Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава I. Механизмы устойчивости бактерий к антибиотикам 8
§ I. Биохимические основы устойчивости 8
§ 2. Генетические основы устойчивости II
Глава П. Общая характеристика механизмов антибактериального действия тетрациклинов 14
Глава Ш. Транспорт антибиотиков-тетрациклинов в
клетки чувствительных бактерий 17
Глава ІУ. Сравнение механизмов устойчивости к тетра циклинам, определяемой плазмидными и хромосомными детерминантами 25
§ I. Генетические основы устойчивости к тетра циклинам 25
§ 2. Устойчивость к тетрациклинам, связанная с
процессом их транспорта 30
§ 3. Устойчивость к тетрациклинам на основе
изменения аппарата трансляции 33
§ 4. Белки, связанные с устойчивостью к тетрациклинам , и их функции 35
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава I. Объекты и методы исследования 39
§ I. Характеристика использованных в работе микроорганизмов. Условия культивирования 39
§ 2. Осмотический шок клеток " D " Стр.
§ З. Получение сферопластов 4-І
§ 4-. Получение мембранных везикул с нормальной ориентацией мембраны 4-2
§ 5. Получение мембранных везикул с обратной ориентацией мембраны 4-3
§ б. Разделение везикул с разной ориентацией мембран с помощью сополимера конканавалина А и альбумина 4-3
§ 7. Определение поглощения %-тетрациклина, С-глицина и х ч-аргинина интактными клетками, клетками после осмотического шока, сферопластами и везикулами с нормальной и
обратной ориентацией мембраны 4-5
§ 8. Определение поглощения тетрациклина флуориметрическим методом 4-7
§ 9. Концентрирование белков, освобождающихся после осмотического шока 4-8
Глава П. Роль неорганических катионов в поглощении тетрациклина чувствительными штаммами Е. coli 50
§ I. Транспорт тетрациклина клетками Е. coli J-62 50
§ 2. Влияние разобщителя карбонилцианид-м-хлор фенилгидразона (КФГ) на эффект катионов 61
§ 3. Поглощение тетрациклина сферопластами и клетками Е. coli J-62 после осмотического
шока 68
Глава Ш. Особенности поглощения тетрациклина клетками устойчивых штаммов Е. coli - 4 Стр.
§ I. Поглощение тетрациклина интактньши клетками устойчивых штаммов Е. coli 76
§ 2. Сравнение поглощения тетрациклина интактньши клетками устойчивого штамма Е. coli J-62 (R222), клетками после осмотического шока и сферопластами 82
Глава ІУ.Транспорт %-тетрациклина в мембранных везикулах из чувствительного и устойчивого штаммов Е. coli 90
§ I. Поглощение %-тетрациклина везикулами с нормальной ориентацией мембраны, полученньми из чувствительного штамма Е. coli J-62 90
§ 2. Поглощение %-тетрациклина везикулами с обратной ориентацией мембраны, полученньми
из клеток штамма Е. coli J-62(R222) ДО и после индукции 92
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 99
ВЫВОДЫ 108
ЛИТЕРАТУРА НО
Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема лекарственной устойчивости микроорганизмов стоит перед исследователями уже несколько десятилетий. Она приобрела особую остроту в связи с широким применением антибиотиков в медицине и народном хозяйстве. Высокая скорость распространения устойчивости среди микроорганизмов приводит к значительному снижению эффективности многих лекарственных препаратов.
Для борьбы с устойчивостью микроорганизмов к антибиотикам необходимо знать ее биохимические, молекулярные и генетические основы. За последние годы достигнут большой прогресс в понимании механизмов устойчивости бактерий ко многим антимикробным препаратам, однако устойчивость к тетрациклинам стала настоящим камнем преткновения для исследователей, хотя определенный прогресс достигнут и в этой области. Сложность проблемы заключается не только во множественном воздействии антибиотиков этой группы на метаболизм бактериальной клетки, но также в том, что тетрациклины не имеют достаточно выраженного структурного сходства ни с одним из известных питательных веществ, важных для клетки, и тем не менее активно накапливаются или выделяются бактериями. Механизмы поступления тетрациклинов в бактериальные клетки и удаления из них этих антибиотиков известны лишь в общих чертах. Ответы на вопросы, касающиеся структуры и функционирования транспортных систем для тетрациклинов у чувствительных и устойчивых бактерий, во многом гипотетичны. Не выяснен также до конца вопрос о форме сопряжения транспорта тетрациклина с энергией метаболизма, хотя большинство исследователей сходится во мнении, что для этого необходим трансмембранный электрохимический градиент протонов.
Отмечен стимулирующий эффект некоторых одновалентных неорганических катионов на поглощение хлортетрациклина клетками бактерий. Однако детального изучения эффекта катионов на транспорт те-трациклинов у чувствительных и устойчивых штаммов, с целью выяснения возможных механизмов действия катионов, не проводилось.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в сравнительном изучении транспорта тетрациклина у чувствительных и устойчивых штаммов Е. coli и выяснении характера сопряжения транспорта антибиотика с энергией метаболизма, а также в выяснении возможных механизмов действия одновалентных неорганических катионов на процесс транспорта тетрациклина у этих штаммов.
Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:
- сравнение эффекта катионов на поглощение тетрациклина клетками чувствительных и устойчивых штаммов Е. coli с применением радиоизотопного и флуоресцентного методов;
- сравнительное изучение транспорта тетрациклина интактными клетками чувствительных и устойчивых штаммов Е. coli , клетками после осмотического шока, сферопластами, а также мембранными везикулами с нормальной и обратной ориентацией мембраны;
- для выяснения возможности существования раздельных транспортных систем, осуществляющих вход тетрациклина в клетки
Е. coli J-62(R222) и выход антибиотика после индукции изучал-ся выход антибиотика из предварительно насыщенных им мембранных везикул с обратной ориентацией мембраны.
Научная новизна и значимость работы. В работе было впервые проведено сравнительное изучение влияния катионов К+ и щ на поглощение тетрациклина интактными клетками чувствительных и устойчивых штаммов Е. coil , а также клетками после осмотического шока, сферопластами и мембранными везикулами с прямой и обратной ориентацией мембраны, полученными из клеток этих штаммов.
При изучении выхода тетрациклина из насыщенных антибиотиком мембранных везикул с обратной ориентацией мембраны, полученных из индуцированных клеток Е. coli J-62(R222) было показано, что у клеток данного штамма в процессе индукции снижается сродство к тетрациклину транспортной системы, участвующей в поглощении антибиотика до индукции ( 1 модифицированной системы с 1,3 мМ). Транспортная система, осуществляющая выброс антибиотика из клеток, видимо, синтезируется de novo. v
Существенную роль в энергообеспечении процесса поглощения тетрациклина клетками чувствительного штамма Е. coli J-62 играет дрН.
Практическая значимость работы. Понимание механизмов, приводящих к увеличению поглощения антибиотиков-тетрациклинов бактериями, имеет огромное значение при получении новых высокоактивных производных антибиотиков данной группы, а также для повышения активности уже применяемых тетрациклинов. Кроме того, выяснение детальных механизмов поглощения тетрациклинов клетками и сопряжения транспорта с энергией метаболизма представляет большой интерес для разработки научных основ рациональной антибиотикотерапии. Полученные результаты необходимо учитывать при планировании мероприятий по борьбе с устойчивостью бактерий к тетрациклинам.
