Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 16
1.1. Основные протективные антигены возбудителя холеры 16
1.1.1. Протективные антегены Vibrio cholerae Ol серогруппы 16
1.1.2. Протективные антигены V. cholerae 0139 серогруппы
1.2. Протективные антигены кишечной палочки 35
1.3. Живые холерные вакцины 39
Собственные исследования 55
ГЛАВА 2. Материалы и методы 55
2.1. Бактериальные штаммы 55
2.2. Питательные среды и реактивы 56
2.3. Методы
2.3.1. Конъюгационные скрещивания 56
2.3.2. Метод популяционного анализа для изучения стабильности на следования плазмид в клетках изучаемых штаммов 57
2.3.3. Скрининг плазмид по методу C.J. Kado, S.T. Liu (1981) 57
2.3.4. Электрофорез белков холерного вибриона в полиакриламидном геле
2.3.5. Реакция маннозорезистентной гемагглютинации (МРГА) 58
2.3.6. Реакция пассивного иммунного гемолиза (РПИГ) и иммунофер ментный анализ (ELISA) з
2.3.7. Электронно-микроскопическое исследование 60
2.3.8. Определение продукции фосфолипазы и растворимой гемагглю-тинин/протеазы 61
2.3.9. Определение безвредности сконструированных штаммов на модельных лабораторных животных 62
2.3.10. Исследование колонизирующей способности созданных диплаз-мидных штаммов 63
2.3.11. Изучение антигенных свойств диплазмидных штаммов 64
2.3.12. Получение адсорбированной антисыворотки к адгезину СРАЯ и В-субъединице холерного токсина
2.3.13. Дот-иммуноанализ (ДИА) 64
2.3.14. Развернутая реакция агглютинации в пробирках для определения титра антител к адгезину СРАЯ в крови иммунизированных животных 66
2.3.15. Иммуноферментный метод (ELISA) 66
2.3.16. Оценка протективности сконструированного штамма Е. coli КМ148 по снижению количества вирулентных вибрионов, прикрепившихся к кишечному эпителию иммунных кроликов 67
2.3.17. Метод RITARD, использованный для определения протективных свойств сконструированных штаммов 68
ГЛАВА 3. Конструирование рекомбинантных штаммов Е. COLI KM148(pIEM3)(pCFAI) и V. Cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI)
3.1. Создание диплазмидного штамма Е. coli М17, содержащего реком бинантные плазмиды с клонированными генами В-субъединицы холерного токсина и адгезина CFA/1 70
3.2. Получение авирулентного диплазмидного штамма V. cholerae 0139 серогруппы, содержащего рекомбинантные плазмиды с клониро ванными генами В-субъединицы холерного токсина и адгезина CFA/I J 76
ГЛАВА 4. Изучение стабильности наследования генов протек тивных антигенов и определение эффективности их экспрессии в созданных штаммах Е. Coli о] KM148(pIEM3)(pCFAI) и V, Cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI)
4.1. Определение стабильности наследования рекомбинантных плаз мид в клетках штаммов Е. coli KM148(pIEM3)(pCFAI) и V. cho
lerae КМ182(pIEM3)(pCFAI) в условиях in vitro и in vivo 81
4.2. Изучение экспрессии введенных генов протективных антигенов в клетках штаммов Е. coli КМ148 и V. cholerae КМ182 83
4.2.1. Определение экспрессии генов В-субъединицы холерного токси на в клетках исследуемых штаммов 83
4.2.2. Определение экспрессии генов адгезина CFA/I в клетках штаммов Е. coli КМ148 и V. cholerae КМ182 89
4.2.3; Изучение влияния чужеродного гена cfal на экспрессию собственных генов протективных антигенов у V. cholerae КМ182 94
ГЛАВА 5. Изучение безвредности, колонизирующей способно сти, антигенных и протективных свойств сконструированных диплазмидных штаммов Е. Coli КМ148 98 (pIEM3)(pCFAI) и V. Cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI)
5.1. Изучение безвредности штаммов Е. coli КМ148 и V. cholerae КМ182 98
5.2. Определение колонизирующей способности исследуемых диплаз мидных штаммов 100
5.2.1. Определение колонизирующей способности штамма кишечной палочки Е. coli КМ148 100
5.2.2. Определение колонизирующей способности штамма холерного вибриона 0139 серогруппы V. cholerae КМ182 103
5.3. Определение антигенных свойств сконструированных диплазмид ных штаммов Е. со//КМ148и V. cholerae КМ182 105
5.3.1. Определение антигенных свойств штамма Е. coli КМ148 по накоплению в сыворотке крови иммунизированных животных антико-лонизирующих и антитоксических антител 105
5.3.2. Определение антигенных свойств штамма V. cholerae КМ182 по на коплению в сыворотке крови иммунизированных животных анти колонизирующих и антитоксических антител 109
5.4. Определение протективных свойств исследуемых штаммов 112
5.4.1. Определение проте ктивности штамма Е. coli КМ148 по снижению количества вирулентных вибрионов, прикрепившихся к кишечному эпителию иммунных кроликов 112
5.4.2. Определение протективных свойств штамма кишечной палочки Е. coli КМ148 методом RITARD 114
5.4.3. Определение протективных свойств сконструированного штамма V. cholerae КМ182 методом RITARD 117
Заключение 120
выводы 127
Список использованных источников литературы
- Протективные антигены V. cholerae 0139 серогруппы
- Электронно-микроскопическое исследование
- Получение авирулентного диплазмидного штамма V. cholerae 0139 серогруппы, содержащего рекомбинантные плазмиды с клониро ванными генами В-субъединицы холерного токсина и адгезина CFA/I J
- Определение колонизирующей способности штамма холерного вибриона 0139 серогруппы V. cholerae КМ182
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Холера, вызываемая Vibrio cholerae биовара эльтор, остается одной из важнейших проблем здравоохранения многих стран Азии, Африки и Америки. Кроме того, продолжают регистрироваться в странах Юго-Восточной Азии вспышки холеры, вызванные V. cholerae 0139 серогруппы [Москвитина ЭА и др., 2004]. При наличии высокого уровня миграции населения, неблагоприятных социально-экономических условий жизни возможность завоза холеры в Российскую Федерацию реально существует. Вышенаписанное диктует необходимость создания современных и надежных отечественных средств и методов профилактики этого заболевания.
К настоящему времени зарубежные и отечественные исследователи разработали ряд живых и неживых холерных вакцин, проверенных на безопасность, иммуногенность и протективность. Среди них следует отметить широко используемые убитую цельноклеточную оральную вакцину WC/rBS с добавлением очищенной В-субъединицы холерного токсина [Holmgren J. et al, 1999; Supplementary information on vaccine safety, 2000] и таблетированную бивалентную химическую вакцину холероген-анатоксин [Наумов А.В. и др., 1992; Лоцманова Е.Ю. и др., 2002], которые, однако, вызывают лишь частичную защиту от холеры. Что касается известных живых холерных вакцин CVD103-HgR и CVD111, то они, характеризуясь высоким уровнем защиты, имеют выраженную остаточную реактогенность, вызывая у ряда вакцинированных развитие легкой диареи [Kaper J.B. et al, 1989; Levine М.М. et al, 1998; Wiederman С. et al, 1998; Taylor D.N. et al, 1999]. Безусловно, очевиден мощный потенциал ДНК-вакцин, но для развития этого направления требуется дальнейшая работа [КарягинаА.С. и др., 2004].
Таким образом, несмотря на попытки многих исследователей в течение более 100 лет создать идеальную холерную вакцину, до сих пор проблема разработки эффективного и безопасного профилактического препарата против холеры остается нерешенной. Отсутствие доступных для нас сведений о сконструированных отечественных живых вакцинных штаммах против холеры, которые были бы не только эффективны, но и безопасны, свидетельствует об актуальности исследований, направленных на получение холерных вакцин нового поколения.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ - сконструировать на основе авирулентных штаммов Escherichia coli и V. cholerae серогруппы 0139 иммуногенные рекомби-нантные штаммы с гомо- и гетерологичными генами основных протективных антигенов для последующего создания на их основе живых оральных холерных вакцин.
1. Сконструировать на основе штаммов Е. coli М17 и V. cholerae 170
серогруппы 0139 диплазмидные штаммы, содержащие гены, кодирующие
биосинтез адгезина CFA/1 и В-субъединицы холерного токсина - основных
протективных антигенов.
-
Изучить стабильность наследования введенных гомо- и гетероло-гичных генов ctxB и cfal, определяющих продукцию протективных антигенов в клетках сконструированных штаммов Е. coli и V. cholerae, и определить эффективность их экспрессии.
-
Провести сравнительный анализ колонизирующей способности между сконструированными диплазмидными штаммами Е. coli KM148(pIEM3)(pCFAI) и V. cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI) и исходными штаммами Е. coli М17 и V. cholerae 170, не содержащими плазмид.
-
На основании клинико-морфологических показателей определить безвредность и изучить иммуногенные и протективные свойства созданных штаммов^1, со/; KM148(pIEM3)(pCFAI) и V. cholerae КМ 182 (pIEM3)(pCFAI).
Впервые для создания живых холерных вакцин был использован новый подход, состоящий в применении в качестве носителя гомо- и гетероло-гичных протективных антигенов безопасного для человека штамма Е. coli М17, на основе которого изготавливается лечебно-профилактический препарат колибактерин.
Установлено, что в сконструированных штаммах Е. coli KM148(pIEM3)(pCFAI) и V. cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI) введенные в составе плазмид клонированные гомо- и гетерологичные гены ctxB и cfal, определяющие биосинтез В-субъединицы холерного токсина и фактора адгезии СРАД - основных протективных антигенов, стабильно наследуются в условиях in vitro и in vivo. Выявленный уровень биосинтеза В-субъединицы холерного токсина и адгезина СТАЛ в клетках диплазмидных штаммов кишечной палочки и холерного вибриона указывает на эффективную экспрессию введенных генов.
Новые данные получены при исследовании колонизирующей активности штаммов Е. coli KM148(pIEM3)(pCFAI) и V. cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI) на модели лабораторных животных (крольчата-сосунки). Установлено, что присутствие в созданных штаммах Е. coli КМ 148 и V. cholerae КМ 182 плазмиды pCFAI обеспечивает повышение их колонизирующей активности, соответственно, в 4000 раз и 1280 раз, по сравнению с исходными штаммамиЕ. соИМПт V. cholerae 170.
Установлено, что сконструированные штаммы обладают выраженными иммуногенными свойствами, вызывая у иммунизированных животных образование в высоких титрах антитоксических и антиколонизирующих антител.
Доказана протективность сконструированных штаммов, которая выразилась в эффективной защите иммунизированных животных от заражения их в высоких дозах (108-109 м.т./мл) вирулентными штаммами холерного вибриона 01 или 0139 серогрупп.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. По результатам работы составлены методические рекомендации: «Конструирование потенциально вакцинных штаммов против диарейных заболеваний», которые одобрены Ученым Советом (протокол № 7 от 23.12.2004 г.) и утверждены зам. директора Рос-НИПЧИ «Микроб».
В Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" депонированы два штамма Е. coli М17 и два штамма V. cholerae 170 с разным набором генов протективных антигенов - В-субъединицы холерного токсина и ад-гезина CFA/I. Указанные штаммы могут быть использованы для решения прикладных и фундаментальных задач.
Получены три патента на изобретения: патент №2232189 «Штамм бактерий Escherichia coli КМ148 - продуцент протективных антигенов, используемых для иммунопрофилактики колибактериоза и холеры» (от 10.07.2004); патент №2238975 «Штамм бактерий Escherichia coli КМ147-продуцент В-субъединицы холерного токсина» (от 27.10.2004), который внесен в базу данных перспективных Российских разработок РОСПАТЕНТа; патент №2236455 «Штамм бактерий Vibrio cholerae КМ168 - основа для конструирования живых вакцин против диарейных заболеваний, вызываемых штаммами Vibrio cholerae 0139» (от 20.09.2004).
Протективные антигены V. cholerae 0139 серогруппы
КАПСУЛЬНЫЙ ПОЛИСАХАРИД V. CHOLERAE 0139 Бенгальские штаммы, в отличие от холерных вибрионов Ol-серогруппы, продуцируют полисахаридную капсулу. Благодаря этой капсуле, клетки штаммов V. cholerae 0139 формируют плотные непрозрачные О-колонии (от англ. opaque -непрозрачный). Спонтанно могут появляться бескапсульные мутанты, образующие прозрачные Т-колонии (от англ. translucent - прозрачный) [Johnson J. A. et al, 1992; Weintraub A., et al., 1994; Comstock L. E. et al, 1995]. И капсульные, и бескапсульные клоны агглютинируются холерной поликлональной 0139-антисывороткой, полученной к 0139-антигену, но титр агглютинации Т-клонов обычно несколько выше. Антисыворотка к очищенной капсуле также реагирует с О- и Т-клонами, но титр реакции с последними заметно ниже.
Получены данные, что поли- и моноклональные антитела к очищенному капсульному полисахариду не взаимодействуют с очищенным 0139-антигеном. Это может свидетельствовать о существенных различиях в составе сравниваемых антигенов. Тем не менее, по данным A. Weintraub et al. (1994) полисахаридная капсула и 0139-антиген имеют в своем составе одни и те же сахара (глюкозу, гептозу, галактозу, колитозу, квинозамин, глюкозамин), отличаясь друг от друга только их количеством. К настоящему времени показано, что капсульный полисахарид состоит из тех же самых повторяющихся единиц гексосахарида, что и 0139-антиген, вследствие чего он несет детерминанты О-специфичности.
В то же время, в отличие от 0139-антигена, имеющего одну или две повторяющиеся единицы гексосахарида, капсула представляет собой полимеризованные О-боковые цепи с мол. массой более 90 kDa, которые, не имея ковалентной связи с коровой областью и липидом А, лежат свободно на поверхности бактериальной клетки [SenguptaD., Boesman-Finkelstein М., Finkelstein R. А.,1996].
Капсульный полисахарид является протективным антигеном, так как при его введении мышатам-сосункам формируются антитела, подавляющие колонизацию [Johnson G. et al.,1996; Kossatczka L. et al, 2000]. Поэтому капсула является важным защитным антигеном, который следует использовать в иммунопрофилактике холеры, вызванной вибрионами 0139 серогруппы.
В биосинтезе полисахаридной капсулы помимо названных выше, генов wbf, кодирующих продукцию 0139 антигена, принимают участие два специфических гена - wb/F (otnA) и wzz (otnB). Первый контролирует удлинение О-цепочки 0139-антигена, второй отвечает за транспорт предшественников капсульного полисахарида через периплазму. Мутации в этих генах приводят к появлению бескапсуль-ных клонов, сохраняющих 0139-антиген [Смирнова Н.И. и др., 1995; Comstok Е. et al., 1995;ЩелкановаЕ.Ю., 1998].
БЕЛКИ ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ В развитии антибактериального иммунитета при холере, вызываемой V. cholerae 0139 серогруппой, принимают участие следующие белки внешней мембраны: - протективный белок с мол. массой 18 kDa, ассоциированный с липополисахари дом; его количество увеличивается при выращивании штаммов in vivo [Pal S. et al., 1996]; - иммунопротективный белок, общий для V.cholerae 01 и 0139 серогрупп, с мол. массой 31 Ша, реагирующий с иммуноглобулинами сыворотки, полученной от больных холерой. Он индуцирует гуморальный и клеточный иммунитет [Kumar S. etal., 2001]; - белок OmpU с мол. массой 38 Ша является главным протективным антигеном у V. cholerae 0139 и 01 серогрупп. Он был выявлен методом иммуноблоттинга с кроличьей антисывороткой, полученной на белки внешней мембраны V. cholerae 0139 серогруппы [Pal S. et al., 1996]. - белок OmpS с мол. массой 43 Ша, общий для холерных вибрионов обеих серогрупп. При его отсутствии уменьшается адгезия и колонизация кишечника мышат-сосунков холерными вибрионами [Bondre et al., 1997].
АДГЕЗИНЫ Одним из основных факторов, отвечающих за формирование антиколонизи-рующего иммунитета при холере, вызванной холерными вибрионами 0139 серогруппы, являются также токсин-корегулируемые пили адгезии - TCP. Они представляют собой пучки жестких волокон, связанных с клеткой [Taylor R.K. et al, 1987] и локализованных на одном из ее полюсов. Основной субъединицей TCP является белок ТсрА с мол. массой 20,5 Ша [Hall R.H. et al, 1993; Waldor M. F., Mekalanos J.J., 1994; Kaper J.B., 1995; Boyd E.F., Waldor M.K., 2002]. Также, как у холерных вибрионов 01 серогруппы, гены tcp V. cholerae 0139 входят в состав VPI. Экспрессия данных генов у холерных вибрионов 0139 серогруппы не отличается от таковой у вибрионов эльтор и происходит в условиях in vivo [Rajanna С, 2003]. В целом, антигенный комплекс V. cholerae 0139 отличается от такого V. cholerae 01 присутствием лишь двух новых поверхностных структур -0139 антигена и полисахаридной капсулы. Что касается других описанных антигенов, то они практически одинаковы у возбудителя холеры 01 и 0139-серогрупп. Исключением является, по-видимому, лишь отсутствие у V. cholerae 0139 продукции нейраминидазы, идентичной таковой холерных вибрионов 01. В пользу этого утверждения говорит тот факт, что с помощью ПЦР-анализа и ДНК гибридизации с зондами было обнаружено, что почти 93% проверенных бенгальских штаммов отличается от холерных вибрионов 01 серогруппы (7% не отличается), присутствием в геноме делетированного VPI-2, не имеющего структурного гена папН, определяющего биосинтез этого важнейшего фермента [Jermyn W.S., Boyd E.F., 2002; Смирнова Н.И., Кутырев В.В., 2004].
Электронно-микроскопическое исследование
Принимая во внимание, что высокая стабильность наследования введенной плазмиды может быть обусловлена интеграцией ее в хромосому, у полученных трансконъюгантов определяли плазмидный состав методом электрофореза в ага-розном геле. Результаты, представленные на рис.2, свидетельствуют, что плазмида рІЕМЗ в клетках Е. coli М17(р1ЕМЗ) находится в автономном состоянии по отношению к хромосоме (дорожки 3-7). Ее молекулярная масса в клетках трансконъюгантов (дорожки 3-7) такая же, как и в клетках донорного штамма Е. coli KS164(pIEM3) (дорожка 2), поскольку положение плазмидной ДНК в геле у сравниваемых штаммов было одинаковым (рис.2).
Для определения экспрессии гена ctxB в чужеродном окружении 100 произвольно выбранных моноплазмидных клонов Е. coli M17Rif(pIEM3) были проверены на продукцию секретируемой В-субъединицы холерного токсина с помощью РПИГ. Выбор метода был обусловлен его простотой и возможностью изучения большого числа штаммов. Кроме того, невысокая чувствительность РПИГ (0,6 мкг/мл) позволяла обнаруживать В-субьединицу только у трансконъюгантов, продуцировавших ее в относительно больших количествах. Полученные данные показали, что проверенные трансконъюганты Е. coli КМ 148 отличались между собой по уровню продукции В-субьединицы холерного токсина, о чем свидетельствовала различная ширина зон лизиса эритроцитов вокруг их макроколоний, которая колебалась от 2,0 до 4,0 мм. В результате был выбран один из трансконъюгантов с наиболее высоким уровнем продукции В-субъединицы по данным РПИГ, что подтвердилось и при оценке биосинтеза этого белка иммуноферментным методом ELISA. Отобранный моноплазмидный штамм получил обозначение . coli КМ147 (табл.2).
Таким образом, плазмида рІЕМЗ, кодирующая В-субъединицу холерного токсина, стабильно сохраняется в клетках E.coli Ml7, находится в автономном состоянии, а входящий в ее состав ген ctxB эффективно экспрессируется.
На втором этапе работы была поставлена задача на основе сконструированного моноплазмидного штамма кишечной палочки КМ 147, содержащего гены В-субъединицы холерного токсина получить диплазмидный штамм, продуцирующий второй протективный антиген — адгезии CFA/I.
Для ее решения в штамм Е. coli КМ147 была введена конъюгативная реком-бинантная плазмида pCFAI, несущая клонированный ген cfal и ген резистентности к триметоприму (Трг). Донором плазмиды был прототрофный штамм Е. coli J53(pCFAl) Трг. В качестве селективной среды использовали LB-arap, содержавший тетрациклин (10 мг/мл) и триметоприм (100 мг/мл). В результате конъюгаци-онных скрещиваний были получены резистентные к тетрациклину (Тсг) и триметоприму (Трг) трансконъюганты. Частота конъюгационного переноса плазмиды pCFAI составила 3 10 6. Изолированные колонии трансконъюгантов после двукратной чистки вновь проверяли по маркерам. Все изученные Трг- клоны были одновременно Кшг и Тсг, что указывало на присутствие в них двух плазмид -pIEM3(TcrKmr) и pCFAI(Tpr).
Поскольку известно, что введение второй плазмиды в бактериальную клетку может привести к интеграции одной из них в хромосому, был проверен плазмид-ный состав штамма Е. coli M17(pIEM3)(pCFAI) с помощью электрофореза в ага-розном геле. Установлено, что в клетках изучаемого штамма обе плазмиды находились в автономном состоянии (рис. 3, дорожки 4-10). 123456789 pCFA/I рІЕМЗ
Электрофоретический анализ трансконъюгантов Е. coli М17, содержащих плазмиды рІЕМЗ и pCFAl, проведенный по методу С. J. Kado и С. Т. Liu (1981). 1 -Е. coli M17(Rif) - исходный штамм; 2-Е. coli KS164(pIEM3) - донорный штамм рІЕМЗ; 3-Е. coli J53(pCFAI) - донорный штамм pCFAI; 4-10 -Е. coli Ml7(pIEM3)(pCFAI) - трансконъюганты.
Таким образом, сконструирован штамм Е. coli M17(pIEM3)(pCFAI), содержащий в составе плазмид клонированные гены В-субъединицы холерного токсина и адгезина CFA/I, и получивший обозначение Е. coli КМ 148.
Получение авирулентного диплазмидного штамма V. cholerae 0139 серогруппы, содержащего рекомбинантные плазмиды с клонированными генами В-субъединицы холерного токсина и адгезина CFA/I
Существующие в настоящее время вакцины против традиционных возбудителей холеры - V. cholerae 01 серогруппы, не могут обеспечить защиту от диареи, вызываемой холерным вибрионом 0139 серогруппы. Отсутствие отечественных живых вакцин против возбудителя холеры новой серогруппы явилось основанием для конструирования нами авирулентного штамма холерного вибриона 0139 серогруппы с высокой продукцией В-субъединицы холерного токсина и фактора коло .77 низации CFA/I, обеспечивающих, как указывалось выше, формирование антитоксического и антиколонизирующего иммунитета, соответственно.
В качестве носителя протективных антигенов был выбран сконструированный Осиным А.В. с соавт.(2002) Н1у" -мутант авирулентного штамма К cholerae 170, выделенного из воды открытыхводоемов Московской области, относящийся:к. 0139 серогруппе. По данным ПЦР его геном лишен основных генов вирулентности ctxA и tcpA, контролирующих, соответственно, продукцию холерного токсина и токсин-корегулируемыхпилей адгезии. Кроме того; у него отсутствовали гены zot и асе, ответственные за продукцию дополнительных холерных токсинов, регуля-торный ген toxT, а также atiRS сайт - специфический участок внедрения в.хромосому фага СТХф, несущего гены с/хАВ; zot± асе: Вместе с тем, в геноме этого штамма присутствовал глобальный ген: регулятор toxR:, ответственный за:регуля-цию экспрессии 20 различных генов, включая и гены протективных антигенов
Получение авирулентного диплазмидного штамма V. cholerae 0139 серогруппы, содержащего рекомбинантные плазмиды с клониро ванными генами В-субъединицы холерного токсина и адгезина CFA/I J
Таким образом, плазмида рІЕМЗ, введенная в клетки штамма V. cholerae 170 сохранялась в них в автономном состоянии. Установлена также эффективная экспрессия клонированного гена ctxB, входящего в состав указанной плазмиды.
На втором этапе нашей работы был получен диплазмидный штамм V. cholerae 170, содержавший, помимо указанной рекомбинантной плазмиды рІЕМЗ (KmrTcr) с геном ctxB, вторую плазмиду - pCFAI (Трг) с геном cfal, кодирующий адгезии CFA/I. Для решения этой задачи были проведены конъюгационные скрещивания штамма Е. coli J53(pCFAI) - донора плазмиды pCFAI, с полученным мо-ноплазмидным штаммом V. cholerae КМ 168. Селективной средой служил агар LB с добавлением триметоприма и тетрациклина. Частота образования ТсгТрг транс-коньюгантов составляла 5х10"6. После двукратной чистки отобранных трансконью-гантов на селективной среде, изолированные колонии вновь проверяли по маркерам. Все изученные Трг-клоны оказались одновременно Тсг и Ктг, что указывает на присутствие в клетках штамма V. cholerae двух плазмид - рІЕМЗ (TcrKmr) и pCFAI (Трг). Для дальнейшей работы был отобран один диплазмидный трансконъюгант, получивший обозначение V. cholerae КМ182.
Наличие обеих плазмид (рІЕМЗ и pCFAI) в сконструированном нами штамме V. cholerae было подтверждено определением плазмидного состава нескольких трансконъюгантов с помощью электрофореза в агарозном геле (рис.5). Оказалось, что в клетках изученных трансконъюгантов обе плазмиды (рІЕМЗ и pCFAI) присутствовали в автономном состоянии (рис.5, дорожки 3,4). pCFAI рІЕМЗ
Полученные штаммы Е. coli КМ148 и V. cholerae КМ182 будут представлять ценность как кандидаты в живые вакцины лишь при условии стабильного сохранения и эффективного выражения введенных плазмидных генов протективных антигенов - В-субьединицы холерного токсина и адгезина CFA/1. В этой связи изучение особенностей наследования и экспрессии двух рекомбинантных плазмид с генами протективных антигенов в клетках кишечной палочки и холерного вибриона 0139 серогруппы представляет особый интерес.
Известно, что бактериальные клетки, содержащие плазмиды, нуждаются в дополнительных энергетических затратах, поэтому в неселективных условиях значительно выше выживаемость бесплазмидных клонов по сравнению с плазмидны-ми [Бельков В.В., 1983]. В этой связи была определена стабильность наследования обеих плазмид в клетках штаммов Е. coli КМ148 и V. cholerae КМ182 в неселективных условиях. С этой целью по пять независимо отобранных диплазмидных клонов каждого штамма выращивали в бульоне без антибиотиков в течение 24-72 ч, а изолированные колонии, выросшие на агаре (по 200 от каждого клона), проверяли по соответствующим маркерам. Было установлено, что все проверенные трансконъюганты Е. coli КМ148 и V. cholerae КМ182 имели фенотип KmrTcrTpr. Полученные данные свидетельствуют о том, что сконструированные диплазмидные штаммы Е. coli КМ 148 и V. cholerae КМ 182 сохраняли при выращивании в неселективных условиях на протяжении 48-144 генераций обе плазмиды в 100% случаях. Следовательно, полученные диплазмидные штаммы стабильно наследуют в условиях in vitro введенные плазмиды с клонированными генами протективных антигенов.
В связи с большой важностью вопроса о стабильности наследования обеих плазмид в клетках штаммов Е. coli КМ148 и V. cholerae КМ182 в условиях in vivo, нами определялось наследование указанных плазмид при пассировании содержащих их штаммов в организме лабораторных животных (в опыте было использовано по 12 крольчат-сосунков на каждый штамм). Крольчат-сосунков внутрижелу-дочно (по 4 крольчонка на каждый штамм) или внутрикишечно (по 8 крольчат на каждый штамм) заражали этими штаммами в дозе 1 109 м.т./мл. Через 24 и 48 ч животных умерщвляли хлороформом, а гомогенат тканей толстого и тонкого кишечника высевали на полноценный агар с рифампицином (для кишечной палочки) или спектиномицином (для холерного вибриона 0139 серогруппы). У 300 выросших колоний проверяли наличие плазмидных маркеров резистентности к соответствующим антибиотикам. В результате было установлено, что после 24 и 48 ч пребывания в кишечнике крольчат обе плазмиды рІЕМЗ и pCFAl сохранились в клетках изученных штаммов в 100% случаях.
Таким образом, сконструированные диплазмидные штаммы Е. coli КМ148 и V. cholerae КМ 182 в условиях in vitro и in vivo стабильно наследовали обе плазмиды. 4.2. Изучение экспрессии введенных генов протективных антигенов в клетках штаммов Е. coli КМ 148 и V. cholerae КМ182
Для определения продукции В-субъединицы холерного токсина диплазмид-ным штаммом Е. coli КМ 148 использовали реакцию пассивного иммунного гемолиза (РПИГ) и иммуноферментный метод (ELISA).
Проверку популяционного состава созданного штамма Е. coli КМ 148 относительно продукции В-субьединицы СТ проводили путем рассева его на плотной среде. Было получено 900 изолированных колоний, у которых уровень биосинтеза В-субъединицы холерного токсина был определен с помощью РПИГ.
Определение колонизирующей способности штамма холерного вибриона 0139 серогруппы V. cholerae КМ182
В связи с тем, что до сих пор ни одна из известных холерных вакцин пока не соответствует идеальному профилактическому препарату, проблема разработки эффективных и безопасных вакцинных штаммов остается актуальной.
В результате развития генной инженерии появилась возможность конструировать живые вакцины путем введения в клетки выбранного штамма-носителя чужеродных и (или) собственных клонированных генов протективпых антигенов с помощью векторных плазмид. В состав плазмиды, несущей клонированные гены антигенов, входят, как правило, маркерные гены, которые, чаще всего, сообщают клетке устойчивость к определенным антибиотикам. Вследствие таких свойств ре-комбинантных плазмид вакцинный штамм (или кандидат в вакцинный) легко отделить от других штаммов путем высева на селективный агар.
На первом этапе работы перед нами встал вопрос о выборе генов протектив-ных антигенов для включения их в состав потенциально вакцинных штаммов. Со-гласно современным представлениям, инфекционный процесс при холере складывается из двух основных этапов: 1) колонизации тонкого кишечника вирулентными штаммами V. cholerae, прикрепившимися к кишечному эпителию, и 2) продукции ими холерного секретируемого энтеротоксина. Следовательно, для предотвращения развития холеры вакцины должны содержать антигены, которые обусловили бы образование антиколонизирующих и антитоксических антител.
Исходя из этих теоретических положений, была поставлена задача сконструировать рекомбинантные штаммы, которые содержали бы клонированные гены двух основных протективных антигенов - адгезина CFA/I, присутствующего у патогенных для человека штаммов Е. coli, и В-субьединицы холерного токсина. При стабильном наследовании введенных генов и их высокой активности в бактериальных клетках нового хозяина, такие штаммы должны обусловить у привитых формирование антиколонизирующего и антитоксического иммунитета и обеспечить защиту их от заражения вирулентными штаммами холерного вибриона.
Второй важнейший вопрос заключался в выборе нами носителя протектив-ных антигенов. В связи с большим значением, которое придается безопасности вакцинного препарата, мы впервые использовали новый подход, взяв в качестве носителя указанных генов протективных антигенов хорошо изученный штамм Е. coli Ml 7, который используется в России для производства колибактериыа - препарата, предназначенного для лечения и профилактики кишечных заболеваний у человека. Выбор указанного штамма для нашей работы был обусловлен доказанной на протяжении десятков лет его безопасностью для живого организма.
Для конструирования потенциально вакцинного штамма против холеры, вызываемой вирулентным штаммом V. cholerae 0139 серогруппы, в качестве носителя протективных антигенов был взят авирулентный штамм V. cholerae 170, выделенный из открытых водоемов Московской области, геном которого был лишен основных и второстепенных структурных и регуляторных генов вирулентности: ctxA, zot, асе, toxT, кодирующих и контролирующих продукцию основного холерного токсина и дополнительных токсинов Zot и Асе. Важное значение имело также отсутствие в геноме этого штамма гена tcpA, кодирующего основную субъединицу токсин-корегулируемых пилей адгезии, которые являются не только ключевым фактором колонизации, но и выполняют роль рецептора для фага вирулентности СТХф (с/хАВ, zot, асе), а также нуклеотидной последовательности attRS - сайта для внедрения указанного фага в хромосому. Указанные генетические особенности штамма V. cholerae 170 свидетельствуют о том, что этот штамм практически не может реверсировать в вирулентный путем приобретения профага СТХф в результате горизонтального переноса генов. Кроме того, выбранный штамм V. cholerae 170 из-за внесенной мутации в ген hly, кодирующей биосинтез термолабильного гемолизина, утратил способность к биосинтезу этого белка [Осин А.В. и др., 2002], который является цитотоксином.
Основным итогом исследований, представленных в первом разделе экспериментальной части данной работы, является конструирование на основе выбранных штаммов Е. coli Ml7 и К cholerae 170 штаммов Е. coli KM148(pIEM3)(pCFAI) и V. cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI), содержащих две плазмиды с генами основных протективных антигенов - секретируемой В-субьединицы холерного токсина и поверхностной структуры адгезина CFA/I. Поскольку, было установлено, что указанные плазмиды не включились в состав хромосомы, а сохранялись в клетке в автономном состоянии, встал вопрос о стабильности их наследования штаммами Е. coli КМ148 и V. cholerae КМ182. Важность этого вопроса была обусловлена тем, что только штамм со стабильным наследованием плазмид, несущих необходимые гены, мог представлять интерес для последующей работы по конструированию потенциально живой вакцины. Проведенные исследования позволили сделать вывод, что обе плазмиды с клонированными генами ctxQ и cfal стабильно наследовались клетками штаммов Е. coli КМ148 и V. cholerae КМ182 в условиях in vitro и in vivo.
Вторым не менее важным был вопрос о том, могут ли введенные на плазми-дах гены ctxB и cfal, свойственные, соответственно, патогенным штаммам V. cholerae и Е. coli, активно функционировать или экспрессироваться в клетках нового хозяина - Е. coliM.ll (в случае гена ctxB) и V. cholerae 170 (в случае гена 123 cfal), генетическая организация которых может иметь определенные отличия от таковой указанных возбудителей инфекционных болезней. Серологические и биохимические исследования, а также эксперименты на модельных лабораторных животных убедительно показали, что введенные на плазмидах гомо- и гетерологич-ные гены протективных антигенов активно выражаются в клетках рекомбинантно-го штамма кишечной палочки Е. coli KM148(pIEM3)(pCFAI) и холерного вибриона 0139 серогруппы V. cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI). Об этом свидетельствует тот факт, что полученные рекомбинантные штаммы кишечной палочки и холерного вибриона 0139 серогруппы в значительных количествах продуцируют адгезии CFA/I и В-субьединицу холерного токсина. Так, за счет присутствия в клетках штаммов Е. со//КМ148 и V. cholerae КМ182 адгезина CFA/I, их способность к заселению тонкого кишечника крольчат-сосунков возросла в 4000 и 1280 раз, соответственно, по сравнению с исходными штаммами, не содержащими плазмид. Что касается продукции В-субьединицы холерного токсина, то, согласно данным им-муноферментного метода (ELISA), штаммы Е. coli KM148(pIEM3)(pCFAI) и V. cholerae KM182(pIEM3)(pCFAI) продуцируют, соответственно, 10 и 6 мкг/мл секретируемого белка. Полученные данные имеют не только большое практическое значение, но и представляют значительный интерес для фундаментальных исследований, так как свидетельствуют о том, что механизм секреции белков в штаммах Е. coli Ml7, на основе которого получен штамм КМ 148, и других штаммов кишечной палочки, отличается, так как последние практически не секретируют в культуральную среду В-субьединицу холерного токсина.
![Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов Salmonella Enteritidis, экспрессирующих НВс-антиген вируса В с эукариотического и прокариотического промоторов [Электронный ресурс]](/i/i/4503/199818.png "Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов Salmonella Enteritidis, экспрессирующих НВс-антиген вируса В с эукариотического и прокариотического промоторов [Электронный ресурс] Донин Михаил Васильевич")
