Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1.Нуклеазы 12
1.1.1. Нуклеаза Serratia marcescens 13
1.1.2. Нуклеаза Anabaena sp. 19
1.2. Ферменты, участвующие в структурной организации ДНК
(топоизомеразы) 22
1.2.1. ДНК-гираза 23
1.3. Клонирование генов 28
2. Материалы и методы 39
2.1. Материалы исследования 39
2.2. Получение компетентных клеток
2.3. Трансформация компетентных клеток методом теплового шока 41
2.4. Выделение плазмидной ДНК 42
2.5. Электрофорез в агарозном геле 43
2.6. Индукция экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA 44
2.7. ХО -электрофорез в полиакриламидном геле 44
2.8. Определение активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA с помощью индикаторного агара 46
2.9. Определение динамики роста рекомбинантных штаммов Kcoli LK111A и E.coli TGE900 47
2.10. Конструирование референс-плазмидырЕТсосоАтрСт 47
2.11. Реакция рестрикции - 48
2.12. ДНК-лигазная реакция 50
2.13. Амплификация фрагментов гена Ыа с помощью ПНР 50
2.14. Определение минимальной ингибирующей концентрации антибиотика 51
2.15. Определение количества р-лактамазы 51
2.16. Определение частоты спонтанной элиминации плазмид 53
2.17. Статистическая обработка результатов 53
3. Результаты и обсуждение 54
3.1. Получение рекомбинантных штаммов Е. coliLKlllA и Е. coli TGE900 55
3.2. Индукция экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз S.marcescens и Anabaena sp. 57
3.3. Определение активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз S.marcescens и Anabaena sp. с помощью индикаторного агара 59
3.4. Влияние базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз Seiratia marcescens и Anabaena sp. на выживаемость рекомбинантных штаммов Е. coli LKlllXviE. coli TGE900 63
3.5. Определение уровня устойчивости к ампициллину для рекомбинантных штаммов Е. coli LK111А и Е. coli TGE900 68
3.6. Получение референс-плазмидырЕТсосоАтрСт 73
3.6.1. Конструирование референс-плазмиды рЕТсосоАтрСт на основе плазмиды рЕТсосоСт 74
3.6.2. Определение дозы гена Ыа в рекомбинантном штамме E.coli DH5a рЕТсосоАтрСт 16
Ъ.1. Определение количества генов Ыа в рекомбинантных штаммах E.coli LK111X и E.coli TGE900 80
3.8. Определение стабильности наследования плазмид pHisNucSma и pHisNucA в рекомбинантных штаммах Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 87
3.9. Определение устойчивости рекомбинантных штаммов E.coli LK11 IX и Е. coli TGE900 к антибиотикам ингибиторам репликации ДНК 93
Заключение 100
Выводы 105
Список использованных источников литературы 1
- Нуклеаза Anabaena sp.
- Трансформация компетентных клеток методом теплового шока
- Индукция экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз S.marcescens и Anabaena sp.
- Конструирование референс-плазмиды рЕТсосоАтрСт на основе плазмиды рЕТсосоСт
Введение к работе
Актуальность проблемы. Значительный прогресс в производстве ряда важных для человека белков в промышленных масштабах был достигнут благодаря применению генно-инженерных методов для создания соответствующих рекомбинантных микроорганизмов. Сверхсинтез белка в таких микроорганизмах может осуществляться как в результате повышения количества копий гена в клетке, так и в результате повышения интенсивности его транскрипции. Однако до настоящего времени нет общей теории, позволяющей предсказать уровень экспрессии того или иного гена в гетерологичной клетке, а большинство используемых в настоящее время генно-инженерных конструкций допускают слабую экспрессию клонированного гена даже в присутствии репрессора. В результате такой экспрессии происходит синтез репрессируемого белка в небольших количествах – так называемый базальный уровень экспрессии гена [Bahar et al., 2011].
В последние годы эндонуклеазы Serratia marcescens (NucSma) и Anabaena sp. (NucA) находят широкое применение в биохимии, молекулярной биологии, медицине и сельском хозяйстве. Эти ферменты принадлежат к одному семейству родственных эндонуклеаз, активные сайты которых имеют одинаковую высококонсервативную аминокислотную последовательность, так называемый DRGH-мотив [Pingoud et al., 1999]. К настоящему времени изучено большинство функционально значимых аминокислотных остатков в DRGH-мотиве, описаны пространственная структура и механизм действия данных ферментов [Meiss et al., 1998; Chen et al., 2009]. Хотя на сегодняшний день эндонуклеазам NucSma и NucA приписывается лишь трофическая функция, но известно, что другие представители этого семейства эндонуклеаз принимают участие в репликации, репарации и рекомбинации ДНК [Dake et al., 1988; Ruiz-Carillo et al., 1993; Rangarajan et al., 2002]. Также было показано, что экзогенные ДНКаза I и эндонуклеаза NucSma в малых дозах усиливают пролиферативные процессы в микробной клетке, а именно синтез ДНК и деление клеток [Куприянова-Ашина, 1991]. К настоящему времени гены эндонуклеаз NucSma и NucA проклонированы в клетках Escherichia coli [Ball et al., 1987; Гимадутдинов и др., 1993; Meiss et al., 1998], однако до сих пор не известно, как базальный уровень экспрессии генов эндонуклеаз NucSma и NucA влияет на свойства гетерологичных клеток.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы – определить влияние базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз Serratia marcescens (NucSma) и Anabaena sp. (NucA) на свойства рекомбинантных штаммов Escherichia coli.
В соответствие с данной целью были поставлены следующие задачи:
-
Определить наличие базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA в рекомбинантных штаммах E. coli LK111 и E. coli TGE900.
-
Сконструировать референс-плазмиду с известным числом копий для косвенного определения количества содержащихся в рекомбинантных штаммах E. coli LK111 и E. coli TGE900 генов bla по количеству синтезируемой клетками -лактамазы.
-
Установить зависимость между количеством генов bla в плазмидах, количеством синтезируемой b-лактамазы, уровнем устойчивости к ампициллину и активностью исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов в рекомбинантных штаммах E. coli LK111 и E. coli TGE900.
-
Изучить влияние базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA на выживаемость рекомбинантных штаммов E. coli LK111 и E. coli TGE900.
-
Установить влияние базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA на стабильность наследования плазмид pHisNucSma и pHisNucA в рекомбинантных штаммах E. coli LK111 и E. coli TGE900.
-
Установить зависимость уровня устойчивости рекомбинантных штаммов E. coli LK111 и E. coli TGE900 к ингибиторам репликации ДНК от активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов.
Научная новизна работы. Впервые показано, что величина базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA зависит как от клетки-хозяина, так и от плазмиды. Установлено, что базальный уровень экспрессии генов исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA оказывает положительное воздействие на выживаемость бактерий. Получена референс-плазмида рЕТсосоAmpCm для косвенного определения количества генов bla по количеству синтезируемой бактериальной клеткой -лактамазы. Установлено, что в клетках рекомбинантных штаммов E. coli LK111 и E. coli TGE900 количество генов bla в плазмидах pHisNucSma и pHisNucA зависит от активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов. Впервые показана возможность участия эндонуклеаз NucSma и NucA в репликации плазмидной ДНК в рекомбинантных штаммах E. coli.
Научно-теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в работе результаты вносят вклад в понимание способов регуляции экспрессии клонируемого гена в гетерологичной клетке и возможностей достижения сверхсинтеза его продукта. Полученные данные можно использовать для дальнейших исследований в области промышленной микробиологии для оптимизации синтеза эндонуклеаз NucSma и NucA рекомбинантными штаммами. Встраивание под сильный промотор гена клонируемого белка в одну плазмиду с геном исходного варианта эндонуклеазы NucSma в результате их совместной транскрипции в рекомбинантном штамме E.coli TGE900 даст возможность получать данный белок в промышленных масштабах. Сконструированная в данной работе референс-плазмида может использоваться для косвенного определения количества генов bla в клетках микроорганизмов, а, следовательно, и количества копий плазмид, содержащих эти гены. Результаты исследования и примененные в работе методические приемы можно использовать при проведении практических и лекционных занятий по микробиологии и генетике микроорганизмов для студентов-биологов.
Положения, выносимые на защиту:
-
Увеличение активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов повышает устойчивость рекомбинантных штаммов E. coli LK111 и E. coli TGE900 к ампициллину.
-
С увеличением активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов увеличивается количество плазмид pHisNucSma и pHisNucA в клетках рекомбинантных штаммов E. coli LK111 и E. coli TGE900.
-
Экспрессия генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA на базальном уровне оказывает положительное влияние на выживаемость рекомбинантных штаммов E. coli LK111 и E. coli TGE900.
-
С увеличением активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов в рекомбинантных штаммах E. coli LK111 и E. coli TGE900 плазмиды pHisNucSma и pHisNucA наследуются более стабильно.
-
Увеличение активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов повышает устойчивость рекомбинантных штаммов E. coli LK111 и E. coli TGE900 к налидиксовой кислоте.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007); II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008); First Interuniversity Conference on Modern Biology «Building the Future in Biology «Bio-News»» (Kazan, 2008); II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009); V съезде вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009); научно-практической конференции «Становление и достижения биохимической школы Казанского университета» (Казань, 2009); 2-ой Московской международной конференции «Молекулярная филогенетика MolPhy-2» (Москва, 2010); конференции «Наука в информационном пространстве» (Днепропетровск, 2010)
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 4 статьи, из которых 2 – в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит 35 рисунков и 5 таблиц. Список литературы включает 168 источников, из них 135 зарубежных.
Нуклеаза Anabaena sp.
Бактерии Serratia marcescens впервые описал в 1819 г. итальянский бактериолог Б. Бизио [Thayer, 1966]. Подвижная грамотрицательная бактерия S. marcescens относится к семейству энтеробактерий {Enterobacteriaceae), является факультативным анаэробом. S. marcescens представляет собой мелкие палочки размером 0,9-2,0x0,5-0,8 мкм [Aucken et al., 1997], образующие интенсивный красный пигмент - продигиозин, имеющий пиррол-дипирол-метиленовую основу [Williamson et al., 2006], а непигментированные бактерии вызывают токсический сепсис [Sleigh, 1983]. Обитает S. marcescens в почве, воде, на грибах, насекомых и растениях в интервале температур 5-40С и значениях рН 5-9 [Hejazi et al., 1997], отдельные штаммы могут образовывать капсулу [Aucken et al., 1997]. Нередко бактерии S. marcescens можно обнаружить в кишечнике человека и животных [Hejazi et al., 1997], где они синтезируют различные внеклеточные гидролазы, которые расщепляют макромолекулы пищи: нуклеотидазу, фосфолипазу А, липазу, хитиназы, протеазы, щелочную фосфатазу и эндонуклеазу [Лещинская и др., 1963, 1968]. В ряде работ было доказано, что агенты, вызывающие блокировку репликации (митомицин С, налидиксовая кислота) и SOS-ответ клетки на повреждение ДНК, индуцируют синтез эндонуклеазы S. marcescens (NucSma) вне зависимости от механизма их действия [Ball et al., 1990; Юсупова и др., 1991, 1993].
Как известно, функционально независимые субъединицы NucSma размером по 26 kDa каждая (рис. 1) образуют димер [Филимонова и др., 1998; Chen et al., 2009], что позволяет нуклеазе гидролизовать высокомолекулярные нуклеиновые кислоты даже при очень низкой концентрации фермента и субстрата [Franke et al., 1999]. Участок димеризации, как было определено, находится в карбокситерминальном домене белка [Friedhoff et al., 1996].
Установлено, что существует две изоформы NucSma: Sml и Sm2 [Filimo-nova et al., 2003]. Различие изоформ по специфичности к азотистым основаниям (основным компонентом мононуклеотидной фракции, полученной с помощью Sml, был ГМФ, Sm2 - УМФ) может быть связано с их различием в iV-концевом фрагменте: у изоформы Sml отсутствуют три iV-концевых аминокислотных остатка, что, вероятно, изменило заряд iV-концевого домена и вызвало взаимное смещение N- и С-концевых доменов, достаточное для изменения расстояния между Arg87 и Argl31, расположенных в разных доменах. А поскольку эти аминокислотные остатки ответственны за связывание субстрата нуклеазой, то изменение расстояния между ними могло повлечь изменение в специфичности фермента [Филимонова и др., 1996].
Было показано, что центральная часть молекулы NucSma представлена 6 плоскими антипараллельно сложенными (3-структурами. Над ними расположен участок, образованный длинной структурно разупорядоченной петлей, которая пересекает Р-структуры и связывается с их третьей и четвертой цепями. Эта петля содержит длинную перекрученную а-спираль, которая находится между 116 и 135 аминокислотными остатками. Наличие в а-спирали преобладающего положительного заряда позволяет предполагать, что именно данная область ответственна за взаимодействие фермента с субстратом [Miller et al., 1996].
Активный сайт NucSma характеризуется DRGH-мотивом [Pingoud et al., 1999], типичным для этого семейства нуклеаз (рис. 2). Он содержит крайне важный гистидин, His89, который, по-видимому, действует как главное основание в образовании активного нуклеофила, гидролизующего фосфодиэфир-ную связь [Chen С. et al., 2009]. Для нуклеолитической активности ферменту требуются двухвалентные металл-ионы Mg2+ или Мп2+ [Filimonova et al., 2003], которые связываются аминокислотным остатком Asnll9. Металл-ионный кофактор участвует в поляризации Р-0-связи, что делает фосфор доступным для нуклеофильной атаки, и вместе с аминокислотным остатком Arg57 стабилизирует промежуточный продукт в переходном состоянии. Остаток Glul27, в свою очередь, участвует в протонировании удаляемой группы [Friedhoffet al., 1996; Chen С. et al., 2009].
NucSma является в значительной степени неспецифической эндонуклеа-зой, которая разрезает двунитевые ДНК и РНК с образованием 5 - фосфори-лированных олигонуклеотидов [Ball et al., 1992; Caballero et al., 2009]. Как в одноцепочечной, так и в двуцепочечной ДНК в первую очередь расщепляются СС-богатые районы, образующие структуры /1-типа, в то время как последовательности, обогащенные AT парами и принимающие конформацию В-ДНК, гидролизуются гораздо медленнее [Meiss et al., 1995; Chen et al., 2006]. Также полирибонуклеотиды, для которых характерна 4-конформация, расщепляются быстрее, чем имеющие конформацию спирали 5-типа дезоксири-бонуклеотиды [Meiss et al., 1999]. ДНК/РНК гибриды, в свою очередь, представляют собой отличные субстраты для гидролиза NucSma потому, что гибридный дуплекс проявляет общую А-подобную конформацию [Gyi et al., 1996].
С эволюционной точки зрения субстратные предпочтения NucSma обоснованны, так как этот высокоактивный фермент способен к взаимодействию как с РНК, так и с ДНК, образуя предшественников для клеточного синтеза нуклеиновых кислот [Беляева и др., 1976; Pingoud et al., 1999]. Известно, что двунитевая РНК принимает общую Л-конформацию, тогда как двунитевая ДНК может существовать в различных конформациях, включая и Л-конформацию, в зависимости от последовательности нуклеотидов и от условий среды (например, при низкой концентрации воды как в естественной среде обитания почвенной бактерии S. marcescens) [Conte et al., 1997]. Для эффективного связывания как РНК, так и ДНК у фермента должен быть такой активный сайт, который связывает нуклеиновые кислоты в А-конформации лучше, чем в -конформации [Meiss et al., 1999].
Внутриклеточная нуклеаза, которая накапливается в клетках 5 . marcescens в экспоненциальной фазе роста, локализуется, прежде всего, в периплазме или мембране потому, что она ферментативно активна. Активная нуклеаза содержит две дисульфидные связи, которые не должны формироваться в малом объеме цитоплазмы и если бы сформировались, то были бы токсичными для клетки. Поэтому любая активная нуклеаза должна быть перемещена из цитоплазмы [Филимонова и др., 1980; Ball et al., 1992; Caballero et al., 2009].
В клетке NucSma изначально синтезируется в виде белка-предшественника, состоящего из 266 аминокислотных остатков, на NH2-конце которого находится сигнальный пептид размером в 21 аминокислотный остаток. При перемещении белка-предшественника в периплазму происходит отщепление сигнальной последовательности [Friedhoff et al., 1994b, 1996; Caballero et al., 2009]. Хотя NucSma и имеет типичные vV-концевые сигнальные последовательности, очень немного известно о молекулярных механизмах, вовлеченных в ее внеклеточную секрецию. Синтез нуклеазы координирование регулируется в зависимости от фазы роста: нуклеаза появляется в среде лишь тогда, когда клетки начинают входить в стационарную фазу роста [Лещинская и др., 1991].
Трансформация компетентных клеток методом теплового шока
В работе были использованы штаммы Е. coli LK11IX (rk mk+, thi-1, thr-1, ІеиВб, tonA21, supE44, lacPYZAM15, Hfr, Amp\ Ґ), в хромосоме которого находится ген белка-репрессора С1 фага X; Е. coli TGE900 {su-1, ilv-1, Amp", Ьіо[Ас1857АВапіАН1]), содержащий в хромосоме термочувствительный му-тантный ген белка-репрессора C1S51 фага X [Friedhoff et al., 1994а]; Е. coli DH5a(cp80d, lacZAMIS, endAl, recAl, hsdR17, supE44, thi-1, gyrA, relAl, Amp3, EA [lacZYA-argE]) [Gibert et al., 1990], предназначенный для экспрессии токсичных трансгенов. Плазмиды pHisNucAwt, pHisNucATrpl59Ala, pHisNucA ArgJ22Ala, pHisNucAHis 124Ala содержат гены исходного и мутантных вариантов эндонуклеазы NucA, а также ген устойчивости к ампициллину Ыа (рис. 12) [Meiss et al., 2000]. Плазмиды pHisNucSmawt, pHisNucSmaArg57Ala, pHis-NucSmaHis89Ala, содержат гены исходного и дмутантных вариантов эндонуклеазы NucSma, а также ген устойчивости к ампициллину Ыа (рис. 13). Рефе-ренс-плазмида рЕТсосоАтрСт, используемая в данной работе для косвенного определения количества генов Ыа в других плазмидах, была получена из плазмиды рЕТсосоСт (lacI-pT7lacO-MCST7, RecA", EndAT, F , Amps) (рис. 14) введением гена Ыа [Sektas et al., 2002]. Плазмида pBlueScript SK+ QacPOZ , AmpR) фирмы Stratagem (рис. 15) [McEvoy et al., 1990] использовалась для получения гена Ыа с последующим его клонирование в плазмиду рЕТсосоСт для получения референс-плазмиды рЕТсосоАтрСт. Клетки выращивали на среде LB следующего состава [Sambrook et al., 1989]: гидролизат казеина- 10 г/л; бактериально-дрожжевой экстракт — 5 г/л; NaCl- 10 г/л. бактоагар —15 г/л. Клетки рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 выращивали на среде LB при температуре культивирования 30С. Для созда -linker pUCori Рис. 15. Карта плазмидыpBlueScript SK+ [no: McEvoy et al., 1990]. ния селективных условий в среду добавляли ампициллин в концентрации 100 мкг/мл [Sambrook et al., 1989]. Рекомбинантный штамм E.coli DH5a рЕТсосоАтрСт выращивали на среде LB с добавлением ампициллина в концентрации 50 мкг/мл и 0,2% і глюкозьі (или 0,01% Z-арабйнозы).
Для получения компетентных клеток Escherichia coli бесплазмидных штаммов LK111X и TGE900 использовали стерильный LB-бульон, в который были добавлены следующие компоненты: 10% ПЭГ 3300-8000; 5% объема DMSO;
MgCl2 или MgS04 в конечной концентрации 50 мМ, рН 6,5-6,8. Стерилизовали автоклавированием втечение 1,5 часа при 0,5 атм.
Ночную культуру клеток, выращенную при 30С в 10 мл /,5-бульона, разводили 1:80 до конечного объема 10 мл и выращивали до достижения культурой оптической плотности А59о = 0,5, которую измеряли на ФЭК. Клетки осаждали на центрифуге Эппендорф при 14000 оборотов/мин, супер-натант удаляли, а осадок оставляли во льду на 20 мин. К осадку добавляли 1 мл холодной среды вышеперечисленного состава и ресуспендировали, после чего помещали в лед на 15 мин. Полученную суспензию оликвотировали по 200 мкл в холодные эппендорфы. Далее клетки либо замораживали при -70С, либо сразу трансформировали.
Для трансформации использовали компетентные клетки E.coli бесплазмидных штаммов LK111X и TGE900 и готазмиды pHisNucAwt, pHisNucATrpl59Ala, pHisNucAArgl22Ala, pffisNucAHisl24Ala, pHisNiicSma His89Ala,pHisNucSmaArg57Ala,pHisNucSmawt. К 200 мкл компетентных клеток, находящихся во льду, добавляли 5 мкл плазмидной ДНК, перемешивали и выдерживали во льду 60 мин., после чего клетки подвергали тепловому шоку в течение 2-х минут на водяной бане при температуре 37С для штамма E.coli TGE900 и 42С для штамма E.coli LK111L Далее клетки вновь помещали в лед на 2 мин., затем добавляли 1 мл .LS-бульона и инкубировали при 30С в течение часа. После инкубации культуры перемешивали и высевали по 10 мкл на ZB-arap, содержащий ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Остаток суспензии центрифугировали в течение 30 с на центрифуге Эппен-дорф при максимальных оборотах. Надосадок удаляли неполностью (оставляли не более 100 мкл), осадок ресуспендировали и высевали наіВ-arap, содержащий ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, и инкубировали в течение ночи при 28С. Выросшие колонии, устойчивые к ампициллину, пересевали для использования в дальнейших экспериментах.
В 5 мл LB-бульона, содержащего ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, вносили обновленную культуру клеток рекомбинантных штаммов E.coli LK111X и E.coli TGE900 и выращивали при 30С в течение ночи при интенсивном встряхивании. Ночную культуру осаждали в течение 10 сек. на центрифуге Эппендорф при 14000 оборотов/мин. Полученный осадок ресуспендировали в 150 мкл раствора следующего состава: 50 мМ трис-ЯС/, рН 8,0; 100 мкг/мл РНКазы А.
Культуру выдерживали 5 мин. при комнатной температуре, затем добавляли 200 мкл свежеприготовленного раствора, содержащего: 200мМ№?ОЯ; 1%/мл SDS.
Крайне аккуратно перемешивали без встряхивания и оставляли при комнатной температуре на 5 мин. Затем добавляли 200 мкл З М раствора ацетата калия, рН 5,5, аккуратно перемешивали и оставляли на 10 мин. После чего раствор центрифугировали при комнатной температуре на центрифуге Эппендорф при максимальных оборотах в течение 20 мин. Супернатант переносили в новую пробирку, добавляли 2 объема охлажденного во льду этанола, перемешивали и центрифугировали 30 минут при 14000 оборотов/мин. Надосадок удаляли, а к осадку добавляли 1 мл 70% холодного этанола, перемешивали и центрифугировали 15 мин. при максимальных оборотах. После удаления надосадка пробирку оставляли сохнуть на фильтровальной бумаге до исчезновения запаха спирта. Для растворения плазмидной ДНК к осадку добавляли 70 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис; 10 мМ ЭДТА; рН 8,0).
Индукция экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз S.marcescens и Anabaena sp.
гает 10000 мкг/мл и, соответственно, количество Р-лактамазьг у них таюке увеличивается и составляет 260 ед. Такое увеличение количества синтезируемой Р-лактамазы и уровня устойчивости к ампициллину связано с тем, что появление в среде арабинозы в отсутствии глюкозы переключает репликацию плазмид рЕТсосоСт и рЕТсосоАтрСт с конститутивной точки oriS, контролирующей содержание в клетке плазмиды в количестве одной копии при содержании в среде глюкозы, на факультативную точку oriV, ответственную за многокопийность [Sektas et al., 2002]. Наблюдаемое изменение количества синтезируемой клетками рекомбинантного штамма E.coli DH5a Р-лактамазы в зависимости от содержащегося в среде углеводного субстрата связано с изменением количества копий гена Ыа, так как известно, что существует прямая зависимость между дозой гена Ыа (количеством копий плазмид, содержащих ген Ыа), обуславливающего устойчивость к ампициллину, и количеством синтезируемого фермента р-лактамазы [Uhlin et al., 1977; Ely et al., 1981; Бергквист с соав., 1989].
Чтобы подтвердить изменение количества находящихся в рекомбинант-ном штамме Е. coliDH5a плазмид рЕТсосоАтрСт в зависимости от углеводного субстрата, проводили выделение вектора из одинакового количества клеток данного штамма. Как видно из данных, представленных в таблице 3, рекомбинантный штамм Е. coli DH5a при выращивании на питательной с 0,2% D-глюкозой содержал плазмиду рЕТсосоАтрСт в концентрации 12,1 нг/мкл, а при добавлении в среду 0,01% Z-арабинозы концентрация плазмиднои ДНК увеличилась до 370,6 нг/мкл. Эти данные еще раз подтверждают, что увеличение концентрации плазмиднои ДНК в клетках связано с увеличением количества плазмидных копий.
С этой же целью был проведен электрофоретический анализ плазмиднои ДНК рЕТсосоАтрСт, выделенной из рекомбинантного штамма Е. coli DH5a при выращивании на питательных средах с добавлением разных углеводных субстратов (0,2% D-глюкозы и 0,01% Z-арабинозы). Электрофоррограмма представлена на рисунке 28. Как видно из рисунка 28, при выращивании на среде с добавлением 0,01%) -арабинозы в клетках рекомбинантного штамма Е. coli DH5a содержится гораздо больше плазмиднои ДНК, чем при выращивании тех же клеток на среде с 0,2% D-глюкозой.
На основании полученных результатов можно заключить, что сконструированный в ходе выполнения работы вектор можно использовать в качестве референс-плазмиды для косвенного определения количества плазмид, содержащих ген Ыа, так как была обнаружена прямая зависимость количества находящихся в клетках рекомбинантного штамма Е. coli DH5a плазмидных копий рЕТсосоАтрСт, количества синтезируемой Р-лактамазы и уровня устойчивости к ампициллину от имеющегося в питательной среде углеводного субстрата.
Как уже говорилось ранее, существует прямая зависимость между дозой (количеством копий) гена Ыа, обуславливающего устойчивость к ампициллину, и количеством синтезируемого фермента р-лактамазы [Uhlin et al., 1977; Бергквист с соав., 1989]. В ряде работ также было показано, что увеличение числа копий плазмид, содержащих ген Ыа, ведет к повышению уровня устойчивости к ампициллину [Ely et al., 1981]. Таким образом, изменение уровня устойчивости к ампициллину и количества синтезируемой р-лактамазы может служить косвенным доказательством изменения количества кодирующих данную устойчивость генов. Для проверки вышесказанного проводилось определение количества синтезируемого фермента (3-лактамазы в зависимости от уровня устойчивости к ампициллину для рекомбинантных штаммов E.coli LK111X и E.coli TGE900 при базальном уровне экспрессии генов исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA.
Чтобы выяснить, коррелирует ли изменение уровня устойчивости к ампициллину с изменением количества синтезируемого фермента (3-лактамазы, проводили измерение количества данного фермента в клетках рекомбинантных штаммов Е. coli LK111X и E.coli TGE900. Синтез р-лактамаз у многих видов микроорганизмов может быть выявлен с помощью чувствительных хромогенных тестов, основанных на использовании специальных субстратов, изменяющих окраску в результате расщепления, или на наблюдении реакции, сопряженной с процессом гидролиза р-лактамов. Для определения количества синтезируемой клетками рекомбинантных штаммов Р-лактамазы использовали йодометрический метод определения Р-лактамазной активности, который основан на способности продуктов гидролиза Р-лактамных антибиотиков восстанавливать йод до йодида, вызывая обесцвечивание йодокрах-мального комплекса [Livermore, 1991]. В качестве референс-плазмиды с известным числом копий использовали специально сконструированную для выполнения данной задачи плазмиду рЕТсосоАтрСт. В качестве дополнительного контроля были взяты бесплазмидные штаммы Е. coli LK111X и Е. coli TGE900, чувствительные к ампициллину и, следовательно, не синтезирующие р-лактамазу. Результаты экспериментов представлены в таблицах 4, 5 и на рисунке 29.
Конструирование референс-плазмиды рЕТсосоАтрСт на основе плазмиды рЕТсосоСт
Основным результатом данной работы является установление влияния базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA на свойства рекомбинантных штаммов Escherichia col і.
Посредством температурной индукции рекомбинантных штаммов Е. coli TGE900, содержащих температурочувствительный белок-репрессор СІ857, было установлено, что гетерологичные клетки E.coli подходят для экспрессии на базальном уровне находящихся в плазмидах генов исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA.
Как известно, большинство используемых в настоящее время генетических систем контролируемой транскрипции допускают слабую (базальную) экспрессию клонированного гена даже в присутствии белка-репрессора [Herman-Antosiewicz et al., 2001; Bahar et al., 2011]. Предположив существование экспрессии находящихся в плазмидах генов исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA даже в присутствии белка-репрессора, выполнение экспериментов было начато с определения базального уровня экспрессии генов данных нуклеаз в рекомбинантных штаммах Е. coli LK111X и Е. coli TGE900. Для этого сначала определяли нуклеазную активность не подвергшихся температурной индукции рекомбинантных штаммов Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 с использованием метода индикаторных сред [Meiss et al., 2001]. Выбор этого метода основывался на его высокой чувствительности и относительной простоте выполнения. Проведенные эксперименты показали наличие нуклеазной активности в исследуемых штаммах, то есть результаты этих экспериментов указывают на экспрессию генов исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA в рекомбинантных штаммах Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 даже в присутствии белка-репрессора из-за неполного ингибиро-вания белком-репрессором промоторов этих генов. Полученные результаты по определению нуклеазной активности рекомбинантных штаммов вполне согласуются с литературными данными [Franke et al., 1999; Friedhoff et al., 1994b; Friedhoff et al., 1996; Meiss et al., 1998].
Известно, что векторная ДНК сообщает клетке-хозяину новые свойства, дающие ей селективные преимущества, но сверхсинтез продукта чужеродного гена, а также сам продукт, могут оказывать негативное влияние на скорость роста и деление клеток [Goldwin et al., 1979]. Поэтому необходимо было изучить влияние плазмид pHisNucSma и pHisNucA, содержащих гены исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA, на выживаемость рекомбинантных штаммов E.coli LKlllX и E.coli TGE900. В результате проведенных экспериментов было установлено, что экспрессия клетками рекомбинантных штаммов E.coli LKlllX и E.coli TGE900 ферментативно активных вариантов NucSma и NucA (за исключением чрезвычайно токсичной NucA дикого типа) обладает положительным эффектом на выживаемость рекомбинантных штаммов. Таким образом, было сделано предположение, что данные нуклеа-зы стимулируют деление клеток рекомбинантных штаммов, что, скорее всего, связано с возможным участием эндонуклеаз NucSma и NucA в репликации ДНК в бактериальной клетке.
Цикл экспериментов по выяснению характера взаимодействия плазмид, содержащих гены исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA, и клеток штаммов-хозяев был начат с определения уровня устойчивости к ампициллину - агенту, селектирующему используемые в данной работе плазмиды. Для этого применяли метод градиентного агара, содержащего различные концентрации ампициллина [Barth et al., 1978]. Результаты экспериментов показали, что существуют различия в устойчивости к ампициллину в зависимости от активности исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA, гены которых экспрессируются в данных штаммах на базальном уровне. Учитывая имеющиеся в литературе данные о существовании прямой зависимости между дозой (количеством копий) гена Ыа, обуславливающего устойчивость к ампициллину, и количеством синтезируемого фермента р-лактамазы [Uhlin et al., 1977; Бергквист с соав., 1989], было выдвинуто предположение, что выявленные различия в уровнях устойчивости к ампициллину у рекомбинантных штаммов Е. coli LK11U и Е. coli TGE900 могут служить косвенным доказательством изменения количества кодирующих эту устойчивость генов Ыа.
Для проверки этого предположения, используя метод йодометрического титрования [Perret, 1954], провели измерение количества синтезируемой ре-комбинантными штаммами Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 Р-лактамазы, по количеству которой косвенно судили о количестве содержащихся в клетках плазмид. В качестве референс-плазмиды с известным числом копий использовали сконструированную в данной работе плазмиду рЕТсосоЛтрСт. Анализируя результаты данных исследований в сравнении с имеющимися данными о существовании прямой зависимости между количеством копий плазмид, содержащих ген Ыа, и уровнем устойчивости к ампициллину [Ely et al., 1981], можно заключить, что увеличение количества генов Ыа в клетках ре-комбинантных штаммов Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 происходит из-за увеличения количества плазмид, в которых находятся эти гены, и зависит от активности исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов. Обсуждая возможные причины существования подобной зависимости между активностью нуклеаз и количеством плазмид-ньтх копий, мы склонны считать, что такое изменение количества копий гена Ыа, возможно, связано с участием NucSma и NucA в увеличении количества копий плазмид в ходе репликации в бактериальных клетках, то есть, находясь в гетерологичных клетках Е. coli, NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов сменили свою биологическую функцию, и вместо трофической функции [Franke et al., 1999] стали принимать участие в репликации. Возможность изменения биологической функции нуклеазы в гетерологичной системе клетки уже была отмечена в некоторых работах [Куприянова-Ашина, 1991; Xiao et al., 2007; Balasundaram et al., 2009].
