Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 9
1.1. Характеристика бактерий рода Citrobacter 9
1.2. Резервуар и распространение инфекции 15
1.3. Патогенез 17
1.4. Лабораторная идентификация Citrobacter 27
1.5. Устойчивость 30
1.6. Бактериофаги и их применение в лабораторной практике 31
1.6.1. Фагоидентификация бактерий и фаготипирование 31
1.6.2. Развитие фаговых корпускул в клетке хозяина 38
1.6.3. Реакция нарастания титра фага (РНФ) 41
II. Собственные исследования 48
2.1. Материалы и методы 48
2.1.1. Материалы 48
2.1.2. Методы 55
2.2. Результаты собственных исследований 56
2.2.1. Выделение бактерий рода Citrobacter из объектов окружающей среды 56
2.2.2. Поиск бактериофагов Citrobacter и селекция клонов фагов 67
2.2.3. Характеристика выделенных фагов бактерий рода Citrobacter 76
2.3. Разработка метода выделения и ускоренной идентификации бактерий рода Citrobacter с использованием фагов 93
2.4. Разработка оптимальных условий постановки РНФ 97
2.4.1.Определение количественного показателя РНФ, имеющего диагностическое значение 97
2.4.2. Установление оптимального времени, обеспечивающего наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями 102
2.4.3. Использование РНФ для обнаружения бактерий рода Citrobacter в объектах внешней среды 108
2.4.3.1. Исследование водопроводной воды, контаминированной бактериями рода Citrobacter с помощью РНФ 108
2.4.3.2. Исследование комбикорма, контаминированного бактериями рода Citrobacter с помощью РНФ 112
2.4.3.3. Исследование проб фекалий, контаминированных бактериями рода Citrobacter с помощью РНФ 115
2.4.3.4. Исследование мяса, контаминированного бактериями рода Citrobacter с помощью РНФ 118
2.4.3.5. Результаты исследований фекалий от больных диареей телят и поросят с помощью РНФ 122
2.5. Обсуждение 128
Выводы 136
Практические предложения 137
Список использованных литературных источников 138
Приложения 154
- Характеристика бактерий рода Citrobacter
- Фагоидентификация бактерий и фаготипирование
- Выделение бактерий рода Citrobacter из объектов окружающей среды
- Исследование водопроводной воды, контаминированной бактериями рода Citrobacter с помощью РНФ
Введение к работе
Актуальность работы.
В последние годы, благодаря работам отечественных и зарубежных исследователей, расширилось представление о роли энтеробактерий рода Citrobcter в патологии животных и человека.
Представители данного рода широко распространены в природе, их выделяют из воды, почвы, фекалий животных и человека. Некоторые штаммы входят в состав нормальной микрофлоры кишечника (Семёнова с соавт., 1993; Mullner, Keller, 1992; Adeniiyi, et al., 1991), но в то же время представители этого рода способны вызывать вспышки гастроэнтеритов и токсикоинфекций, внутрибольничные инфекции, менингиты, абсцессы мозга, урологические заболевания, гнойные инфекции и даже сепсис у детей и взрослых людей (Але-шукина с соавт., 1991; Корольков с соавт., 1992; Torres Alvarez de Агсауа et al., 1993; Pettis et al., 1994; Ventura et al., 1995; Yukiko, et.al. 1996; Кебу с соавт., 1998; Gordon David M., Fitz Gibbon Frances 1999).
Цитробактеры способны также самостоятельно или в ассоциации с другими микроорганизмами вызывать заболевания у домашних и диких животных (Adeniiyi et al., 1991; Karunasagar et al., 1992). Особый интерес представляют исследования по изучению этиологической роли цитробактера в возникновении диареи новорожденных животных (Мнацаканов, 1986; Воронин с соавт., 1989; Ставцева, Дервишев, 1993; Каврук, 1994; Золотухин с соавт., 1999).
В настоящее время лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых цитробактерами, основана на выделении чистой культуры микроорганизмов и их идентификации по общепринятым тестам. Этот метод трудоемок, недостаточно чувствителен и требует затрат времени, питательных сред и реактивов. Поэтому перед исследователями стоит задача изыскания более простого и доступного для любых лабораторий метода индикации и идентификации названных микроорганизмов.
В ветеринарной практике для ускоренного обнаружения некоторых мик-
роорганизмов в патологическом материале и объектах внешней среды предложены индикаторные бактериофаги с использованием реакции нарастания титра фага РНФ (Гольдфарб, 1961; Капырина, Бакулов, 1972; Ганюшкин, 1988; Ру-салиев, Хайруллин, 1990; Кольпикова, Бакулов, Котляров, 1990, 1992). Метод индикации и идентификации микроорганизмов с помощью бактериофагов специфичен, не требует больших затрат времени, материалов и общедоступен.
Цель исследования. Разработка параметров и технологических приёмов по индикации и идентификации бактерий рода Citrobacter с помощью специфических бактериофагов.
Задачи исследования.
Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении бактерий рода Citrobacter.
Изучить основные биологические свойства (морфология негативных колоний, литическая активность и ее спектр, специфичность, температурная устойчивость, устойчивость к хлороформу) селекционированных изолятов.
Подобрать оптимальный набор выделенных фагов и сконструировать на их основе новый биопрепарат - диагностикум.
Разработать схему ускоренной индикации бактерий рода Citrobacter в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и использованием созданного биопрепарата.
Разработать схему идентификации цитробактерий с помощью бактериофагов.
Разработать технологические параметры изготовления биопрепарата для фагодиагностики.
Научная новизна.
Впервые в ветеринарной практике были выделены бактериофаги, активные в отношении штаммов бактерий рода Citrobacter, выделенных от сельскохозяйственных животных.
Изучены основные биологические свойства выделенных фагов. Дока-
зана эффективность использования селекционированных бактериофагов с диагностической целью. - Разработаны технологические параметры по получению диагностического биопрепарата фага и схемы фагодиагностики.
Практическая значимость.
Выделены и селекционированы специфичные бактериофаги, активные в отношении бактерий рода Citrobacter. Три выделенных и изученных штамма депонированы в лаборатории бактериальных инфекций ВГНКИ, признаны перспективными и рекомендованы для изготовления диагностического и лечебно-профилактического препарата. Разработана Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии индикаторных бактериофагов Citrobacter С-52 УГСХА, С-61 УГСХА и С-66 УГСХА".
Для врачей бактериологов предложены "Методические рекомендации по ускоренной индикации методом реакции нарастания титра фага (РНФ) бактерий рода Citrobacter в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды" и "Методические рекомендации по выделению и фаготипированию бактерий рода Citrobacter из патологического материала, кормов, пищевых продуктов и объектов внешней среды с применением диагностических бактериофагов С-52 УГСХА, С-61 УГСХА и С-66 УГСХА", которые были одобрены Ученым советом УГСХА и утверждены ректором академии 16.02.04 г.
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:
Схема выделения бактериофагов бактерий рода Citrobacter.
Биологические свойства выделенных фагов бактерий рода Citrobacter.
Конструирование из отобранных фагов нового биопрепарата — диагно-стикума.
Разработка схемы ускоренной индикации бактерий Citrobacter в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ с использованием созданного биопрепарата.
Разработка схемы идентификации цитробактерий с помощью специфических бактериофагов.
Разработка технологических параметров изготовления биопрепарата для фагодиагностики бактерий рода Citrobacter.
Апробация работы.
Результаты основных исследований подтверждены актами комиссионных испытаний в ВГНКИ (от 23.04.04г.), УГСХА (от 5.06.03г.); актами производственных испытаний, проведённых в Чердаклинской районной лаборатории Ульяновской области (от 24.08.04г.) и в Сергиевской районной лаборатории Самарской области (от 30.08.04г.). Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях в городах: Москва, Ульяновск (1997, 2000, 2001, 2002, 2004).
Работа выполнена в соответствии с комплексным планом научной работы кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 5 работ.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы (174 источников, в том числе 123 отечественных). Работа иллюстрирована 33 таблицами, 13 рисунками, 1 схемой и приложениями.
Характеристика бактерий рода Citrobacter
Род Citrobacter (citrus - лимон, bacter - мелкие палочки) объединяет группу ферментативно родственных бактерий, названных так благодаря их способности утилизировать цитрат и использовать его в качестве единственного источника углерода. Название было предложено С. Werkam, G. Gillen (1932), а также И.Е. Манкивичем (1948). В силу близости ферментативных свойств их часто включали в род Escherichia.
Согласно современной классификации род включает следующие виды: Citrobacter freundii, С. koseri (C.diversus), С amalonaticus, C.farmeri, С. yougae, С.вгаакИ, С. werkmanii, С. sedlakii, С. rodentum и два до сих пор безымянных вида (для них предложены названия (С. gillenii и С. murliniae).
Род Citrobacter образует мелкие грамотрицательные палочки размером 2-6х 1,0 мкм, как правило, подвижные благодаря наличию перетрихиально расположенных жгутиков; спор и капсул не образуют.
Цитробактеры хорошо растут на обычных питательных средах и могут использовать цитрат, как единственный источник углерода. Температурные границы 12-43С, оптимальная рН -7,2. В отличие от эшерихий рост этих бактерий на средах содержащих желчные соли, желчные кислоты и бриллиантовый зеленый, не подавляется. На твёрдых питательных средах образуют колонии, напоминающие колонии эшерихий. На среде Эндо лактозположительные варианты цитробактера образуют колонии, окрашенные в розовый или красный цвет, но лишенные типичного для кишечной палочки металлического блеска; у лактозоотрицательных вариантов колонии бесцветные или сероватые с розовым оттенком, более темным в центре. На среде Плоскирева лактозоотрица-тельные штаммы Citrobacter образуют слегка опалесцирующие, выпуклые колонии, окрашенные в тон среды (слегка розоватые); лактозоположительные колонии имеют более интенсивную окраску с темным центром. На висмут-сульфит агаре через 48 часов инкубации цитробактеры дают обильный рост, образуя светло-зеленые, коричневые или черные колонии без окрашивания участка среды под колонией. На жидких питательных средах дают гомогенное помутнение среды.
Основой идентификации Citrobacter являются их ферментативные свойства. Они утилизируют цитрат в среде Симмонса, образуют газ в глюкозе, ферментируют лактозу в разные сроки (встречаются лактозоотрицательные штаммы), а также ферментируют маннит, рамнозу, сорбит, арабинозу, ксилозу, мальтозу. Обычно не ферментируют инозит, не обладают лизиндекарбоксила-зой, фенилиаланиндезаминазой и желатиназой. Мочевину гидролизуют очень слабо и медленно, или вообще не гидролизуют; положительные в реакции с метиловым красным и отрицательные в реакции Фогес-Проскауэра. Большинство штаммов образуют сероводород и не образуют индола. Они вариабельны в отношении сахарозы, салицина, дульцита, раффинозы и адонита.
Вариабельность некоторых ферментативных признаков цитробактера положена в основу разделения их на три вида.
Я.Е. Брильман (1998) предлагает дегидрогеназный или окислительно-восстановительный тест учитывать наряду с наличием ферментов гидролаз, цитохромоксидазы, декарбоксилазы, уреазы и реазы и др. Он исследовал 200 культур Citrobacter freundii и 76 штаммов знтеропатогенных эшерихий с определением их дегидрогеназнои активности в полужидком манните и в среде Клиглера. Обнаружил, что этот тест, характеризующийся редукцией индикатора, так же как у сальмонелл и шигслл, постоянно негативный в полужидком манните у в полужидком манните у С. Freundii и у 97,5% ЭПЭ. У 17,1% лакто-зоположительных культур Citrobacter freundii ДГТ в среде Кл игл ера был положительным, что позволило выделить их в отдельный биовар. С учётом результатов исследований предлагается вид Citrobacter freundii подразделить на 3 биовара.
Антигенная структура и серологическая идентификация У цитробактеров выделяют О-, Н- и К- антигены, характерные для большинства представителей семейства энтеробактерий. По антигенной структуре цитробактеры близки к сальмонеллам.
О-антиген представлен липополисахаридно-протеиновым комплексом. По его структуре цитробактеры разделяют на О-группы; количество моносаха-ров в О-антигенах каждой группы стабильно. У бактерий некоторых серологических групп О-антигены имеют мозаичное строение и, кроме основных О-антигенов, включают парциальные О-антигены других серологических групп. Для серологической идентификации используют дополнительную схему Уэста и Эдвардса(1954). Групповые О-антигены обозначают арабскими цифрами, парциальные О-антигены - строчными латинскими буквами. В настоящее время выделяют более 42 О-серогрупп.
Н-антигены представлены термолабильным белковым комплексом. Антигены могут быть простыми и сложными, включая парциальные антигены (обычно 2-3) других серологических групп. Н-антиген обозначают арабскими цифрами. В настоящее время выделяют более 90 Н-антигенов.
Наличие перекрестных реакций у циробактера с сыворотками других эн-теробактерий свидетельствует о существовании серологического родства между самими бактериями цитробактер с одной стороны и сальмонеллами и эше-рихиями с другой стороны (Рагинская, 1973). Например, некоторые штаммы серогрупп 05 и 029 имеют Vi-антиген, серологически идеентичный таковому у Salmonella choleraesuis серовар typhi и серовар hirschfeldii (Покровский и др., 1999). Поэтому, принадлежность выделенного штамма к роду Citrobacter и определенному серовару устанавливается на основании изучения его биохимических свойств и антигенной структуры.
Серологическая идентификация цитробактера используется в медицинской практике, согласно которой первоначально ставят РА с поливалентной О-антисывороткой; рекомендуется начинать с сывороток CiOA, CiOD и CiOF, т.к. бактерии соответствующих групп наиболее распространены в России. При положительном результате ставят РА с сыворотками к О-антигенам, которые входили в состав поливалентной атисывортки (Покровский, Поздеев, 1999 г.).
Б.М. Кральником и с соавт. (1986) разработан и предложен эритроцитар-ный диагностикам для выявления антигенов рода Citrobacter, с помощью которого авторы установили серогрупповую принадлежность штаммов, выделенных от больных людей. Культуры названного рода были отнесены к серогруп-пам: 01, 02, ОЗ, 04, 05, Об, 07, 08, ОН, 012, 013,022.
Фагоидентификация бактерий и фаготипирование
Роль бактериофага как средства терапии и профилактики некоторых инфекционных заболеваний в настоящее время невелика, а значение для лабораторной диагностики ряда инфекции этот биологический объект не только не утратил, а, наоборот, начал привлекать к себе всё более пристальное внимание исследователей. С каждым годом повышается значимость бактериофагов как высоко специфического диагностического средства, позволяющего надёжно дифференцировать возбудителей бактериальных видов, а порой проводить более детальную дифференциацию отдельных типов и вариантов внутри данного вида. Возможность фагоидентификации вытекает из специфичности действия фагов, которая может быть настолько выражена, что позволяет дифференцировать не только отдельные виды, но и серологически неотличимые штаммы в пределах одного вида.
Поэтому всё большее число исследователей предпочитают обращаться к фаговым тестам, как единственному средству, способному дифференцировать близкородственные штаммы. Фагодиагностика основана на специфической способности фагов взаимодействовать с определёнными видами (идентификация) или типами (фаготипирование) бактерий, в результате чего происходит их лизис. Феномен лизиса является основой для использования фага в диагностических целях, Метод фагодиагностики широко используется в лабораторной практике для идентификации различных видов микроорганизмов.
Об успешном применении дизентерийного бактериофага при массовых исследованиях сообщила В.Н. Кузнецова (1956), которая идентифицировала 576 культур из 630.
Для ускоренной диагностики брюшного тифа З.С. Островская, Б.Н. Папкова (1951) предложили Vi-бактериофаг, с помощью которого в течение 48 часов можно идентифицировать брюшнотифозные гемокультуры.
В.В. Аврех (1954) предлагал использовать фаги специфические по отношению к различных видам сальмонелл, считая данный метод более надёжным, чем реакция с монорецепторными сыворотками. Для быстрой диагностики В.А. Килессо (1960) применяла сальмонеллёзный О-фаг с широким спектром действия, лизирующий 40 различных серотипов сальмонелл. Л.И. Адельсоном с со-авт. (1958) были получены фаги, активные по отношению к энтеропатогенным кишечным палочкам серотипов 026: 055: 0111, и с успехом применявшиеся ими для идентификации этих бактерий.
М.З. Попхадзе (1968) в своей работе указывал, что применение активного поливалентного бруцеллёзного бактериофага, обладающего строгой видовой специфичностью, позволяет идентифицировать 93-99% культур бактерий, включая атипичные формы, чем и определяется его высокая диагностическая ценность.
Одним из первых в ветеринарной практике фагоидентификация была предложена К.И. Цветковым (1941) при паратифозном аборте у кобыл. П.В. Лихачев в 1948 году провёл испытание фага при диагностике паратифа свиней. Дальнейшие работы в этой области исследований подтвердили значимость выбранного направления.
Н.И. Николаенко, И.К. Тутов (1970) отмечают перспективность использования бактериофага, лизирующего Salmonella abortus ovis и позволяющего сократить сроки диагностики до 4-6 часов.
По данным И.П. Ревенко (1978) коли-гертнер-фаг обладает довольно широким диапазоном литической активности. При испытании 206 культур S. enteritidis, выделенных от телят и коров в разное время и в различных местностях, этот фаг лизировал 164 культуры (79,6%). Кроме того, он лизировал значительное количество культур S. suipestifer и S. cholerae suis, выделенных от поросят. В отношении культур Е. coli, выделенных от телят, коров и свиней различного возраста, коли-гертнер-фаг оказался малоактивным: из 270 культур он лизировал только 15,7% штаммов.
Находят применение и листериозные фаги, позволяющие идентифицировать свыше 85% культур листерий (Капырина, Бакулов, 1972). По мнению указанных выше авторов, проба с бактериофагом, в силу его специфичности и избирательности действия, является наиболее надёжным методом идентификации инфекционных болезней животных и человека из доступных рядовой лаборатории.
В эпидемиологической и эпизоотологической практике всё большее распространение получает метод фаготипирования бактерий. Практическая ценность этого метода определяется относительной стабильностью фаготипов бактерий.
Как указывает В.Б. Аврех (1959), фаготип бактерий отражает то тонкое антигенное строение бактерий, которое не улавливается серологическими реакциями и может быть определено только при помощи бактериофагов. Установление этих тонких различий и даёт возможность определять эпидемиологические или эпизоотологические связи, так как при наличии таких связей выделяются штаммы бактерий, характеризующиеся одинаковой фагомозаикой.
Метод фаготипирования бактерий может быть использован не только для повышения качества эпидемиологического и эпизоотологического исследования, но и с целью улучшения лабораторной диагностики, как метод ускоренной идентификации микроорганизмов.
Фаготипирование микроорганизмов можно проводить двумя методами. Первый метод фаготипирования, наиболее часто применяемый в практике, основан на определении чувствительности исследуемой культуры к стандартным препаратам специфических бактериофагов, взятых в определённом разведении. Второй метод фаготипирования бактерий заключается в разделении их на группы по характеру выделяемых из культур умеренных фагов. В медицинской практике этот метод используется очень редко, а в ветеринарной вообще не применяется (Graigie, Yan, 1938).
Выделение бактерий рода Citrobacter из объектов окружающей среды
Первичные посевы и выделение чистых культур микроорганизмов проводили в соответствии с правилами, указанными в "Методических указаниях по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями", утверждёнными Департаментом ветеринарии МСХ и П 11 октября 1999 года .
Посев материала производили на среды Эндо, Плоскирёва и висмут-сульфит агар, инкубировали при температуре 36-37 С 18-20 часов.
Выросшие в чашках на среде Эндо: розовые или красные колонии без металлического блеска, а также бесцветные или сероватые колонии с розовым оттенком, с более тёмным в центре; на агаре Плоскирёва: слегка опалесцирую-щие выпуклые розовые колонии с тёмным центром или без него; на висмут-сульфит агаре (через 48 часов инкубации) светло-зелёные, коричневые или черные колонии без окрашивания участка среды под колонией, пересевали в МПБ (по 4-6 колоний с чашки). В случае роста указанных колоний в посевах из нескольких образцов исследования пересев делали с культур, полученных не менее чем из двух образцов. Культуры микроорганизмов инкубировали при 37С 6-18 часов (до появления выраженного помутнения среды).
Первичные бульонные культуры, полученные после пересева колоний с вышеперечисленных сред, микроскопии (окраска по Граму) и при наличии в мазках мелких грамотрицательных палочек с закруглёнными концами, не образующих спор и капсул, располагающихся одиночно и попарно, подвергали дальнейшему изучению с целью родовой и видовой идентификации, а также определения патогенных свойств.
Видовую принадлежность культур устанавливали на основе определения морфологических и культурально-биохимических свойств. Ферментативные свойства изучали у 2-6 агаровых культур бактерий, выделенных из одного патологического материала, на наборе сред с углеводами и индикатором Андреде или полужидких с индикатором ВР, куда входят среды с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом, мальтозой, а также на средах с мочевиной, серно-кислым железом (определение сероводорода), агаре Симмонса, в бульоне Хоттингера (определение индола), МГГЖ, среде с фенилаланином. В качестве дополнительных тестов ставили реакции с метилротом и Фогес-Проскауэра, а также определяли подвижность микроорганизмов.
Патогенные свойства у культур бактерий рода Citrobacter определяли в биопробе на белых мышах методом внутрибрюшинного введения 0,5 млрд. микробных клеток. Для этого использовали агаровые культуры бактерий, выделенные из двух органов и тканей погибших или фекалий больных животных. Взвесями каждого вида бактерий заражали по три белых мыши. Культуру признавали патогенной в случае гибели двух или более мышей в течение трёх суток после заражения и относили её к возбудителям болезни.
Для выполнения цели диссертационных исследований необходимо было первоначально выделить и изучить искомый бактериофаг, поэтому первым этапом нашей работы была попытка выделить бактериофаги бактерий рода Citrobacter из имеющихся у нас штаммов бактерий Citrobacter. Мы надеялись обнаружить лизогенные культуры, так как бактериофаги, выделенные из таких культур, обладают более выраженной специфичностью (Жугова, 1985).
Из имеющихся у нас культур Citrobacter мы пробовали выделить бактериофаги различными методами. Все штаммы, изученные нами, исследовались как индикаторные и как "лизогенные".
В первой серии опытов использовали методику, предложенную С. Лурия, Д. Дарнелл (1970), для выделения бактериофагов энтеробактерий из бактерий Citrobacter без воздействия на них индуцирующего фактора. В 1,0 литровую колбу, содержащую 0,5 литра мясопептонного бульона, добавили по 1,0 мл 18-ти часовых культур, всех имеющихся у нас штаммов Citrobacter. Колбу поставили в термостат при 37С на 24 часа. Затем смесь бактерий центрифугировали при 2000 об/мин в течение 30 минут, прогревали на водяной бане при 58-60С в течение 30 минут. Надосадочную жидкость исследовали на наличие фага методом агаровых слоев по A. Gracia на имеющихся у нас штаммах Citrobacter.
Результаты, представленные в таблице 7 свидетельствуют, что из культур бактерий рода Citrobacter в опытах по вьщелению бактериофагов без воздействия на них индуцирующего фактора не приводило к появлению свободного фага.
Во второй серии опытов на культуры, исследуемые как "лизогенные", воздействовали индуцирующим фактором, затем фильтровали через бактериальные свечи Шамберлана L-3 (Ревенко, 1978). В качестве индуцирующего фактора применяли воздействие на бактерии ультрафиолетовыми лучами, в течение 15, 30 и 45 секунд при помощи прибора "Изольда" с ртутной лампой ДРБ8, 18,0%, мощности которой приходится на область 254 нм. Полученный фильтрат исследовали на наличие фага на имеющихся культурах Citrobacter методом агаровых слоев. Накануне опыта по чашкам разливали 1,5% масо-пептонный агар. Перед использованием чашки подсушивали в термостате 15-20 минут. Индикаторные и исследуемые культуры выращивались 18-20 часов при 37С на мясо-пептонном бульоне. Стерильно подготовленный 0,7% агар, разлитый в пробирки по 2,5 мл, расплавляли и остужали до 46-48С. Исследуемый фильтрат или центрифугат в количестве 1,0 мл помещали в 2,5 мл 0,7% агара, туда же вносили 0,2 мл индикаторной культуры. Все быстро и тщательно перемешивали вращением пробирки в ладонях и выливали на поверхность 1,5% МПА. Смесь осторожными движениями распределяли по поверхности агара, чашки оставлялись на горизонтальной поверхности с приоткрытыми крышками на 30 минут до полного застывания агара, затем инкубировались в термостате при 37С в течение 18-20 часов.
Исследование водопроводной воды, контаминированной бактериями рода Citrobacter с помощью РНФ
Пробы водопроводной воды в объеме 10 мл вносили в колбы и контами-нировали C.freudii №9, C.freundii №16 и С. amalonaticus №11 в концентрации 105; 104; 103; 102; 101 м.к./мл, заливали МПБ из расчета 10 мл бульона на 1 мл воды. Брали колбу с пробой воды, не контаминированной бактериями рода Citrobacter. Содержимое колб, встряхивали в шуттель-аппарате в течение 10 минут. Приготавливали для опытной и контрольной проб по 6 широких пробирок (диаметр 20 мм) и нумеровали их (1, 2, 3 и соответственно 1к, 2к и Зк - для каждого разведения культуры). В пробирки № 1, 2 и 1к, 2к вносили по 9 мл исследуемого материала, в пробирки № 3 и Зк-9 мл МПБ. Затем в пробирки №1,3 и 1к и Зк добавляли 1 мл индикаторного фага в рабочем разведении, а в пробирки №2 и 2к вносили по 1 мл стерильного МПБ (контроль на присутствие свободного фага). Рабочее разведение фага должно содержать 1x104 фаговых корпускул в 1мл. Пробирки №1 и 1к, в которых находились взвеси воды и индикаторный фаг, являлись опытными. Пробирки №2 и 2к - без фага были контрольными для выявления в пробах воды свободного фага. Пробирки №3 и Зк -контроль на титр индикаторного фага. После культивирования при температуре 37С содержимое каждой пробирки разводили МПБ (рН 7,4-7,6) так, чтобы при высеве 1 мл содержимого из пробирки №3 и Зк (контроль на титр фага) на чашках образовалось несколько десятков негативных колоний (зон лизиса) фага. В пробирке №3 и 3 к индикаторный фаг находился в концентрации нескольких тысяч корпускул в 1 мл, и для того, чтобы получить в конечном разведении несколько десятков корпускул в 1 мл, содержимое пробирки №3 разводили в 20 раз, т.е. 0,25 мл исследуемой смеси вносили в 4,5 мл МПБ. Содержимое опытных пробирок №1, 1к и №2, 2к разводили аналогично. Ввиду того, что селекционированные нами фаги являются термостабильными, то инактивацию микрофлоры разведенных смесей пробирок №1 и 1к, №2 и 2к, №3 и Зк мы проводили путем прогревания в водяной бане при температуре 58-60 С в течение 30 минут. После этого содержимое пробирок исследовали на определение числа корпускул бактериофага методом агаровых слоев. Для исследования методом агаровых слоев использовали МПА, содержащий 1,5%, 0,7% агара. 1,5% мясопептонный агар разливали в чашки по 25-30 мл. Чашки подсушивали в боксе или термостате в течение 2-3 часов.
МПА с 0,7% -ным содержанием агара заготавливали заранее в пробирках по 2,5 мл, расплавляли, охлаждали до температуры 46-48 С. В данные пробирки добавляли 0,2 мл бульонной культуры и 1 мл разведенной и прогретой исследуемой смеси, перемешивали и выливали вторым слоем на чашки с 1,5%-ным МПА. Через 20-30 минут после застывания верхнего слоя агара чашки помещали в термостат на 12-16 часов. Учет результатов проводили согласно показателям таблицы 20.
По результатам проведенных опытов установлено (таблица 28), что увеличение титра фага более чем в 5 раз произошло уже при концентрации 103 микробных клеток цитробактеров в 1 мл водопроводной воды для фагов С-52 УГСХА и С-66 УГСХА и 104м.к./мл для фага С-61 УГСХА.
Для этого пробы комбикорма, весом 5-10 г вносили в стерильные колбы объемом 100 мл, заливали стерильным МПБ из расчета 10 мл бульона на 1 г. В опытные колбы вносили индикаторные культуры С. amalonaticus №11, С. freundii №16 и C.freudii №9 в концентрации 105; 104; 103; 102; 10і м.к. в 1 мл и брали колбы с пробой комбикорма не контаминированных бактериями рода Citrobacter.
Содержимое колб, встряхивали в шуттель-аппарате с последующим отстаиванием взвеси в течение 10 минут. Приготавливали для опытной и контрольной проб по 6 широких пробирок (диаметр 20 мм) и нумеровали их (1, 2, 3 и соответственно 1к, 2к и Зк - для каждого разведения культуры). В пробирки № 1, 2 и 1 к, 2к вносили по 9 мл исследуемой взвеси комбикорма, в пробирки № 3 и Зк-9 мл стерильного МПБ. Затем, в пробирки №1, 3 и 1к и Зк добавляли 1 мл индикаторного фага (С-52 УГСХА, С-61 УГСХА и С-66 УГСХА) в рабочем разведении, а в пробирки №2 и 2 к в носили по 1 мл стерильного МПБ (контроль на присутствие свободного фага).
Рабочее разведение фага должно содержать 1x104 корпускул в 1мл. При титре фага, равном 2x10 частиц в 1мл, фаг разводили 1:10000, при титре фага, равном 1-2x109 частиц в 1 см3- 1:100000.
Пробирки №1 и 1к, в которых находились взвеси комбикорма и индикаторный фаг, являлись опытными. Пробирки №2 и 2к - без фага были контрольными для выявления в пробах фекалий свободного фага. Пробирки №3 и Зк -контроль на титр индикаторного фага.
