Содержание к диссертации
Введение
Часть 2. Обзор литературы 11
Глава 1. Метан и метанол: круговорот в биосфере и экологическое значение 11
Глава 2. Аэробные метилотрофные бактерии 15
2.1. Общая характеристика 15
2.2. Энергетический метаболизм метано- и метилотрофов 21
2.3. Конструктивный метаболизм метано- и метилотрофов 28
2.4. Биохимическая основа облигатной метанотрофии 32
2.5. Методы оценки разнообразия и распространении метилотрофных бактерий 35
Глава 3. Общая характеристика семейства Beijerinckiaceae 41
3.1. Род Beijerinckia: история, таксономия и физиология 41
3.2. Открытие способности к метилотрофии в семействе Beijerinckiaceae 45
3.3. Роль метано- и метилотрофных представителей семейства Beijerinckiaceae как компонентов микробного сообщества природных экосистем и как объектов для анализа эволюционной основы облигатной метанотрофии 50
3.3.1. Роль представителей Beijerinckiaceae как агентов окисления метана 51
3.3.1:1. Кислые торфяные болота. 51
3.3.1.2. Кислые почвы 52
3.3.2. Роль представителей Beijerinckiaceae как агентов фиксации азота 53
3.3.3. Изучение эволюционной основы облигатной метанотрофии путем сравнительного анализ геномов представителей Beijerinckiaceae 54
Часть 3. Экспериментальная часть 57
Глава 4. Объекты и методы исследования 57
4.1. Получение накопительных культур и изолятов метано- и метилотрофных бактерий 57
4.1.1. Образцы торфа 57
4.1.2. Методика получения накопительных культур 57
4.1.3. Методика получения изолятов метано- и метилотрофов 57
4.2. Составление таксономической характеристики изолятов 59
4.2.1. Методы исследования морфологических и физиологических характеристик культур 59
4.2.2. Аналитические методы 61
4.2.3. Электронная микроскопия 61
4.2.4. Энзимологпческие исследования 62
4.2.5. Определение состава хинонов 63
4.2.6. Анализы состава жирных кислот и лшшдов 63
4.2.7. Экстракция ДНК из микробных клеток 63
4.2.8. Определения нуклеотидного состава ДНК и ДНК-ДНК гомологии 64
4.2.9. ПЦР-амплификация 64
4.2.10. Редактирование полученных нуклеотидных последовательностей 65
4.2.11. Фотодокументирование материалов и обработка данных 66
4.3. Оценка численности метанотрофных бактерий в болотах с использованием метода FISH 66
4.3.1. Процедура фиксации образцов торфа 66
4.3.2. Процедура гибридизации фиксированных образцов с зондами 67
4.3.3. Использование ранее разработанных олигонуклеотидных зондов 68
4.3.4. Разработка новых олигонуклеотидных зондов и проверка их специфичности 68
4.3.5. Микроскопический анализ 68
4.3.6. Детекция и учет клеток метанотрофов в нативных образцах 69
Результаты и обсуждение 70
Глава 5. Новые изоляты облигатно ацидофильных метилотрофных бактерий семейства Beijerinckiaceae 70
5.1. Изоляты, выделенные из кислой лесной почвы 70
5.1.1. Морфология 70
5.1.2. Физиологические характеристики 72
5.1.3. Пути ассимиляции углерода 76
5.1.4. Анализ филогенетических и функциональных генов 77
5.2. Штаммы, выделенные из сфагновых болот 81
5.2.1. Морфология 82
5.2.2. Физиологические характеристики 83
5.2.3. Анализ филогенетических и функциональных генов 85
Глава 6. Новые факультативно метанотрофные бактерии семейства Beijerinckiaceae 88
6.1. Метанотрофы с растворимой формой ММО 88
6.1.1. Морфология 88
6.1.2. Физиологические характеристики 89
6.1.3. Анализ филогенетических и функциональных генов 92
6.2. Новые метанотрофы с мембранной формой ММО 95
6.2.1. Морфология 96
6.2.2. Физиологические характеристики 97
6.2.3. Анализ филогенетических и функциональных генов 100
Глава 7. Оценка роли факультативных метанотрофов в общей структуре метанокисляющего фильтра болотных экосистем 104
7.1. Численность факультативных метанотрофов родов Methylocella и Methyloferula в сфагновом торфе 104
7.2. Вклад факультативных метанотрофов в общую метанокисляющую активность сфагнового торфа 106
Заключение 108
Выводы 110
Список литературы 111
- Метан и метанол: круговорот в биосфере и экологическое значение
- Открытие способности к метилотрофии в семействе Beijerinckiaceae
- Физиологические характеристики
- Вклад факультативных метанотрофов в общую метанокисляющую активность сфагнового торфа
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Аэробные метано- и метилотрофные бактерии - это уникальные группы прокариотных микроорганизмов, способных использовать метан и его одноуглеродные производные в качестве единственного источника углерода и энергии (Sohngen, 1906; Anthony, 1982; Whittenbury, Krieg, 1984; Hanson, Hanson, 1996; Bowman, 2000; Гальченко, 2001; Lidstrom, 2006). Ключевым ферментом метанотрофов является метанмонооксигеназа (ММО), катализирующая окисление СН4 до СН3ОН и существующая в двух формах - мембранной (мММО) и растворимой (рММО). Окисление метанола до формальдегида осуществляется другим ключевым ферментом - метанолдегидрогеназой (МДГ), которым обладают как метанотрофы, так и метилотрофные бактерии. Эти микроорганизмы формируют естественный бактериальный фильтр, регулирующий поступление метана в атмосферу, а также определяют баланс С і-соединений в природных экосистемах (Заварзин, 1979, 1984; Conrad, 1996).
Метилотрофия широко распространена среди представителей различных филогенетических групп домена Bacteria, тогда как способность к росту на метане на настоящий момент выявлена лишь у организмов двух групп, Proteobacteria и Verrucomicrobia (Hanson, Hanson, 1996; Op den Camp et al., 2009). Метанотрофные Verrucomicrobia открыты недавно, и сведения об их биологии пока ограничены. Гораздо лучше изучены метанотрофные представители Proteobacteria, формирующие филогенетически тесные кластеры в пределах Alpha- и Gammaproteobacteria и не обнаруживающие близкого родства с гетеротрофными бактериями. Единственным исключением является семейство Beijerinckiaceae класса Alphaproteobacteria, которое объединяет умеренно ацидофильные, аэробные бактерии с различными типами метаболизма - гетеротрофов, метано- и метилотрофов. С момента формирования (Alston, 1936; Starkey et al., 1939) и до недавнего времени все представители этого семейства считались гетеротрофными азотфиксаторами, использующими широкий спектр органических соединений. Эти представления изменились после описания умеренно ацидофильных метанотрофных бактерий родов Methylocella и Methylocapsa, которые оказались ближайшими филогенетическими родственниками гетеротрофов рода Beijerinckia (Dedysh et al., 2000, 2002). Единственный описанный представитель рода Methylocapsa, Methylocapsa acidiphila, является облигатным метанотрофом, обладающим мММО. Род Methylocella ныне насчитывает три вида, М. palustris, М. silvestris и М. tundrae (Dedysh et al., 2000, 2004, Dunfield et al., 2003), представители которых, в отличие от остальных ныне известных метанотрофов, обладают одной только рММО. Еще одной уникальной для метанотрофов особенностью бактерий рода Methylocella является их способность к росту не только на С і-соединениях, но и на ацетате, пирувате, сукцинате, малате и этаноле (Dedysh et al., 2005а; Theisen et al., 2005). Представления о метаболическом потенциале бактерий рода Beijerinckia также были пересмотрены после выявления у В. mobilis способности к автотрофной
метилотрофии (Dedysh et al., 20056). Итак, в настоящий момент семейство Beijerinckiaceae включает в себя истинных гетеротрофов, облигатных метанотрофов, а также организмы с различными типами "промежуточного" метаболизма -факультативных метано- и метилотрофов.
Применение молекулярных подходов для изучения экологии микроорганизмов выявило чрезвычайно широкое распространение представителей Beijerinckiaceae. Это объясняется тем, что большинство наземных экосистем Северного полушария характеризуются кислой реакцией среды, к которой хорошо адаптированы организмы этого семейства. Нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК представителей Beijerinckiaceae были обнаружены в лесных почвах и почвах агроценозов, в болотах различных типов, а также в покрывающих почвах свалок (Radajewski et al., 2000, 2002; Morris et al., 2002; Knief et al., 2003; Raghoebarsing et al., 2005; Lau et al., 2007; Cebron et al., 2007; Chen et al., 2007, 2008). Анализ этих последовательностей, однако, не позволяет сделать однозначных заключений о метаболическом типе тех организмов, которым они принадлежат, из-за гетерогенности этой группы бактерий. Количество культивируемых метилотрофных представителей этого семейства также очень мало, что объясняется, в частности, сложностью работы по их выделению.
Таким образом, микробные агенты окисления Сі-соединений в кислых наземных экосистемах остаются изучены недостаточно. Устранению этого пробела было посвящено настоящее исследование, направленное на расширение спектра культивируемых метано- и метилотрофных представителей семейства Beijerinckiaceae и изучению их метаболического потенциала и особенностей биологии.
Цели и задачи исследования.
Цель работы - изучение фенотипического и филогенетического разнообразия метано- и метилотрофных бактерий семейства Beijerinckiaceae и выявление различий в метаболическом потенциале и экологических стратегиях бактерий этой группы. Для достижения этой цели нами были поставлены следующие задачи:
Получение новых изолятов метано- и метилотрофных бактерий семейства Beijerinckiaceae, изучение их физиологии, спектра используемых субстратов, а также составление полной таксономической характеристики этих бактерий.
Определение функционального потенциала и ростовых характеристик облигатно- и факультативно- метанотрофных представителей семейства Beijerinckiaceae для выявления различий экологических стратегий, используемых этими организмами.
Оценка роли факультативных метанотрофов в общей структуре бактериального метанокисляющего фильтра болотных экосистем.
Научная новизна и значимость работы.
Значительно расширено разнообразие культивируемых представителей семейства Beijerinckiaceae с метано- и метилотрофными типами метаболизма.
Показано, что эти бактерии широко распространены в наземных экосистемах с кислой реакцией среды. Впервые выявлен существенный вклад факультативных метанотрофов в общую метанокисляющую активность торфа сфагновых болот.
Описан и узаконен новый род и вид облигатно ацидофильных метилотрофных бактерий семейства Beijerinckiaceae -Methylovirgula ligni gen. nov., sp. nov. Два новых таксона факультативно метанотрофных бактерий семейства Beijerinckiaceae -'Methyloferula sphagni' gen. nov., sp. nov. и 'Methylocapsa aurea' sp. nov. находятся в процессе узаконивания. Типовые штаммы этих бактерий депонированы в международных коллекциях микроорганизмов DSMZ, NCIMB, LMG и ВКМ.
Практическая значимость.
Показано широкое распространение факультативной метанотрофии в микробном мире, что вносит коррективы в ранее принятое представление о том, что доступность СН4 является единственным энергетическим фактором, регулирующим процессы его микробного окисления в природе.
Существенно дополнена база данных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, ртоА, ттоХ, mxaF и nifli метилотрофных бактерий, которая может быть использована для разработки молекулярных методов детекции этих микроорганизмов, основанных на использовании ПЦР или микрочипов.
Получены новые культуры ацидофильных метанотрофных микроорганизмов, обладающих растворимой формой ММО, имеющих хороший потенциал для применения в биотехнологии очистки кислых природных сред от загрязнения галогенированными алканами и ароматическими углеводородами.
Апробация работы.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных и российских конференциях и симпозиумах:
Международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии: III Международная молодежная школа-конференция», Москва, ИНМИ РАН, 2007.
12th International Symposium on Microbial Ecology, Cairns, Australia. August 17-22, 2008.
XVI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Москва, МГУ, 2009.
3th Congress of European microbiologists. Gothenburg, Sweden, June 28 - July 2, 2009.
Публикации.
Материалы диссертации содержатся в 7 печатных работах: 2 экспериментальных статьях и 5 тезисах.
Объем и структура диссертации.
Метан и метанол: круговорот в биосфере и экологическое значение
Метан и метанол являются биосферно-важными С і-соединениями, играющими ключевую роль в общеэкологических проблемах глобального потепления климата и устойчивости озонового слоя Земли. Целый ряд различных по типу экосистем, находящихся на территории России, являются важнейшими источниками и стоками этих Сі-соединений, определяя, таким образом, их баланс в атмосфере.
Важнейшими источниками поступления метана и метанола в атмосферу являются наземные экосистемы. Величины эмиссии СН4 и СНзОН из этих экосистем приблизительно равны и составляют 10x10 моль год" и 4.9 10 моль год", соответственно (Kolb, 2009). Основные аспекты, определяющие баланс этих соединений в атмосфере, рассмотрены ниже.
Метан.
Метан является вторым по важности парниковым газом после СО2. Его вклад в общий эффект, оказываемый парниковыми газами, составляет 30% (Conrad, 2009). Концентрация метана в атмосфере постоянно увеличивалась с 715 ppbv (объемная концентрация) в доиндустриалыгую эпоху до значения 1770 ppbv в настоящее время. Глобальный бюджет атмосферного метана на сегодняшний день оценивается величинами 500-600 Тг СН4 год"1 (Lelieveld et al., 1998; Wang et al., 2004). Наиболее важные источники метана, определяющие его количество в атмосфере, показаны на Рисунке 1.
Примерно 25% общего количества метана, поступающего в атмосферу, связано с разработкой месторождений полезных ископаемых и со сжиганием ископаемого топлива, а также с окислением органической биомассы. 69% потока СН4 в атмосферу обусловлено деятельностью микроорганизмов, а еще 6% образуется в результате химических процессов из биомассы растений.
Крупнейшими и наиболее важными источниками метана в биосфере Земли являются болотные экосистемы (Conrad, 2009). Антропогенное влияние на активность образования метана в болотах невелико, по крайней мере, по сравнению с искусственно созданными территориями, занятыми рисовыми чеками. Животноводческая деятельность человека определяет еще один важный источник метана - рубец рогатого скота, овец и других жвачных животных. Среди других антропогенных источников СЩ необходимо отметить свалки, в которых происходит разложение органических отходов с образованием больших количеств метана. Метан, продуцируемый в результате процессов брожения в кишечнике термитов, а также метан, образующийся в океане и высвобождающийся из газовых гидратов, вносит сравнительно небольшой вклад в общий бюджет атмосферного СН4.
Количество образовавшегося за год метана имеет тот же порядок величин, что и количество метана, вышедшего из круговорота в различные стоки. Тем не менее, на протяжении долгого времени суммарный сток метана имел чуть меньшие величины, по сравнению с суммарной активностью его образования, что выражалось в медленном, но постоянном увеличении концентрации метана в атмосфере в доиндустриальную эпоху. Следует отметить, что параллельно с возрастанием концентрации метана в атмосфере, происходило увеличение активности его стоков, что, по крайней мере, частично нивелировало изменение в активностях его образования. Наибольший вклад в суммарный сток метана ( 80 %) вносит его фотохимическое окисление, инициированное реакциями с ОН-радикалами. Другими важными стоками является процесс перемещения метана в стратосферу и микробное окисление метана в автоморфных почвах. Для большинства источников метана, приведенных на Рисунке 1, величины продукции СЦ обычно намного больше величин его эмиссии, что объясняется активным окислением значительной части первоначально образовавшегося метана метанотрофными микроорганизмами (Frenzel, 2000; Reeburgh, 2003). Биология и разнообразие этих организмов детально рассмотрены ниже, в главе 2.
Метанол.
Главным источником метанола, поступающего в атмосферу, являются наземные экосистемы. Метанол вносит существенный вклад в атмосферный пул летучих органических веществ (Galbally, Kirstine, 2002) и влияет на формирование озонового слоя в тропосфере (Wennberg et al., 1998; Warneke et al., 1999). Каждый год из отмершей растительной биомассы и живых растений образуется 25x10 " и 3x10 моль метанола, соответственно (Galbally, Kirstine, 2002). Однако, непосредственно в атмосферу поступает всего лишь 4.9x10 моль (Рис. 2., Табл. 1), так как значительное количество образовавшегося метанола окисляется микроорганизмами, обитающими в наземных экосистемах (Galbally, Kirstine, 2002).
В процессе роста растений происходит деметилирование пектинов, ассоциированных с клеточной стенкой растений (Fall и Benson, 1996). Также значительное количество метанола высвобождается при разложении пектина (Donnelly, Dagley, 1980; Schink, Zeikus, 1980; Schink et al., 1981) и лигнина (Warneke et al.,1999).
Итак, ежегодно в наземных экосистемах Земли образуются огромные количества метана и метанола, что оказывает существенное влияние на климат Земли (Denman et al., 2007). Атмосферный баланс этих соединений определяется сложной взаимосвязью их источников и стоков. Метан и метанол являются источниками углерода и энергии для метано- и метилотрофных микроорганизмов, которые обитают в самых разнообразных экосистемах. Благодаря деятельности этих микроорганизмов, способных расти на С і-соединениях, количества данных веществ, попадающие в атмосферу, намного меньше суммарной активности их образования.
Открытие способности к метилотрофии в семействе Beijerinckiaceae
Представления о гетеротрофности всех представителей семейства Beijerinckiaceae изменились после описания умеренно ацидофильных метанотрофных бактерий родов Methylocella и Methylocapsa, которые оказались ближайшими филогенетическими родственниками гетеротрофов рода Beijerinckia (Dedysh et al., 2000, 2002, 2004; Dunfield et al., 2003).
Methylocella spp.
Род Methylocella ныне насчитывает три вида - М. palustris, М. silvestris и М. tundrae. Представители М. palustris были вьщелены из кислых болот Западной Сибири и севера Европейской территории России (Dedysh et al., 2000). Изоляты, впоследствие описанные как М. silvestris (Dunfield et al., 2003) и M. tundrae (Dedysh et al., 2004), были изолированы из лесной и тундровой почв, соответственно. Представители этого рода, в отличие от остальных ныне известных метанотрофов, не имеют мембрансвязанной ММО и обладают одной только растворимой формой фермента.
Клетки Methylocella spp. представляют собой неподвижные, прямые или изогнутые биполярные палочки (Рис. 9). Температурный диапазон для роста 4-30С, с оптимумом при 15-25С, при 37С роста не наблюдается. Способны к росту при значениях рН 4.2-7.5 с оптимумом 5.0-6.0. NaCl ингибирует рост при концентрациях выше 0.5-0.8%, в зависимости от вида.
Все виды рода характеризуются своеобразной ультраструктурой клеток -отсутствием ВЦМ, свойственных представителям других родов метанотрофов, что коррелирует с наличием только растворимой формы ММО. Клетки этих метанотрофов обладают обширным перизплазматическим пространством, а их цитоплазма заполнена системой шаровидых везикул, формирующихся путем инвагинации цитоплазматической мембраны.
Первоначально Methylocella spp. были описаны в качестве облигатных метилотрофов, способных к росту только на Сі-соединениях: метане, метаноле, метиламинах и формиате. В последующих работах было показано, что они также способны к росту на ацетате, манате, пирувате, сукцинате и этаноле (Dedysh et al., 2005). В модельном опыте по доказательству факультативной метанотрофии у Methylocella silvestris BL2T были использованы ацетат и метан в качестве источников углерода и энергии. Методом ПЦР в реальном времени (real time PCR) было показано, что существует четкая корреляция между увеличением числа клеток при росте на метане или ацетате и возрастанием числа копий гена ттоХ. Этот опыт доказал, что организмы, имеющие гены, ответственные за процесс окисления метана, способны к росту на обоих субстратах. Также очень тщательно была проверена чистота культур, выросших на разных субстратах. Таким образом, было достоверно показано, что Methylocella silvestris BL2T является факультативным метанотрофом. При росте на ацетате наблюдалась более высокая скорость роста, и эффективность включения углерода в биомассу была выше, чем при росте на метане. Если в среде присутствовали оба субстрата, сначала потреблялся ацетат, в то время как процесс окисления метана был подавлен.
Представители Methylocella spp., в отличие от остальных ныне известных метанотрофов, обладают одной только растворимой формой ММО. Попытки амплифицировать ген ртоА из ДНК представителей Methylocella, а также гибридизация с фрагментом ртоА из Methylococcus capsulatus Bath не дали результата. Методом SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) было продемонстрировано отсутствие мММО-специфичных полипептидов. Секвенирование полного генома Methylocella silvestris BL2 окончательно развеяло сомнения относительно возможного наличия мММО у этого организма.
В метанотрофных бактериях, которые обладают как мММО, так и рММО, последняя экспрессируется только при низкой концентрации ионов меди в среде, тогда как мММО активна только при высоком отношении медь/биомасса (Stanley et al., 1983). Данная регуляция неприменима по отношению к Methylocella silvestris BL2T. Как было показано Theisen et al. (2005), в клетках Methylocella silvestris BL2T, выращенной как на богатой (1 цМ), так и на бедной (5 пМ) медью среде, были найдены рММО-специфичные полипептиды. Нафталиновый метод, который используется для качественного определения активности рММО, показал положительные результаты в обоих случаях.
Methylocapsa acidiphila.
Единственный описанный представитель рода Methylocapsa, Methylocapsa acidiphila (Dedysh et al., 2002), является облигатным метанотрофом, обладающим мММО. Methylocapsa acidiphila была выделена из сфагнового болота Бакчарское в Западной Сибири. В дальнейших работах (Horz et al., 2002) из пойменной луговой почвы было получено несколько последовательностей гена ртоА, которые были близки к таковым у М. acidiphila.
Грамотрицательные клетки искривленной кокковидной формы, достигающие 0.8-1.2 мкм в длину и 0.5-0.8 мкм в ширину (Рис. 10). Клетки встречаются поодиночке, также могут образовывать конгломераты округлой формы, окруженные внеклеточным полисахаридным матриксом. Покоящиеся клетки близки по ультраструктуре цистам Azotobacter. Клетки не лизируются под действием 2% раствора SDS. Они имеют хорошо развитую систему внутрицитоплазматических мембран, которые представляют собой стопки мембран, расположенных параллельно одной из сторон клеточной стенки (рис. 106). M. acidiphila обладают только мембранной формой ММО. Температурный диапазон для роста 10-30С, с оптимумом при 20-24С, при 37С роста не наблюдается. Способна к росту при значениях рН 4.2-7.2 с оптимумом 5.0-5.5. Растет только на С і-соединениях, ассимиляцию углерода которых проводит через сериновый путь. Ассимилирует метанол при его концентрации в среде менее 0.05%. Обладает способностью к фиксации атмосферного азота. В отличие от всех остальных известных азотфиксирующих метанотрофов (Methylosinus, Methylocystis, Methylocella, Methylococcus и Methylomonas) Methylocapsa acidiphila может расти экспоненциально в жидкой среде без источника связанного азота в полностью аэробных условиях. Эта особенность М. acidiphila также характерна для представителей рода Beijerinckia, которые являются одними из первых бактерий, для которых была показана способность к активной фиксации азота. Следует отметить, что NifH фрагмент из Methylocapsa acidiphila имеет чрезвычайно высокий уровень сходства с таковым у Beijerinckia spp. (98.0-98.5% сходства) и обнаруживает только отдаленное сходство (90.8%) с последовательностью NifH из Methylocella spp. NaCl ингибирует рост при концентрациях в среде выше 0.5%. Основная жирная кислота -18:1со7с. Содержание пар Г+Ц в ДНК 63 моль %.
Физиологические характеристики
Штаммы BW8631 и BW872 являлись облигатно ацидофильными организмами, способными к росту при рН от 3.1 до 6.5, с оптимумом при рН 4.5-5.0 (Рис. 14а). Новые изоляты росли в диапазоне температур от +4 до +30С, причем оптимальный рост наблюдался при 15-18С (Рис.146). Ингибирование роста происходило при содержании NaCl в среде более 0.7 %.
Штаммы BW863 и BW872 являлись аэробными метилотрофами, основным источником углерода и энергии для которых являлся метанол. Он использовался в широком диапазоне концентраций от 0.01 до 2 об.%, с оптимумом при 0.5 - 1 об.%.
Кроме метанола, новые изоляты хорошо росли на этаноле. Слабый рост наблюдался также на малате, сукцинате и пирувате (Рис. 15). Штаммы BW8631 и BW872 не использовали следующие полиуглеродные соединения: арабинозу, глюкозу, ксилозу, лактозу, мальтозу, рамнозу, раффинозу, сахарозу, сорбозу, фруктозу, оксалат, ацетат, формиат, цитрат, манит, мезоинозит, формальдегид.
Для роста культуры требовалось присутствие в среде дрожжевого экстракта в концентрации 40-60 мг/л среды.
В качестве источника азота новые организмы могли использовать аммоний, нитрат, дрожжевой экстракт и мочевину. Также штаммы BW863T и BW872 обладали способностью к фиксации молекулярного азота при росте на среде, не содержащей источника связанного азота, в микроаэробных условиях. Анализ последовательностей гена nifli этих метилотрофов выявил их высокое сходство (86-88%) с последовательностями соответствующих генов ацидофильных метанотрофов рода Methylocella и представителей рода Bradyrhizobium.
Анализ хинонов показал наличие в клетках штаммов BW863T и BW872 убихинона Q 10.
Анализ состава клеточных жирных кислот (ЖК) штаммов BW8631 HBW872 выявил необычно высокое содержание кислоты 18:1ш7с, которая составляла 87-92% общего пула ЖК (Табл. 6). В целом, жирнокислотный профиль новых изолятов был сходен с таковым у представителей рода Methylobacterium (Kato et al., 2005, 2008). Последние, однако, содержали значительные количества кислоты С18:0 и не содержали кислоты суС19:0, которая являлась значимым компонентом в составе жирных кислот штаммов BW863 и BW872. Доминирование кислоты 18:1со7с является характерной особенностью ацидофильных метанотрофов родов Methylocapsa и MethyloceUa (Dedysh et al., 2000, 2002, 2004a; Dunfield et al., 2003). Однако жирнокислотный профиль этих организмов также включал в себя такие важные компоненты, как 16:0, 16:1 cole, 18:0 и су19:1 »8с кислоты, которые в клетках штаммов BW863T и BW872 содержались в минорных количествах или отсутствовали.
Вклад факультативных метанотрофов в общую метанокисляющую активность сфагнового торфа
Особенность регуляции окисления метана у факультативных метанотрофов с растворимой ММО {Methylocella и Methyloferula ) состоит в ингибировании активности ММО при наличии в среде органических субстратов роста, например, ацетата (Theisen et al., 2005). Это дает возможность оценить вклад этих факультативных метанотрофов в Необходимая специфичность гибридизации данного зонда была достигнута при концентрации формамида в гибридизационном буфере 20%.
Разработанный для детекции новых факультативных метанотрофов рода lMethyloferula олигонуклеотидный зонд зонд Mfer-431 (5 TCCCGGGCAAAAGAGCT-3 ) был применен для определения численности целевой популяции микроорганизмов в слое торфа 0-10 см болота Бакчарское, Томской области. Новый зонд использовали в сочетании с ранее предложенными для метанотрофов олигонуклеотидными зондами разного уровня специфичности (см. Материалы и методы). Общая численность выявленных в образцах метанотрофных бактерий варьировала от 4.6x10 до 1.4 107 клеток г"1 торфа, составляя до 15% общего числа клеток бактерий.
Соотношение численности клеток отдельных групп метанотрофных бактерий, выявленных методом FISH в образцах сфагнового торфа болота Бакчарское.
Численность метанотрофов I типа (гибридизация с зондами М84 + М705) была незначительной (0.3 - 6.3 хЮ5 клеток г"1 торфа). Обнаруженные в торфе метанотрофы II типа были представлены двумя группами: MethylosinuslMethylocystis (детекция зондом М-450) и Methylocella/Methylocapsa (зонды Mcell-1026/Mcaps-1032). В составе сообщества доминировали представители группы Methylosinus/Methylocystis, составляя до 76% клеток общую активность окисления метана в сфагновом торфе путем внесения ацетата. Результаты такого модельного эксперимента показаны на Рис. 37. Как видно на графике, внесение ацетата в образец сфагнового торфа до концентрации 0.5 мМ вызывало снижение общей скорости окисления метана в 2 раза, свидетельствуя о переключении факультативных метанотрофов с метанотрофного типа метаболизма на гетеротрофный. Таким образом, вклад факультативных метанотрофов с растворимой формой ММО в общую активность окисления метана в кислых экосистемах может быть весьма значительным. Возможно также, что разнообразие этих организмов не исчерпывается представителями родов Methylocella и Methyloferula , и существуют бактерии с аналогичным типом метаболизма, которые не выявляются ныне имеющимися олигонуклеотидными зондами.
