Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 11
1.1. Характеристика бактерий рода Enterobacter 11
1.1.1. Таксономическая характеристика бактерий рода Enterobacter 11
1.1.2. Морфология и культуральные свойства 12
1.1.3. Резервуар и распространение инфекции 15
1.1.4. Лабораторная идентификация бактерий рода Enterobacter 20
1.1.5. Устойчивость к факторам внешней среды ..' 27
1.2. Бактериофаги и их применение в диагностической практике 29
1.2.1. Взаимодействие фага с бактериальной клеткой 29
1.2.2. Фагоидентификация бактерий и фаготипирование .32
1.2.3. Реакция нарастания титра фага 36
II. Собственные исследования.. 41
2.1. Материалы и методы ...41
2.1.1. Материалы 41
2.1.2. Методы 52
2.2. Поиск бактерий рода Enterobacter и их бактериофагов 53
2.2.1. Выделение бактерий рода Enterobacter из объектов окружающей среды 53
2.2.2. Выделение бактериофагов бактерий рода Enterobacter 57
2.2.3. Характеристика биологических свойств выделенных фагов 63
2.3. Разработка технологических параметров изготовления и контроля индикаторных энтеробактерных бактериофагов 83
2.4. Разработка схемы исследования материала с целью выделения и ускоренной идентификации бактерий рода Enterobacter 94
2.5. Разработка оптимальных условий постановки реакции нарастания титра фага 99
2.5.1. Определение количественного показателя реакции нарастания титра фага, имеющего диагностическое значение 100
2.5.2. Установление оптимального времени, постановки РНФ 105
2.5.3. Использование РНФ для обнаружения бактерий рода Enterobacter во внешней среде
2.5.3.1. Исследование с помощью РНФ водопроводной воды, контаминированной бактериями рода Enterobacter Ill
2.5.3.2. Исследование с помощью РНФ комбикорма, контаминированного бактериями рода Enterobacter . 113
2.5.3.3. Исследование с помощью РНФ фекалий, контаминированных бактериями рода Enterobacter . 115
2.5.3.4. Исследование с помощью РНФ мяса,
контаминированного бактериями рода Enterobacter .117
2.5.3.5. Исследование фекалий от больных диареей телят с помощью РНФ 119
2.6. Изучение эффективности сконструированного фагового биопрепарата 123
Заключение 126
Выводы 134
Практические предложения 136
Список использованных литературных источников 137
Приложения
- Характеристика бактерий рода Enterobacter
- Морфология и культуральные свойства
- Поиск бактерий рода Enterobacter и их бактериофагов
- Разработка схемы исследования материала с целью выделения и ускоренной идентификации бактерий рода Enterobacter
Введение к работе
Актуальность работы
Бактерии рода Enterobacter выделяют от больных животных и людей при острых желудочно-кишечных заболеваниях, инфекциях желчных и мочевыводящих путей, гнойных поражениях кожи, мозговых оболочек при сепсисе, внутрибольничных инфекциях. Эти микроорганизмы вызывают до 10 % госпитальных бактериемии (Покровский, Дунаевский, 2001).
Имеются данные о выделении штаммов Enterobacter при массовых диарейных заболеваниях телят и поросят (Воронин, Дервишов, 1989; Кав-рук, 1994; Золотухин, 1996; 2004).
Исследователи, работающие в области лабораторной диагностики эн-теробактериозов, подчеркивают трудность выделения бактерий рода Enterobacter из организма и различных субстратов. Поэтому возникает необходимость разработки более эффективных и менее трудоемких методов идентификации бактерий рода Enterobacter.
Всесторонние исследования по изучению бактериофагов, выполненные за последние 35-40 лет, позволили широко использовать их для решения многих задач в микробиологии, вирусологии, генетики, биохимии, радиобиологии, биотехнологии и других областях биологических исследований. Поэтому проблема бактериофагии, развивающаяся в начале как узкая область клинической микробиологии, в настоящее время приобрела общебиологическое значение.
Об успешном использовании бактериофагов для лабораторной диагностики ряда инфекционных заболеваний и индикации возбудителя в объектах внешней среды сообщают многие исследователи (Цветков, 1941; Островская, Папкова, 1951; Кузнецова, Хазанов, Ремова, 1960; Бакулов с соавт., 1990; Колпикова, Бакулов, Котляров, 1992; Ганюшкин, 1984; Золо- тухин с соавт., 2005; Каллавей с соавт., 2005; Натидзе с соавт., 2005; Перелыгин с совт., 2005).
Выделению и изучению бактериофагов посвящено большое число работ, однако бактериофаги бактерий рода Enterobacter изучены недостаточно.
В настоящее время лабораторная диагностика заболеваний, вызванных бактериями рода Enterobacter, осуществляется с помощью бактериологических исследований. Этот метод трудоемок, требует выделения чистой культуры, затрат времени, питательных сред и реактивов.
Использование фагодиагностики позволяет сократить время постановки диагноза с нескольких суток до 19 — 40 часов (Земцова, 1965; Тимаков, Гольдфарб, 1956; 1962).
Методы фагодиагностики не требуют больших затрат времени, материалов и являются общедоступны лабораториям всех уровней (Абдусама-тов, 1960; Гольдфарб, 1961; Кременчук, Гицевич, Бояршинова, 1961; Виль-комирская, 1971).
Основным препятствием широкого использования этих методов в диагностической практике является отсутствие в нашей стане стандартных наборов диагностических бактериофагов многих патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (Ревенко, 1978).
В связи с вышеизложенным актуальность исследований бактериофагов бактерий рода Enterobacter и изучения возможности их применения в диагностических целях несомненна.
Цель исследования
Разработка параметров и технологических приемов по индикации и идентификации бактерий рода Enterobacter в объектах внешней среды с помощью специфических бактериофагов.
Задачи исследования
1. Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении штаммов бактерий Enterobacter.
Изучить основные биологические свойства (морфологию негативных колоний, литическую активность и ее спектр, специфичность, температурную устойчивость, устойчивость к хлороформу) выделенных бактериофагов.
Разработать схему идентификации бактерий рода Enterobacter с помощью бактериофагов.
Разработать ' схему ускоренной индикации бактерий рода Enterobacter в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ.
Сконструировать на основе бактериофагов новый биопрепарат — диагностикум и разработать биотехнологические параметры изготовления фагового препарата.
Научная новизна
Впервые в ветеринарной практике были выделены бактериофаги, активные в отношении бактерий рода Enterobacter, выделенных от сельскохозяйственных животных.
Изучены основные биологические свойства выделенных бактериофагов. Доказана эффективность использования селекционированных бактериофагов с диагностической целью.
Разработаны технологические параметры по получению диагностического биопрепарата фага и схемы фагодиагностики.
Практическая значимость
Выделены и селекционированы специфичные бактериофаги, активные в отношении штаммов бактерий рода Enterobacter, выделенных от сельскохозяйственных животных.
Фаги En - 2 УГСХА и En - 13 УГСХА депонированы во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (справка о депонировании Phagum Enterobacter En - 2 УГСХА-ДЕП № 263-2/19, о депонировании Phagum Enterobacter En - IS УГСХА-ДЕП -№ 263-1/19).
Разработана «Временная инструкция по изготовлению и контролю серии индикаторных бактериофагов Enterobacter En - 2 УГСХА, En - 13 УГСХА», одобренная Ученым советом Ульяновской ГСХА и утвержденная ректором академии 17.01.2006 года.
По материалам диссертационных исследований написаны «Методические рекомендации по ускоренной индикации методом реакции нарастания титра фага бактерий рода Enterobacter в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды» и «Методические рекомендации по выделению и фагоидентификации бактерий рода Enterobacter из патологического материала, пищевых продуктов, кормов и объектов внешней среды с применением диагностических бактериофагов En - 2 УГСХА, En - 13 УГСХА», одобренные Ученым советом Ульяновской ГСХА и утвержденные ректором академии 17.01.06 г.
Основные положения, выносимые на защиту:
Схема выделения бактериофагов энтеробактерий рода Enterobacter.
Биологические свойства выделенных бактериофагов бактерий рода Enterobacter.
Разработка схемы идентификации бактерий рода Enterobacter с помощью специфических бактериофагов.
Разработка схемы ускоренной индикации бактерий рода Enterobacter в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ.
Разработка биотехнологических параметров изготовления фагового препарата.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях: Всероссийской научно-практической конференции «Региональные проблемы народного хозяйства», 8-9 апреля 2004 года, Ульяновская ГСХА, Ульяновск; Межрегиональной научно-практической конфе-
9 ренции молодых ученых Приволжского федерального округа «Молодые ученые в решении региональных проблем АПК», 22 — 23 сентября 2004 года Самарская ГСХА, Самара; Всероссийской научно-практической конференции «Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы» 26 - 28 апреля 2005года, Ульяновская ГСХА, Ульяновск; Международной научной конференции молодых ученых «Молодые ученые -аграрной науке» 1-2 июня 2005года, МСХА им. К.А. Тимирязева, Москва; Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Молодые ученые в решении актуальных проблем современной науки» 1-2 марта 2006 года, Чувашская ГСХА, Чебоксары; Международной научно-практической конференции «Молодежь и наука XXI века» 21-23 марта 2006 года, Ульяновская ГСХА, Ульяновск.
Результаты изучения биологических свойств бактериофагов En - 2 УГСХА, En - 13.УГСХА и индикации бактерий рода Enterobacter в объектах внешней среды методом РНФ подтверждены актами комиссионных испытаний в Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии (от 30.01.06) и во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (ВГНКИ) (от 21.02.06.).
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Федерального государственного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» в рамках научно-исследовательской темы кафедры «Разработка и усовершенствование методов диагностики, лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний молодняка животных».
Публикации
По теме диссертации опубликовано 10 работ.
10 Структура и объем диссертации
Диссертация включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, заключение, выводы, практические предложения и список литературных источников (187 всего, в том числе 150 отечественных). Работа изложена на 169 страницах и иллюстрирована 33 таблицами, 14 рисунками и дополнена приложениями.
Характеристика бактерий рода Enterobacter
Род Enterobacter входит в состав семейства Enterobacteriaceae, 5-ой группы грамотрицательных факультативных анаэробов, относящихся к I отделу (грамотрицательные микроорганизмы) царства Prokaryote.
Название Enterobacter было утверждено в 1963 году на заседании Подкомитета по Enterobacteriaceae и в дальнейшем на заседании Юридической комиссии того же подкомитета в 1970 году (Беркли с соавт., 1997).
На протяжении последних 25-30 лет систематика рода претерпевала существенные изменения (табл. 1). Исследования генома энтеробактеров, проведенные в последние годы, показали, что значительная часть различных штаммов ими не являются. Указанный факт особенно значим для штаммов, условно отнесенных в группу E.agglomerans (Блохина, Соколова, Леванова, 1992). Бактерии группы E.agglomerans предложено выделить в род Pantoea (Покровский, Поздеев, 1999), что было осуществлено в 2004 году.
Согласно современной классификации род Enterobacter имеет 12 видов: Е. cloacae, E.aerogenes, E.amnigenus (2 биогруппы), E.asburiae, E.dissolvens, E.hormaechei, E.intermedius, E.nimipressrualis, E.sakazakii, E.gergoviae и E.cancerogenus. Эпизоотологическое и эпидемиологическое значение имеют виды E.cloacae, E.aerogenes (Покровский, Поздеев, 1999; Джапаридзе, Голиджашвили, Капанадзе, 2005; Noel, Krieg, 1984; De Cheldre, Rost, Struelens, 1995).
Энтеробактеры - прямые, подвижные грамотрицательные палочки с пе-ретрихиально расположенными жгутиками. Исключение составляет единственный неподвижный вид E.asburiae. Диаметр бактерий составляет 0,6 - 1 мкм, длина - 1,2-3 мкм. Некоторые штаммы имеют капсулу. В мазках располагаются одиночно, реже короткими цепочками.
Бактерии этого рода хорошо растут на обычных и селективно-дифференальных для энтеробактерий средах. На плотных питательных средах образуют слизистые и неслизистые колонии среднего размера, напоминающие колонии эшерихий и клебсиелл. На лактозосодержащих дифференциально-диагностических средах (Эндо, Плоскирева, Мак-Конки) образуют красные (лактозоположительные варианты) колонии с металлическим блеском или без него, малиновые или розоватые колонии (штаммы замедленно-разлагающие лактозу) и. бесцветные с розовым или бежевым оттенком на среде Эндо или с желтоватым на среде Плоскирева (не разлагающие лактозу). В косопроходящем свете по Landy колонии обычно имеют зеленовато желтоватый оттенок. В жидких питательных средах образуют помутнение с осадком, иногда пристеночное кольцо. На висмут-сульфит агаре через 48 часов инкубации образуют темно-зеленые или коричневые колонии без окрашивания участка среды под колонией (Покровский, Поздеев, 1999).
Е. cloacae на агаре Дригальского формируют колонии (лактозоположи-тельные, или отрицательные) круглые, 2-3 мм в диаметре, слегка радужные или плоские с неровными краями. На среде Гектона колонии имеют сходный диаметр и желтовато-розовый цвет. На метиленово-синем агаре колонии розоватые, слизистые, выпуклые, 3-4 мм в диаметре (Noel, Krieg, 1984). Биохимические свойства
Характерными для энтеробактеров свойствами являются — неспособность образовывать сероводород и индол, не имеют фенил-аланиндезаминазы, утилизируют цитрат, слабоактивны при гидролизе мочевины, большинство штаммов замедленно разжижают желатин, имеют отрицательную реакцию с метиловым красным и положительную Фогес-Проскауэра, ферментируют глюкозу с образованием кислоты и газа, обычно - манит, лактозу, сахарозу, встречаются штаммы, не ферментирующие их последних два углевода или с замедленно-положительной реакцией; вариабельно - инозит, салицин, адонитол. Представители рода Enterobacter образуют кислоту из глюкозы, мальтозы, трегалозы, L-арабинозы, D-ксилозы, D-маннозы, D-маннитола, целлобиозы (реакция положительна для всех видов). Ферментативная характеристика видов рода Enterobacter представлена в таблице 2.
Морфология и культуральные свойства
Энтеробактеры широко распространены в природе, бактерии выделяют из воды, сточных вод, с растений, из фекалий животных и человека, кроме этого, являются представителями нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта (Морозова, Прямухина, 1997; Покровский, Поздёев, 1999; Сидоров, 2000; Tsou Mei, Chung Jing, Wi Lii, 1998).
E.cloacae - наиболее часто выделяемый вид рода Enterobacter. Выделяют как и E.aerogenes из фекалий, слюны, дыхательного тракта, гноя, реже крови людей и животных. Обнаружены также в сточных и канализационных водах. Ведут себя как патогенные в случаях преждевременных родов, родовых травм, сложных травм, вызывая менингиты и абсцессы ЦНС у новорожденных и бактериемии (Алеушкина с соавт., 1991; Прямухина, Морозова, 1996; Беркли с соавт., 1997).
Т.А. Чулок с соавт. (1998) при анализе качественного состава микрофлоры желудочно-кишечного тракта пожилых больных в гастроэнтерологическом отделении сообщают о выделении бактерий рода Enterobacter, Citro-bacter, Seratia, Klebsiella.
C.H. Золотухин (2004) сообщает о том, что бактерии родов Enterobacter, Citrobacter, Seratia, Klebsiella, Providencia и другие представители семейства Enterobacteriaceae, относящиеся к группе условно-патогенных, широко распространены в окружающей среде и обнаружены практически во всех пищевых продуктах. Поэтому при их выделении обязательна не только качественная характеристика, но и количественный учет (массивность обсеменения).
В 70 - 80-х гг. установлено, что бактерии редко вызывают самостоятельные инфекции, но часто поражают пациентов в стационарах, особенно получающих антибиотики широкого спектра действия. В настоящее время бактерии рода Enterobacter вызывают до 10 - 15 % всех госпитальных инфекций и 5 - 10 % госпитальных бактериемии. Несколько реже микроорганизмы инфицируют ожоговые и хирургические раны, а также вызывают поражения мочеполовой и дыхательной систем (Покровский, Поздеев, 1999).
Наряду с тем, что E.cloacae относится к представителям нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта, доказано этиологическое значение этого вида энтеробактеров при внутрибольничных инфекциях и вспышках кишечных инфекций, а так же его участие в колонизации госпитальных больных и особенно новорожденных (Ставцева, Федорова, Павлова, 1992; Прямухина, Морозова, 1996).
E.aerogenes также присутствует в желудочно-кишечном тракте человека и животных, но может вызывать в некоторых случаях сепсис (Кебу с со-авт., 1998; Tsou Mei, Chung Jing, Wi Lii, 1998).
В.И. Сергевнин (1997), исследуя эпидемиологическую структуру острых кишечных инфекций, отнес бактерии рода Enterobacter к возбудителям острой кишечной инфекции наряду с другими представителями энтеробак-терий.
В настоящее время имеются научные данные о выделении этих микроорганизмов от больных людей при острых желудочно-кишечных заболеваниях, инфекциях желчных и мочевыводящих путей, гнойных поражениях кожи, мозговых оболочек, при сепсисе, внутрибольничных инфекциях. Бактерии E.cloacae выделены неоднократно у больных с невыясненной этиологией острых кишечных заболеваний при различных диагнозах (простая или токсическая диспепсия, энтерит, гастроэнтерит). Нередко эти микроорганиз 17 мы выделяли из крови больных с клиникой сепсиса. При пиелонефрите с обнаружением E.cloacae в моче отмечали тяжелое течение заболеваний с развитием у некоторых больных эндотоксического шока (Красноголовец, Киселева, 1996; Силанкорва с соавт., 2005).
E.cloacae и E.aerogenes контаминируют различные растворы для внутривенных введений. Известны случаи тяжелых септических заболеваний новорожденных с летальным исходом, связанных с переливанием инфицированных жидкостей (Покровский, Дунаевский, 2001).
О повышении частоты выделения от больных при вспышках внутри-больничных инфекций представителей рода Enterobacter, в частности E.cloacae, E.aerogenes сообщается в работах В.Ф. Королькова с соавт. (1992), Y. De Cheldre, F. Rost, M.J. Struelens (1995).
По данным З.П. Заркуа, Н.М. Мечурчлишвили, И.М. Гадуа (2005), изучение микрофлоры, выделенной из материалов от онкологических больных с развившимися послеоперационными гнойно-воспалительными осложнениями, показало, что наблюдается снижение высеваемости стафилококковой флоры на фоне одновременного увеличения роста этиологической значимости грамотрицательных условно-патогенных микроорганизмов {Proteus, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella).
Ю.Б. Белоусов, В.П. Комарова, О.В. Ефременкова (1998) сообщают, что при амбулаторном обследовании 60 пожилых людей с инфекцией нижних дыхательных путей в 10 % случаев выделяли Enterobacter, Citrobacter, Proteus, Acinetobacter.
Исследуя внутрибольничные инфекции родильного дома г. Москва, Н.С. Прямухина, О.Т. Морозова (1996) выделили у новорожденных 208 штаммов микроорганизмов, из них 72 Enterobacter cloacae (35 %), 64 Klebsiella pneumoniae, 42 Staphylococcus epidermidis, 30 Staphylococcus haemolyti cus.
Поиск бактерий рода Enterobacter и их бактериофагов
Выделение и идентификацию бактерий рода Enterobacter проводили согласно «Методическим указаниям по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями», утвержденным Департаментом ветеринарии МСХ и П (1999), а также по схеме Р.В. Федорова (1995).
Выделение бактериофагов проводили по методам, предложенным Л.И. Адельсон (1957; 1962), С. Лурия, Д. Дарнел (1970), И.П. Ревенко (1978), СВ. Ленев (1991). Изучали биологические свойства фагов по методам, предложенным М. Адаме (1961), Д.М. Гольдфарб (1961), И.М. Габрилович (1992), В.Я. Ганюшкин (1988), H.-W.Ackermann (1997).
Обнаружение бактерий рода Enterobacter в объектах окружающей среды проводили с помощью реакции нарастания титра фага. Реакцию нарастания титра фага ставили по методике В.Д. Тимакова и Д.М. Гольдфар-ба (1961), В.Я. Ганюшкин (1988). Подготовку препаратов для электронной микроскопии проводили осаждением вирусных частиц в режиме низкоскоростного центрифугирования (Пономарев, Андреев, Артамонова, 2002).
Статистическую обработку результатов исследований проводили общепринятым статистическими методами (Ашмарин, Воробьев, 1962; Бейли 1962).
Первоочередной задачей наших исследований стало выделение бактерий рода Enterobacter из объектов внешней среды. В период с 2003 по 2005 год нами исследовано на наличие бактерий рода Enterobacter 67 проб: сточные воды стационаров ветеринарного факультета Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии, канализационные воды мясокомбината «Ульяновский», смывы, фекалии сельскохозяйственных животных личных подсобных хозяйств, фекалии животных ферм Ульяновской и Самарской областей, патологический материал павших телят, поросят, гусей (сердце, легкие, печень, содержимое кишечника).
Первичные посевы и выделение чистых культур бактерий рода Enterobacter проводили в соответствии с правилами, указанными в «Методических указаниях по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энте-робактериями», утверждёнными Департаментом ветеринарии МСХ и П 11 октября 1999 года, а также согласно схеме Р.В. Федорова (1995). Посев материала производили на среды Эндо, Плоскирёва и висмут-сульфит агар, инкубировали при температуре 36-37 С 18-20 часов. Выросшие в чашках на среде Эндо: красные (лактозоположительные варианты) колонии с металлическим блеском или без него, малиновые или розоватые колонии (штаммы замедленно-разлагающие лактозу) и бесцветные с розовым или бежевым оттенком; на агаре Плоскирёва: выпуклые розовые колонии с тёмным центром или без него, колонии с желтоватым оттенком; на висмут-сульфит агаре (через 48 часов инкубации) темно-зелёные, коричневые или черные колонии без окрашивания участка среды под колонией, пересевали в МПБ (по 4-6 колоний с чашки). Культуры микроорганизмов инкубировали при 37 С 6 - 18 часов (до появления выраженного помутнения среды). Было выделено 43 штамма, колонии которых по морфологии напоминают бактерии рода Enterobacter.
Суточные бульонные культуры, полученные после пересева колоний с вышеперечисленных сред, микроскопии (окраска по Граму) и при наличии в мазках мелких грамотрицательных палочек с закруглёнными концами, не образующих спор и капсул, располагающихся одиночно и попарно, подвергали дальнейшему изучению с целью родовой и видовой идентификации, а также определения патогенных свойств.
Видовую принадлежность культур устанавливали на основе определения морфологических и культурально-биохимических свойств. Предварительные результаты учитывали через 24 ч, окончательные — через 48 ч.
Недостаток используемой схемы Р.В. Федорова (1995) заключается в трудоемкости и необходимости большого набора исследуемых тестов. Неудобство использования методических рекомендаций по диагностике смешанной кишечной инфекции для выделения бактерий рода Enterobacter связано с невозможностью по приведенным тестам дифференцировать выделенные штаммы до вида.
В качестве основных тестов ставили реакцию с индикатором мети-леновым красным (MR-) и реакцию Фогес-Проскауэра (VP+), а также определяли рост на среде Симмонса (+) и подвижность микроорганизмов (+). На этом этапе происходило отсеивание штаммов родов Citrobacter, Escherichia, Morganella, Proteus, Providencia, Salmonella, Yersinia (MR+, VP-), Edwarsiella (Симмонса - ), Klebsiella (подвижность - ).
При получении соответствующих результатов ферментативные свойства культур изучали на наборе сред с углеводами, куда входят среды с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом, мальтозой, а также па средах с мочевиной, на бульоне Хоттингера с реактивом Ковача (определение индола), МПЖ, среде Клиглера (определение сероводорода, глюкозы и лактозы), среде с фенилаланином. Мы исследовали штаммы по данным тестам, так как этот набор позволяет идентифицировать бактерии рода Enterobacter до вида. В таблице 3 представлены результаты изучения биохимических свойств выделенных штаммов. Патогенные свойства у культур бактерий рода Enterobacter определяли в биопробе на белых мышах методом внутрибрюшинного введения 0,5 млрд микробных клеток. Взвесями каждого вида бактерий заражали по три белых мыши.
Разработка схемы исследования материала с целью выделения и ускоренной идентификации бактерий рода Enterobacter
Используя строгую специфичность селекционированных нами бактериофагов по отношению к штаммам Enterobacter, мы разработали схему ускоренной идентификации этих микроорганизмов (рис. 13).
Подготовку и посев проб материала, подлежащего исследованию, проводили в соответствии с ГОСТами «Методы бактериологического анализа». В исследованиях использовали воду, комбикорм, фекалии и мясо, контаминированные бактериями рода Enterobacter в концентрации 105, 10 , 103, 102, 101 м.к. в 1 мл. Посев материала производили на среды Эндо, Пло скирёва и висмут-сульфит агар, инкубировали 18-20 часов при температуре 36 - 37 С. Выросшие в чашках на среде Эндо: красные (лак-тозоположительные варианты) колонии с металлическим блеском или без него, малиновые или розоватые колонии (штаммы замедленно-разлагающие лактозу) и бесцветные с розовым или бежевым оттенком; на агаре Плоскирёва: выпуклые розовые колонии с тёмным центром или без него, колонии с желтоватым оттенком; на висмут-сульфит агаре (через 48 часов инкубации) темно-зелёные, коричневые или черные колонии без окрашивания участка среды под колонией, пересевали в МПБ. Культуры микроорганизмов инкубировали при 37 С 6 - 18 часов (до появления выраженного помутнения среды).
Бульонные культуры, полученные после пересева колоний с вышеперечисленных сред, микроскопии (окраска по Граму) и при наличии в мазках грамотрицательных палочек, не образующих спор и капсул, располагающихся одиночно или короткими цепочками, идентифицировали бактериологическим методом и с помощью бактериофагов En - 2 УГСХА и Еп-ІЗУГСХА.
Бактериологический метод
Изучение ферментативных свойств выделенных штаммов проводили в соответствии с «Методических указаниях по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями», утвержденными Департаментом ветеринарии МСХ и П 11 октября 1999 года. По результатам изучения биохимических свойств определили родовую принадлежность культур (табл. 18).
Фагоидентификация
На поверхность МПА в чашках Петри пастеровской пипеткой наносили 3-4 капли бульонной 6-ти - 24-х часовой культуры исследуемых микроорганизмов. Нанесённую культуру равномерно распределяли по поверхности среды стерильным шпателем. Чашки ставили в термостат для
Выделение бактерий рода Enterobacter и ускоренная идентификация с помощью бактериофагов (І) в сравнении с традиционной схемой бактериологического исследования (II) подсушивания на 15 - 20 минут. Чашку делили на три сектора и на поверхность засеянной среды пастеровской пипеткой лёгким прикосновением капли на два сектора наносили по штамму фагов En - 2 УГСХА и En - 13 УГСХА, на третий сектор в качестве контроля наносили стерильный МПБ, наклоняли чашку, чтобы капли стекли. Посевы инкубировали в термостате при 37 С 18-20 часов.
Наличие зоны лизиса на сплошном газоне культуры хотя бы одного из фагов указывает на принадлежность исследуемого штамма к роду Enterobacter. Отрицательным считали результат при отсутствии лизиса на газоне культуры.
Результаты проведенных исследований представлены в таблице 19. Фагоидентификация выделенных штаммов как бактерий рода Enterobacter во всех случая подтверждена результатами исследований биохимических свойств.
