Содержание к диссертации
Стр.
Перечень условных обозначений 2
Введение 8
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 19
Концепция факторов риска заболеваний 19
Микробы - факторы риска пародонтита 23
Пародонтопатогенные бактерии - индикаторы риска 23 пародонтита
Современные представления о роли вирусов семейства 41 Herpesviridae в этиопатогенезе пародонтита
1.3. Генетические факторы риска пародонтита 50
2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ И МЕТОДЫ ИССЛЕ
ДОВАНИЯ 61
2.1. Методы лабораторных исследований 61
2.1.1 Забор исследуемого материала 61
2.1.2. Определение ДНК Prevotella intermedia, Bacteroides for-
sythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomy-
cetemcomitans и Porphyromonas gingivalis с помощью
набора реактивов "Мультидент - 5 " 62
Выделение ДНК 62
Амплификация ДНК 62
Детекция продуктов амплификации 63
2.1.3. Определение ДНК пародонтопатогенов с помощью на
бора реактивов "microDent" ("Hain Diagnostica") 64
Полимеразная цепная реакция 64
Выявление пародонтопатогенных бактерий методом обратной гибридизации 65
2.1.4. Определение ДНК вирусов семейства Herpesviridae 67
2.1.4.1. Идентификация ДНК CMV, HSV 1,2 и ЕВV с помощью
ПЦР 67
2.1.4.2. Детекция ДІЖ CMV, HSV 1,2 и EBV методом электро
фореза в агарозном геле 67
2.1.5. Типирование генов HLA 68
Выделение ДНК из соскобов слизистой щеки 69
Клонирование выделенной ДНК 69
Регистрация результатов 71
2.1.6. Изучение полиморфизма генов IL - 1а и IL-1(3 71
Выделение ДНК из исследуемого образца 72
Проведение ПЦР 72
Детекция продуктов амплификации методом обратной гибридизации 72
2.1.7. Микробиологическое исследование 76
Забор исследуемого материала 76
Выделение чистых культур и их идентификация 76
2.1.8. Иммуноферментный анализ содержания антител к Hu
man cytomegalovirus, Herpes simplex -1, 2 virus и Epstein
- Barr virus (твердофазным методом) в сыворотке кро
ви 77
2.2. Методы клинического обследования пациентов 78
Определение гигиенического индекса полости рта 79
Оценка папиллярно-маргинально-альвеолярного индекса 80
Изучение степени кровоточивости десны после зондирования 82
Определение глубины пародонтальных карманов 82
Исследование степени подвижности зубов 82
Определение пародонтального индекса 83
Рентгенологические методы исследования 85
Характеристика обследованных пациентов 86
2.5. Статистические методы и критерии 88
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 91
3. РАЗРАБОТКА ТЕСТ - СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНК
ПАРОДОНТОПАТОГЕННЫХ МИКРОБОВ С ПОМОЩЬЮ МО
ЛЕКУЛЯРНО - ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ 91
Разработка набора реактивов для определения ДНК паро-донтопатогенных микробов Prevotella intermedia sensu stricto, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actino-bacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis при помощи мультиплексной полимеразной цепной реакции 92
Анализ информативности молекулярно-генетических маркеров для диагностики и контроля лечения воспалительных заболеваний пародонта, вызванных анаэробными микробами 101
Изучение особенностей состава пародонтопатогенной микрофлоры у больных ХГП 101
Апробация набора реактивов "Мультидент - 5" при различных воспалительных заболеваниях ротовой полости и челюстно-лицевой области 110
Апробация набора реактивов "Мультидент - 5" при мониторинге эффективности проводимого лечения 116
4. ИССЛЕДОВАНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ВИДОВОГО СОСТАВА
ОСНОВНЫХ ПАРОДОНТОПАТОГЕНОВ У ПАЦИЕНТОВ С
ХРОНИЧЕСКИМ ГЕНЕРАЛИЗОВАННЫМ ПАРОДОНТИТОМ И
У ЛИЦ СО ЗДОРОВЫМ ПАРОДОНТОМ 124
4.1. Результаты клинического обследования пациентов 124
Характеристика обследованных пациентов. Принципы разделения на группы 124
Результаты индексных оценок 129
Изучение особенностей состава пародонтопатогенов (Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Bacter-oides forsythus, Actinobacillus actinomycetemcomitans и Treponema denticola) с помощью тест - системы "Муль-тидент - 5" 139
Результаты исследования состояния специфического противовирусного иммунитета 152
Исследование особенностей состава вирусов семейства Herpesviridae с помощью ПНР 162
Особенности состава пародонтопатогенов в зависимости
от присутствия вирусов семейства Herpesviridae 172
Оценка взаимосвязи пародонтальных индексов с ассоциациями пародонтопатогенов 174
Анализ влияния вирусов на значения пародонтальных индексов 186
Аллельный полиморфизм генов IL-la и IL-1J3 у больных хроническим генерализованным пародонтитом 197
Полиморфизм генов HLA класса II в норме и у пациентов
с воспалительными заболеваниями пародонта 208
РАЗРАБОТКА АЛГОРИТМОВ ДИАГНОСТИКИ ХГП НА ОС
НОВЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ И ИММУНОГЕНЕТИЧЕ-
СКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ 239
Корреляционный анализ предикторов с целью их агрегирования 239
Изучение зависимости глубины пародонтального кармана
от агрегированных переменных (факторов) 247
Анализ зависимости степени тяжести заболевания от агрегированных предикторов 253
Алгоритм экспресс - диагностики степени тяжести хронического генерализованного пародонтита по микробио-
логическим показателям 268
6. ОБСУЖДЕНИЕ 275
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 330
ВЫВОДЫ 333
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 335
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 339
Введение к работе
Актуальность исследования
Среди важнейших проблем современной стоматологии воспалительные заболевания пародонта занимают одно из ведущих мест. Главной причиной потери зубов в средней и старшей возрастных группах населения нашей страны является пародонтит [4, 5, 6, 13]. Проявление и прогрессирование признаков па-родонтита зависит от многих факторов и детерминант, включая индивидуальные особенности субъекта, социальные, поведенческие, системные, генетические факторы, изменения на уровне зубов, микробный состав зубного налета и другие индикаторы и факторы риска [81, 143, 146, 157, 193, 209, 226, 227, 234]. В связи с большим количеством признаков, влияющих на развитие и прогрессирование пародонтита, трудно понять, в результате каких процессов происходит инициирование и прогрессирование заболевания. Не всегда понятно, какие из этих терминов применяют в стоматологической литературе, каким образом клиницисты используют такую информацию. Однако, в зависимости от результатов оценки факторов, связанных с началом и прогрессированием заболеваний пародонта, выбирают дизайн исследования и уровень значимости результатов измерения, определяющих силу ассоциаций каждого индикатора риска и их использование для принятия клинического решения [209, 213, 318, 334].
В настоящее время не существует специфических и чувствительных диагностических тестов определения возможного прогрессирования заболевания на уровне индивидуума [193, 233]. Считается, что пародонтит можно успешно лечить в начальных стадиях заболевания. Однако часто не ясно, какие признаки могли бы являться факторами риска потери зубодесневого прикрепления на этих стадиях [390].
Накопленный за последние десятилетия опыт свидетельствует, что ведущая роль в формировании воспалительного процесса в полости рта принадлежит резидентной облигатной анаэробной и микроаэрофильной микрофлоре. К
агентам, индуцирующим длительное воспаление и разрушение тканей десны и
альвеолярного отростка, обычно относят экзо- и эндотоксины пародонтопато-генных бактерий Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Actinobacillus actino-mycetemcomitans), Tannerella forsythia (Tannerella forsythia, Bacteroides forsythus), Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia и др. [18, 59 - 61, 157, 160, 282, 390, 391]. В связи с этим основной целью терапии заболеваний пародонта является уничтожение его возбудителей и устранение отрицательных последствий их воздействия на окружающие ткани. Трудности лечения воспалительных процессов в тканях пародонта связаны с наличием, так называемых, торпидных или устойчивых к терапии форм пародонтита, которые, в определенной степени, связаны с длительной персистенцией пародонто-патогенных видов микробов. Эффективность ортопедических и хирургических методов лечения, включая дентальную имплантацию, существенно ограничивают осложнения инфекционно-воспалительного характера. Однако ранее в нашей стране диагностика данных видов бактерий не проводилась из-за отсутствия соответствующих методов их выявления. Это могло отрицательно отражаться как на не своевременном выявлении возбудителей заболеваний пародонта, так и на не адекватном лечении. В последнее время дискутируется вопрос о роли вирусных инфекций в прогрессировании деструктивных процессов в пародонте и характере изменений иммунного статуса больных пародонтитом при персистенции вирусов [58, 61 - 63, 120 - 128, 344 - 348, 361 - 367]. Однако роль вирусной инфекции в этиологии генерализованного пародонтита до настоящего времени в достаточной степени не установлена. В отечественной литературе отсутствуют данные о возможной локализации вирусов семейства Herpesviridae в пародонтальных карманах больных с различными формами пародонтита. Остается также открытым вопрос о характере изменений иммунного статуса больных пародонтитом при персистенции вирусов. Дальнейшей разработки требуют методы диагностики и лечения этого заболевания.
Исход и течение инфекционного процесса в пародонте могут быть предопределены не только вирулентностью микробов, но и генетическим полимор-
10 физмом организма человека [197, 234 - 237, 257, 272, 386, 417]. К настоящему
времени накоплено немало данных о наличии ассоциативных связей антигенов HLA с различными формами пародонтита у лиц с различной этнической принадлежностью [16, 27, 31, 163, 239]. Молекулярное типирование аллелей HLA класса II, пришедшее на смену серологическому выявлению антигенов, позволило анализировать аллельный уровень с более высокой разрешающей способностью, при этом были выявлены как позитивные, так и негативные ассоциации некоторых маркеров HLA класса П с пародонтитом [99, 376, 387, 386]. Исследование полиморфизма генов HLA и IL - 1 [38, 39, 134, 234 - 236] может играть важную роль для выявления предрасположенности и прогнозирования течения воспалительных заболеваний пародонта. Однако полученные результаты во многом противоречивы и неоднозначны, что требует дальнейшего более детального изучения данной проблемы. В нашей стране подобные исследования ранее не проводили.
Современное развитие науки позволило разработать и внедрить в диагностическую практику более совершенные, информативные и достоверные методы исследований, позволяющие по-новому оценить этиологию и патогенез воспаления, уточнить некоторые неясные до недавнего времени этиопатогенетиче-ские механизмы. Поэтому представляется необходимым разработать и внедрить в практику отечественные наборы реактивов для выявления генетических маркеров пародонтопатогенов с помощью полимеразной цепной реакции. Актуальным является более пристальное и всестороннее изучение микробиологических и иммуногенетических маркеров риска пародонтита и их использование в многофакторном анализе.
Цель исследования
Целью диссертационной работы являлось повышение эффективности диагностики генерализованного пародонтита на основании разработки микробиологических и иммуногенетических критериев.
Задачи исследования
Разработать тест - систему (набор реактивов) для идентификации основных пародонтопатогенов (Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Bacteroides forsythus, Actinobacillus actinomycetemcomitans и Treponema denticola) с помощью молекулярно-генетических методов.
Оценить информативность использования молекулярно-генетических маркеров для диагностики и контроля лечения воспалительных заболеваний пародонта, вызванных анаэробными микробами.
Изучить видовой состав основных пародонтопатогенов (P. gingivalis, Р. intermedia, В. forsythus, A. actinomycetemcomitans и Т. denticola) с помощью новой отечественной тест-системы "Мультидент - 5" и их ассоциаций с клиническими параметрами у больных хроническим генерализованным пародонтитом и лиц со здоровым пародонтом.
Исследовать роль вирусов семейства Herpesviridae (HSV 1 и HSV 2 типов, EBV и CMV) в этиопатогенезе генерализованного пародонтита.
Определить с помощью высокоразрешающего метода ДНК - типирования особенности аллельного полиморфизма генов HLA класса II (DRB1, DQA1, DQB1), характерные для представителей смешанной популяции г. Москвы, чувствительных и резистентных к пародонтиту.
Оценить полиморфизм генов IL- 1а и IL - ір у больных генерализованным пародонтитом тяжелой степени в различных возрастных группах и людей со здоровым пародонтом с помощью молекулярно-генетических методов исследований (полимеразной цепной реакции и обратной гибридизации).
Обосновать критерии определения микробиологических и иммуногене-тических индикаторов риска генерализованного пародонтита для оптимизации диагностики и прогнозирования характера течения воспалительных заболеваний пародонта с помощью однофакторных и многофакторных методов статистического анализа.
Разработать алгоритм прогнозирования глубины пародонтального кармана у пациентов на основе линейной регрессионной модели, включающей данные выявления основных пародонтопатогенных бактерий, вирусов и параметров иммуногенетического статуса пациента.
Разработать алгоритм диагностики степени тяжести хронического генерализованного пародонтита, основанный на построении полиномиальной логистической регрессии с упорядоченным откликом, включающей в качестве предикторов микробиологические и иммуногенетические показатели пациента.
Разработать алгоритм диагностики поражений тканей пародонта, ассоциированных с герпесвирусной инфекцией, на основе комплексной оценки данных иммуноферментного определения антител к вирусам и обнаружения ДНК пародонтопатогенов и вирусов молекулярно-биологиче-ским методом.
Научная новизна
В представленной работе впервые в Российской Федерации:
разработан и всесторонне апробирован набор реактивов для молеку-лярно-генетического выявления ДНК пяти основных пародонтопатогенных бактерий - A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. intermedia, В. forsythus и Т. denticola;
уточнена этиологическая роль перечисленных выше и некоторых других видов микроорганизмов и установлена степень их участия в развитии острого и хронического воспаления тканей пародонта; выявлены маркеры ДНК вирусов герпеса 1 и 2 типов, вируса Эпштейна - Барр и цитомегаловирусов в содержимом пародонтальных карманов у больных хроническим генерализованным пародонтитом с помощью полимеразнои цепной реакции и определена относительная частота их выявления;
13 3) с помощью молекулярно - генетических методов исследований изучена
взаимосвязь аллельного полиморфизма генов HLA класса II (DRB1, DQA1, DQB1) и генов IL- 1а и IL - ір у представителей смешанной популяции г. Москвы, чувствительных и резистентных к пародонтиту, с особенностями течения воспалительного процесса и предрасположенностью к развитию генерализованного пародонтита;
определена диагностическая ценность факторов и индикаторов риска для оптимизации диагностики и прогнозирования характера течения воспалительных заболеваний пародонта;
определены наиболее значимые диагностические и прогностические критерии осложненного характера течения воспалительного процесса на основании анализа микробиологических и иммуногенетических показателей;
разработаны алгоритмы комплексной клинико-лабораторной, иммуно-генетической и микробиологической диагностики генерализованного пародонтита, позволяющие обосновать и уточнить этиопатогенетический диагноз заболевания, назначать адекватную антимикробную терапию, направленную на элиминацию патогенов, создать оптимальные условия для последующего хирургического или ортопедического лечения, контролировать стабильность наступившей ремиссии и своевременно прогнозировать возможные рецидивы заболевания.
Практическая значимость
Улучшение квалифицированной помощи пациентам с хроническими воспалительными заболеваниями пародонта за счет более совершенной диагностики и более глубоких теоретических знаний особенностей развития и течения воспалительных процессов в пародонте.
Предложен новый отечественный набор реактивов для диагностики и контроля эффективности лечения воспалительных заболеваний пародонта с использованием молекулярно - генетических методов исследований.
14 Определен исходный микробиологический статус населения в различных
возрастных группах и выявлены группы людей с риском развития воспалительных заболеваний пародонта, что позволяет провести профилактику повторного заражения членов семьи больного. Полученный массив данных может быть использован в качестве контроля для дальнейших исследований данной проблемы.
Установлена взаимосвязь аллельного полиморфизма генов HLA класса II (DRB1, DQA1, DQB1), IL - 1а и IL - 1{3 у представителей смешанной популяции г. Москвы, чувствительных и резистентных к пародонтиту, с особенностями течения воспалительного процесса и предрасположенностью к развитию пародонтита и может быть использована в исследованиях по проблеме "HLA и болезни".
Разработаны новые критерии на основании микробиологических и имму-ногенетических показателей для постановки правильного диагноза и выбора соответствующего способа лечения, получения объективных данных об эффективности проводимого лечения.
Обосновано применение молекулярно - биологических и иммунофер-ментных методов для диагностики и контроля эффективности лечения герпес-вирусной инфекции у больных хроническим генерализованным пародонтитом. Предложен соответствующий диагностический алгоритм.
Положения, выносимые на защиту
1. Новая отечественная тест - система "Мультидент - 5" позволяет определять ДНК пародонтопатогенньгх микробов Prevotella intermedia sensu stricto, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomy-cetemcomitans, Porphyromonas gingivalis с помощью мультиплексной по-лимеразной цепной реакции и предназначена для использования в диагностике и контроле лечения воспалительных заболеваний пародонта, вызванных анаэробными микробами.
15 Факторами риска хронического генерализованного пародонтита являются
P. gingivalis или комбинации В. forsythus и Т. denticola; P. intermedia, В. forsythus и P. gingivalis; P. intermedia, В. forsythus, Т. denticola и Р. gingivalis; P. intermedia, В. forsythus, Т. denticola, P. gingivalis и A. acti-nomycetemcomitans.
Индикаторами риска развития и прогрессирования хронического генерализованного пародонтита являются пародонтопатогенные виды бактерий P. intermedia, В. forsythus, Т. denticola и A. actinomycetemcomitans; вирусы семейства Herpesviridae: HSV 1 и HSV 2 типов, EBV и CMV, специфичность DRB1 *04 и аллель DQA1 *0301 генов HLA класса П. Аллели генов HLA - DRB1 *01 и HLA - DQA1 *0101 ассоциированы с устойчивостью к различным формам генерализованного пародонтита. Специфичность HLA - DRB1 *04 и аллель DQA1 *0301 являются маркерами риска хронического генерализованного пародонтита, ассоциированного с вирусами семейства Herpesviridae, "протективными" свойствами обладают специфичность HLA - DRB1 *01, аллель локуса DQA1 *0501 и DQB1 *0501.
Предрасположенность к развитию агрессивной формы хронического генерализованного пародонтита у лиц молодого возраста европеоидного происхождения в смешанной популяции г. Москвы ассоциирована с полиморфизмом гена IL - 1а, локализованного в позиции -899, и гена IL - 1(3 в позиции +3953.
Алгоритмы лабораторной диагностики пародонтита на основе статистических моделей (линейной и полиномиальной логистической регрессии с упорядоченным откликом) включают микробиологические и иммуногене-тические показатели риска генерализованного пародонтита. Алгоритм диагностики поражений тканей пародонта, ассоциированных с герпесвирусной инфекцией, основан на комплексной оценке данных им-муноферментного определения антител к вирусам (определение стадии
ГВИ) и обнаружения ДНК пародонтопатогенов и вирусов молекулярно-биологическим методом (окончательный диагноз).
Внедрение в практику
Разработана новая медицинская технология № ФС-2006/043 — У "Диагностика и прогнозирование течения заболеваний пародонта с применением молекулярно - биологических и иммуноферментных систем".
Результаты исследования внедрены в практику работы кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии; кафедры стоматологии общей практики и подготовки зубных техников №2 ФУВС, лаборатории молекулярно - биологических исследований НИМСИ и Клинико - диагностического центра ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава.
Материалы диссертации используются в процессе обучения студентов, интернов, клинических ординаторов и аспирантов на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии и кафедрах стоматологического профиля ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава.
Разработан и внедрен в практику кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии МГМСУ набор реактивов для выявления пяти видов пародонтопатогенов с помощью молекулярно - генетических методов исследований.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на:
Всероссийской конференции "Профилактика основных стоматологических заболеваний" (г. Москва, 2003);
Российско - норвежском симпозиуме "Заболевания пародонта - актуальные проблемы" (г. Москва, 2004);
X и XI Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (г. Москва, 2003, 2004 гг);
17 Втором съезде общества биотехнологов России (г. Москва, 2004);
Всероссийском симпозиуме "Актуальные проблемы стоматологии" Всероссийского конгресса "Современные методы профилактики и лечения заболеваний пародонта" (г. Уфа, 2004);
Всероссийской научно-практической конференции Первого Всероссийского стоматологического форума "Дентал Ревю" (г. Москва, 2004);
II Всероссийской научно-практической конференции "Образование, нау
ка и практика в стоматологии" (г. Москва, 2005);
Второй и третьей научно-практической конференции "Актуальные проблемы медицинской биотехнологии" (г. Анапа, 2005, 2006);
III Всероссийской научно-практической конференции "Образование,
наука и практика в стоматологии" (г. Москва, 2006);
Четвертом съезде общества биотехнологов России (Москва, 2006); VIII международном конгрессе MAKMAX/ASM по антимикробной терапии (г. Москва, 2006);
IV Всероссийской научно-практической конференции "Образование,
наука и практика в стоматологии" (г. Москва, 2007);
совместном заседании сотрудников Научно - исследовательского медицинского стоматологического института; кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии; кафедры стоматологии общей практики и подготовки зубных техников №2 ФУВС; кафедры факультетской терапевтической стоматологии ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава и кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии ГОУ ВПО ММА им. И. М. Сеченова Росздрава (протокол № 7 от 13 мая 2008 г.).
Публикации
По материалам диссертации опубликована 57 научных работ, в том числе 14 — в научных изданиях, рекомендованных ВАК МО РФ, учебные пособия - 4, руководство для студентов - 1, методические рекомендации МЗ и СР для
18 врачей - 1; получен 1 патент РФ № 2306341 на изобретение, опубл. 20.09.2007
Бюл. "Изобретения, полезные модели", 2007, № 26; зарегистрирована медицинская технология № ФС-2006/043 — У.
Объем и структура работы
Диссертация построена по традиционному плану и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 385 страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована 94 рисунками и содержит 80 таблиц. Список литературы включает 72 отечественных и 350 иностранных источников.
