Введение к работе
Актуальность темы. По данным FAO доля бактериальных болезней в среднегодовых потерях урожая сельскохозяйственных растений составляет около 25% (FAO, 2005). Бактерии рода Xanthomonas поражают более 400 видов растений (Leyns et al, 1984), включая основные продовольственные и технические культурные растения. Род Xanthomonas включает более 27 видов (Vauterin et al, 1997), обладающих сходными физиологическими и генетическими признаками. В связи с отсутствием эффективных мер борьбы с бактериозами и недостатком устойчивых сортов растений, ранняя диагностика бактериального заражения семян и посадочного материала является ключевым способом снижения вредоносности заболеваний. В большинстве случаев бактерии рода Xanthomonas специализируются на определенном роде или семействе растений, однако некоторые растения поражаются сразу несколькими видами патогена, а некоторые виды бактерии заражают растения различных семейств и классов.
В последние годы наблюдается усиление вредоносности бактериозов, что является результатом нескольких факторов: 1) появления новых штаммов фитопатогенных бактерий, которые поражают более широкий круг сельскохозяйственных культур; 2) глобального изменения климата; 3) распространения патогенов из-за расширяющихся международной торговли и туризма; 4) внедрения индустриальной технологии растениеводства (Ежегодник ГЭП, 2006). В связи с этим проблема идентификации патогена становится все более актуальной при диагностике зараженности материала. Недостатком официально рекомендованных методов диагностики является тестирование штаммов на одном таксономическом уровне, и только для ожидаемой группы фитопатогенных бактерий. Кроме этого, диагностика фитопатогенов затруднена присутствием на растении эпифитных бактерий родственных видов (Vauterin et al, 1997). Применение интегрального анализа, куда входят фенотипические и молекулярные методы для всех таксономических уровней, позволит диагностировать штаммы не только ожидаемых групп бактерий, но и новых, потенциально вирулентных групп. Цель и задачи исследования. Целью работы явилась оценка разнообразия последовательностей ключевых генов и межгенных регионов ДНК у наиболее вредоносных в России видов бактерий рода Xanthomonas для последующей разработки диагностических молекулярных маркеров. Задачи исследования состояли в следующем:
Проанализировать коллекцию штаммов X. campestris, X. vesicatoria и других видов бактерий рода Xanthomonas и выбрать штаммы представительные для наиболее распространенных в Российской Федерации фенотипических/генотипических групп Xanthomonas.
Изучить фенотипическое разнообразие выбранных штаммов.
Определить последовательности таксономически важных генов (16S рРНК, gyrB, cyt-P450 сем. CYP133B3/B4, ХссОООб, Хсс0007, avrXccC), межгенных регионов (16S-23S рРНК ITS и Хсс0006-000Т). Изучить
генетически индуцированную делецию гена авирулентности avrXccC, приводящую к изменению специализации патогена.
4) Разработать праймеры и протоколы ПЦР-диагностики фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas на уровне рода, вида и патоварианта. Научная новизна работы. При выполнении настоящей работы впервые проведено комплексное исследование разнообразия последовательностей генов gyrB, cyt-P450 сем. CYP133B3/B4 и региона Хсс0006-0007 для представительного набора российских и коллекционных штаммов X. campestris pv. campestris и родственных видов бактерий. Выявлены устойчивые меж- и внутривидовые различия последовательностей генов 16S рРНК, gyrB, cyt-P450 сем. CYP133B3/B4, межгенного региона 16S-23S рРНК ITS и региона Хсс0006-0007 для Xanthomonas spp..
Впервые обнаружены бактерии вида X. arboricola, поражающие крестоцветные, злаковые и сложноцветные растения, полифаговость (многохозяинность) которых связана с уникальным физиологическим свойством - утилизацией хинной кислоты. Впервые в России обнаружены штаммы X. campestris pv. raphani, поражающие пасленовые растения и относящиеся к расе 3 этого патогена. Для диагностики этого патогена предложены специфические праймеры на основе характерных нуклеотидных последовательностей регионаХсс0006-0007.
Установлены нуклеотидные замены в ДНК последовательностях генов gyrB, cyt-P450 сем. CYP133B3/B4 и 16S-23S рРНК ITS и региона Хсс0006-0007, характерные для различных видов и внутривидовых групп бактерий рода Xanthomonas, пригодные для создания диагностических маркеров. Созданы и апробированы маркеры для диагностики Xanthomonas spp. на различных таксономических уровнях: рода, вида, патоварианта и рас X. campestris pv. campestris и маркеры для успешной диагностики вида X. arboricola. На основании исследования полиморфизма ДНК последовательностей изученных регионов предложены праймеры и пробы для диагностики видов и патовариантов Xanthomonas.
Доказана связь изменения расы патогена X. campestris pv. campestris с делецией гена avrXccC, индуцированной заражением растения с геномом ABC (т.н. ccBrassica composita") и геном устойчивости Rxccl. Практическая значимость работы. Полученные результаты могут использоваться для оценки генетического разнообразия фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas; диагностики, детекции и идентификации бактерий данного рода; разработки рекомендаций для молекулярной диагностики бактерий.
Апробация работы. Материалы были представлены на российских и международных конференциях: "Bioinformatics of Genome regulation and structure"-BGRS (Новосибирск, 2006); "2-ой Международной конференции по болезням томатов" (Турция, 2007); "Международной конференции молодых ученых" (Киев, 2007); "Вычислительная филогенетика и геносистематика" (Москва, МГУ, 2007); VIII молодежная научная конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва,
2008), а также "Школе молодых ученых и аспирантов по молекулярной
биологии-NOVA" (Финляндия, 2008).
Публикации. Основные материалы, обсуждаемые в диссертации,
опубликованы в статьях (в т.ч. 1 статья в журнале списка ВАК) и
материалах конференций.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на
