно, что продукты метаболизма Е. coli шт. М-17 оказывали стимулирующее влияние на рост бифидобактерий: количество бифидобактерий в фильтрате было на порядок больше по сравнению с контролем (10 и 10 микр. кл/мл соответственно).
Заключение. При совместном культивировании в лабораторных условиях производственных штаммов Е. coli шт. М-17 и В. bifidum шт. 1 содержание живых микробных клеток каждого компонента в бификоле зависело от вида посевного материала (лиофильно высушенный препарат или суточная культура 1-го пассажа) и посевной дозы материала. Так, при посеве на среды Блаурокка и КД-5а смоделированного бификола на основе лиофильно высушенных препаратов бифидумбактерина и колибактерина через 24 ч совместного культивирования в 1 мл выявлено 10 и 10 живых микробных клеток, что соответствовало их содержанию в монопрепаратах. Если в качестве посевного материала использовали суточные культуры бифидобактерий и кишечной палочки, отмечено ингибирование роста кишечной палочки при их совместном культивировании и стимуляция роста бифидобактерий. Эта закономерность более выражена при изучении взаимовлияния продуктов метаболизма бифидобактерий и кишечной палочки на рост культур Е. coli шт. М-17 и В. bifidum шт. 1. При использовании, в качестве питательной среды, центрифугатов культуральной жидкости бифидобактерий, содержащих метаболиты и 101 микр. кл./мл живых бифидобактерий, выявлено достоверно значимое ингибирующее действие на рост кишечной палочки: через 24 ч вырастало 104-103 и 101 микр. кл./мл вместо 10 и 109 микр. кл./мл соответственно (контроль). На фоне слабого роста кишечной палочки содержание бифидобактерий в ЦБ1, ЦБ2 и ЦБЗ существенно увеличилось соответственно до 107-10б, 105-103 и 103 микр. кл./мл вместо исходного 101 микр. кл./мл. Стимулирующее действие кишечной палочки на рост бифидобактерий обусловлено, по-видимому, дополнительным расщеплением ими питательных веществ в центрифугатах до аминокислот и пептидов, создавая благоприятные условия для утилизации их бифидобактериями. Разница в количестве выросших бифидобактерий и кишечной палочки в ЦБ1, ЦБ2 и ЦБЗ обусловлена большим содержанием питательных веществ в ЦБ1 по сравнению с ЦБ2 и ЦБЗ. Тенденция ингибирования роста Е. coli шт. М-17 сохранялась при использовании фильтрата культуральной среды бифидобактерий, содержащего только метаболиты бифидобактерий, в качестве питательной среды при посеве разных доз колибактерина, а также при коррекции рН в ЦБ2. При отсутствии в фильтратах бифидобактерий содержание кишечной палочки увеличивалось на два порядка, однако было значительно ниже содержания их в контроле.
Противоположные результаты получены при изучении влияния метаболитов кишечной палочки на рост бифидобактерий. При использовании, в качестве питательной среды, центрифугатов и фильтратов КЖ кишечной палочки при посеве бифидумбактерина отмечена стимуляция роста бифидобактерий: уже через 24 ч роста в 1 мл центрифугата и фильтрата выявлено на порядок больше выросшей культуры (10 вместо 10 микр. кл/мл в бифидумбактерине).
Таким образом, проведенные исследования выявили сложный механизм взаимодействия бифидобактерий и кишечной палочки при совместном их выращивании. В процессе культивирования оба микроорганизма конкурируют за питательные вещества. Продукты жизнедеятельности бифидобактерий изменяют состав и рН питательной среды, что неблагоприятно отражается на росте кишечной палочки. С другой стороны, продукты жизнедеятельности кишечной палочки оказывают благоприятное влияние на рост бифидобактерий. Проведенные нами исследования показали, что накопление биомассы Е. coli шт. М-17 и В. bifidum шт. 1 зависит также от посевной дозы, что может отразиться на содержании живых бактерий Е. coli шт. М-17 и В. bifidum шт. 1 в бификоле.
При совместном культивировании Е. coli шт. М-17 и Л. bifidum шт. 1 количественное содержание обоих компонентов зависит от качества питательной среды, концентрации посевного материала, скорости роста посевных культур, что при существующей нестандартной технологии трудновыполнимо и создает условия получения препарата, различающегося по количественному содержанию компонентов.
Далее целесообразно было провести сравнительное изучение морфо-физиологического состояния іслеток культур в бификоле, изготовленном по разной технологии (совместное и раздельное культивирование производственных штаммов).
Морфометрический анализ препарата бификола (производитель - ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова, с. Петрово-Дальнее), полученного при раздельном культивировании В. bifidum шт. 1 иЕ. coli шт. М-17
Морфометрический анализ позитивно окрашенных препаратов, полученных из регидратированного бификола при температуре 22 С, экспозиции 30 мин показал, что продукты метаболизма бифидобактерий оказывают подавляющее воздействие на клетки кишечной палочки. Это подтверждается тем, что встречаются единичные физиологически активные клетки кишечной палочки, остальные находятся в агрегированном состоянии, часть клеток кишечной палочки подвержена глубокой деструкции, на внешней стороне некоторых из них видны продукты распада бифидобактерий в виде электронно-плотных гранул, под действием которых клетки кишечной палочки подвергаются деструктивным изменениям (рис. 4.16).
Соотношение физиологически неактивных клеток (47,3 ± 0,3) % и физиологически активных клеток (52,7 ± 0,4) % бифидобактерий свидетельствует о том, что биомасса бифидобактерий в бификоле, разлитая во флаконы для лиофильного высушивания, почти на половину состояла из физиологически активных клеток с высоким уровнем метаболической активности. Обнаружение в препаратах фрагментированных клеток бифидобактерии и остатков разрушенных клеток связано, с одной стороны, с их частичным аутолизом, и с другой, с секрецией биологически активных веществ, оказывающих подавляющее воздействие на популяцию кишечной палочки.
Отсутствие в препаратах физиологически неактивных покоящихся клеток Е. coli шт. М-17, возможно, связано с тем, что бифидобактерии подавляют кишечные палочки настолько активно, что они не успевают перейти в фазу покоя, поэтому почти все они остаются в физиологически активном электронно-прозрачном и агрегированном состоянии (рис. 4.17).
Морфометрический анализ позитивно окрашенных препаратов бификола, регидратированного при температуре 37 С, экспозиции 30 мин, показал, что большая часть бифидобактерии при регидратации в аэробных условиях при температуре 37 С, экспозиции 30 мин не сумела перейти из покоящегося в физиологически активное состояние (рис. 4.18).
При этом клетки кишечной палочки, возможно, под давлением антагонистического воздействия бифидобактерий агрегировали, в связи с чем, в препаратах in situ их было трудно обнаружить. Свидетельством проявления антагонистической активности бифидобактерий является их активный распад на гранулы. Возможно, регидратация бификола при температуре 37 С, экспозиции 30 мин, недостаточно благоприятна для восстановления физиологической активности микробных клеток бифидобактерий.
Морфометрический анализ позитивно окрашенных препаратов бификола, регидратированного при температуре 22 и 37 С, экспозиции 2 ч
Результаты электронно-микроскопического исследования препаратов бификола, регидратированных при 22 и 37 С, экспозиции 2 ч практически полностью совпадают.
Электронно-микроскопическое исследование препаратов бификола в условиях регидратации при температуре 22 С и 37 С, экспозиции 2 ч позволило выявить динамику разрушения клеток Е. coli шт. М-17 под действием продуктов метаболизма клеток В. bifidum шт. 1.
Это подтверждается характеристикой клеток Е. coli шт. М-17 на рис. 4.19, где хорошо видна электронно-прозрачная физиологически активная клетка Е. coli шт. М-17 с адсорбированными на ее поверхности гранулами, а на рис. 4.20 можно наблюдать клеточную стенку, еще сохраняющую контуры клетки Е. coli шт. М-17, поверхность которой покрыта характерными электронно-плотными гранулами, образующимися в результате фрагментации бифидобактерий. На рис. 4.21 под гранулами, образованными бифидобактериями видны крупные мембранные везикулы, представляющие собой уже почти полностью разрушенные фрагменты клеточных стенок Е. coli шт. М-17.
Таким образом, исследование препаратов бификола in situ, регидратированных при температуре 22 С и 37 С, экспозиции 2 ч дает возможность проследить динамику процесса разрушения клеток кишечной палочки под действием продуктов метаболизма бифидобактерий. Анализ данных свидетельствует о том, что при раздельном культивировании производственных штаммов В. bifidum шт.1 и Е. coli шт. М-17 и соединением их перед лиофилизацией бифидобактерий, а особенно кишечная палочка, испытывают сильное, возможно, отрицательное, взаимодействие друг на друга продуктами метаболизма для регуляции количественного состава микробных клеток в смешанной популяции. Этим объясняется почти равное количественное соотношение в препаратах, полученных из регидратированного бификола при температуре 22 С, экспозиции 30 мин физиологически активных и неактивных клеток бифидобактерий и их фрагментацию и продукцию электронно-плотных гранул (биологически активных веществ); кишечная палочка, в этих условиях, настолько подавлена продуктами метаболизма бифидобактерий, что агрегировала, микробные клетки кишечной палочки в большей степени, чем в монопрепарате (колибактерине) были подвержены деструктивным изменениям (лизис разной степени развития). Увеличение температуры и времени экспозиции в аэробных условиях еще больше оказывало негативное воздействие на морфо-физиологическое состояние бифидобактерий (переход в физиологически неактивное состояние). По-видимому, оптимальным режимом регидратации бификола является короткая временная экспозиция лиофилизированного препарата: при температуре 22 С, экспозиции 30 мин.
Результаты гистологического изучения внутренних органов мышей после введения смоделированного бификола
Внутрибрюшинное введение Доза бификола 20 ОЕ (10 ОЕ В. bifidum шт. 1 + 10 ОЕ Е. coli шт. М-17). Четыре из семи животных пали на первые сутки. Макроскопически у погибших и выживших мышей отмечали резкое вздутие кишечника, выраженное полнокровие легких (рис.6.9.), печени (рис. 6.10), селезенки, слизистых и серозных оболочек. При микроскопическом исследовании ЦНС и внутренних органов выживших животных на 1 сутки опыта выявлено резкое полнокровие внутренних органов.
В легких на фоне полнокровия отмечали чередование участков микроателектазов и эмфиземы, выраженные периваскулярные и перибронхиальные лимфоидноклеточные инфильтраты. В печени находили выраженное полнокровие паренхимы и выраженные очаговые дистрофические изменения гепатоцитов. В тимусе отмечали умеренную гиперплазию мозгового и коркового слоев. В селезенке на фоне резкого полнокровия отмечали пролиферацию ретикулярных клеток стромы, уменьшение размеров и общего числа лимфоидных фолликулов, умеренную макрофагальную реакцию в краевом синусе и образование множественных многоядерных гигантских клеток. Аналогичная картина наблюдалась в брыжеечных лимфатических узлах.
На 7 сутки морфологическое исследование не проводили, так как часть животных пала, а остальные были забиты на первые сутки опыта.
Доза бификола 10 ОЕ (5 ОЕ В. bifidum шт. 1 +5 ОЕ Е. coli шт. М-17).
При уменьшении дозы в два раза на первые сутки опыта больше половины мышей оставалось живыми, однако у них отмечалась вялость.
При макроскопическом исследовании внутренних органов у павших и выживших мышей наблюдали резкое вздутие тонкого и толстого кишечника, выраженное полнокровие внутренних органов, мелкоточечные кровоизлияния в серозных и слизистых оболочках.
При микроскопическом исследовании внутренних органов обнаружено полнокровие головного мозга, легких, печени, селезенки. В легких отмечали выраженное полнокровие, утолщение межальвеолярных перегородок, образование очагов эмфиземы и ателектазов. В просвете альвеол выявлено скопление большого числа макрофагов. По ходу сосудов и мелких бронхов у отдельных животных находили выраженную лимфоидноклеточную инфильтрацию. В селезенке имело место полнокровие, уменьшение лимфоидных фолликулов и трабекулярной белой пульпы, активация ретикулярных клеток и обнажение ретикулярного остова. В лимфатических узлах брыжейки отмечалась аналогичная картина. В печени на фоне резкого полнокровия и очаговых диапедезных кровоизлияний была выражена очаговая зернистая и вакуольная дистрофия гепатоцитов. В почках -неравномерное полнокровие коркового и мозгового слоя. Тимус сохранял свою обычную структуру. Корковый и мозговой слой были хорошо контурированы. В мозговом слое равномерно распределены мелкие тельца Гассаля.
На 7 сутки морфологическое исследование не проводилось, т.к. часть животных пало, остальные были забиты на первые сутки опыта.
Доза бификола 5 ОЕ (2,5 ОЕ В. bifidum шт. 1 + 2,5 ОЕ Е. coli шт. М-17).
При введении 5 ОЕ на 1 сутки погибла 1 мышь, оставшиеся животные были клинически здоровы.
У погибшей мыши выявлено паразитарное поражение печени.
У остальных животных после введения препарата в дозе 5 ОЕ были обнаружены макро- и микроскопические изменения по характеру аналогичные, описанным для дозы 10 ОЕ, но степень их выраженности была значительно ниже.
На 7 сутки морфологическое исследование не проводили, т.к. часть животных пала, а остальные были забиты на первые сутки опыта.
Пероральное введение Доза бификола 60 ОЕ (20 ОЕ В. bifidum шт. 1 + 40 ОЕ Е. coli шт. М-17)
Через сутки после введения бификола все животные оставались клинически здоровыми.
При макроскопическом изучении внутренних органов патологических изменений не обнаружено.
При микроскопическом исследовании в легких на фоне умеренного полнокровия отмечали небольшие очаги эмфиземы (рис. 6.11). В печени наблюдали очаговые дистрофические изменения в гепатоцитах (рис. 6.12) и образование лимфо-гистоцитарных узелков по ходу портальных трактов. Органы иммунной системы (тимус, селезенка, лимфоузлы) сохраняли обычную структуру. В целом морфологическая картина во внутренних органах мало отличалась от таковой у контрольных животных.
Через 7 суток после перорального введения смоделированного бификола в дозе 60 ОЕ все животные на протяжении опыта оставались клинически здоровыми.
При макроскопическом исследовании внутренних органов патологических изменений не выявлено.
При микроскопическом изучении внутренних органов отмечено умеренное полнокровие печени, селезенки, небольшие дистрофические изменения в гепатоцитах. Органы иммунной системы (тимус, селезенка, лимфоузлы) сохраняли обычную структуру. В ЦНС и других внутренних органах изменения отсутствовали.
