Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 9
1.1 Роль пикопланктона в гидросфере 9
1.2 Нефть как источник загрязнения акваторий 10
1.3 Процессы самоочищения водоемов от нефтяного загрязнения 16
1.4 Биодеградация нефти и нефтепродуктов гетеротрофным пикопланктоном в море 20
Глава 2 Объекты, материалы и методы исследования 37
2.1 Объекты исследований 37
2.2 Материалы и методы исследований 37
Глава 3 Оценка ассимиляционного потенциала морской воды Северной части Каспийского моря 44
3. 1 Изучение численности сапротрофной и углеводородокисляющей части гетеротрофного пикопланктона 44
3. 2 Изучение потенциальной окислительной способности морской воды.. 51
3.2.1. Определение потенциальной окислительной способности морской воды 51
3.2.2 Изучение численности сапротрофного и углеводородокисляющего микроценоза морской воды при определении ПОС 61
3.3 Оценка ассимиляционного потенциала морской воды по величине биодеградации нефтяных углеводородов 66
Глава 4 Скрининг морских бактерий, обладающих углеводородокисляющими свойствами 71
4.1 Выделение углеводородокисляющих бактерий, исследование их культуральных, морфологических и физиолого-биохимических свойств 71
4. 2 Изучение углеводородокисляющих свойств выделенных бактерий 78
4.2.1 Определение литических свойств 78
4.2.2 Определение эмульгирующей активности 80
4.2.3 Изучение гидрофобно-гидрофильных свойств клеточных стенок 82
4.2.4 Исследование возможности деструкции нефти, парафина и моторного масла 86
4.3 Оценка токсичности нефтедеструкторов и очищенных ими модельных микроэкосистем 92
4.3.1 Оценка токсичности суспензий нефтедеструкторов 92
4.3.2 Оценка токсичности очищенных модельных микроэкосистем 97
4.4 Исследование хозяйственно-полезных свойств нефтедеструкторов 107
4.4.1 Исследование фунгицидных свойств 107
4.4.2 Изучение фитотоксичности и фитостимулирующей активности 110
4.5 Идентификация активного нефтедеструктора, обладающего хозяйственно-полезными свойствами 112
Выводы 115
Список литературы 116
Приложения 140
- Нефть как источник загрязнения акваторий
- Изучение численности сапротрофной и углеводородокисляющей части гетеротрофного пикопланктона
- Выделение углеводородокисляющих бактерий, исследование их культуральных, морфологических и физиолого-биохимических свойств
- Идентификация активного нефтедеструктора, обладающего хозяйственно-полезными свойствами
Введение к работе
Актуальность проблемы. Ассимиляционный потенциал экосистемы моря - это лимитированная способность нейтрализовать и обезвреживать в определенных пределах вредные выбросы, поступающие в морскую среду в результате хозяйственной деятельности (Гусев, 2002). Эта способность лежит в основе процесса самоочищения, который при современном антропогенном воздействии на морскую среду имеет важное значение.
Нефть и нефтепродукты являются одним из крупномасштабных загрязнителей гидросферы, ежегодное попадание которых в окружающую среду оценивается в десятки миллионов тонн. Однако нефтяные углеводороды являются неотъемлемым природным компонентом морской среды и в процессе эволюции выработался довольно эффективный механизм их деструкции (Миронов, 2002).
Самоочищение морских акваторий - комплексный процесс, протекающий под действием физических, химических и биологических факторов, где трансформация нефти и нефтепродуктов гетеротрофным пикопланктоном, а именно входящими в его состав углеводородокисляющими бактериями, является основным (Миронов, 1973, 2002; Ильинский, 1979, 2000; Morgan, 1989; Израэль, 1989; Leahy, 1990; Коронелли, 1993; Немировская, 2000; Рубцова, 2004; Куликова, 2008). Мощная, разнообразная и подвижная ферментативная система, позволяющая переключаться на потребление с одних на другие источники углерода и энергии, высокая пластичность обменных процессов, быстрая адаптация к изменяющимся условиям позволяет углеводородокисляющим бактериям активно деструктировать нефть и нефтепродукты (Ильинский, 1979; Миронов, 2002; Куликова, 2004).
Особую опасность представляет нефтяное загрязнение в замкнутых водоемах, например, таких как Каспийское море. В Северном Каспии оно возникает в результате разведки, добычи, транспортировки нефти и нефтепродуктов и речного стока, выносящего такого рода загрязнения в море.
При нефтяном загрязнении опасными являются не только нефтяные пятна в морской акватории, но и выбросы их в прибрежную зону, которые негативно влияют на прибрежные сообщества и на состав микроценоза почвы, где повышается общая численность фитопатогенных грибов (Коряжкина, 2009).
При избытке нефтезагрязняющих веществ, естественные процессы самоочищения могут не справляться с нагрузкой, что может привести к нарушению функционирования морских сообществ, вплоть до их гибели (Миронов, 2002).
В связи с этим, особую актуальность приобретают исследования состава и свойств углеводородокисляющих бактерий, создающих ассимиляционный потенциал морской воды Северного Каспия.
Цель исследования. Исследовать углеводородокисляющие бактерии и создаваемый ими ассимиляционный потенциал морской воды в северной части Каспийского моря.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить численность углеводородокисляющих бактерий в составе гетеротрофного пикопланктона в районе исследований;
2. Оценить ассимиляционный потенциал морской воды по величине микробной деградации и потенциальную окислительную способность углеводородокисляющих бактерий в составе гетеротрофного пикопланктона;
3. Выделить, изучить углеводородокисляющие бактерии морской воды и выявить активных нефтедеструкторов;
4. Определить токсичность активных нефтедеструкторов по биотестированию их суспензий и очищенной ими от нефти морской воды в микроэкосистемах;
5. Исследовать фунгицидную активность и фитотоксичность активных нефтедеструкторов;
6. Идентифицировать активный штамм-нефтедеструктор с хозяйственно-полезными свойствами.
Научная новизна работы. Впервые проведена оценка ассимиляционного потенциала морской воды по величине микробной биодеградации акватории Северного Каспия. Исследованы углеводородокисляющие бактерии в составе гетеротрофного пикопланктона, среди которых выделен и изучен штамм Serratia grimesii, обладающий высокой эмульгирующей активностью, способный к деструкции нефти, моторного масла и парафина.
Положения, выносимые на защиту:
1. Ассимиляционный потенциал морской воды, создаваемый углеводородокисляющими бактериями, в районе исследования составляет 0,047-0,092 гУВ/м3 в сутки;
2. Выделен и изучен новый штамм Serratia grimesii, способный к деструкции нефтяных углеводородов, нетоксичный по отношению к гидробионтам, обладающий фунгицидной и фитостимулирующей активностями.
Практическая значимость. Расчеты ассимиляционного потенциала по величине микробной деградации нефтяных углеводородов могут использоваться организациями, которые производят расчет баланса нефтепродуктов и оценку нефтяного загрязнения морских вод при осуществлении государственного и производственного экологического мониторинга на Северном Каспии. Предложен новый штамм Serratia grimesii, который может быть использован для активизации процессов деструкции нефти в морской среде и прибрежной зоне.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на 13-ой международной Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2009), Всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, 2009 г), международной научно-практической конференции «Perspektywiczne opracowania sa nauka i tecnhnikami – 2009» (Przemysl, 2009), на всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009), Всероссийской научно- практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования. Биологические науки» (Уфа, 2010), на международной конференции «Первые международные Беккеровские чтения» (Волгоград, 2010), 14-ой Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология – наука ХХI века» (Пущино, 2010), Международной научной конференции «Инновационные технологии в управлении, образовании, промышленности «АСТИНТЕХ- 2010» (Астрахань, 2010), Международной отраслевой научной конференции профессорско-преподавательского состава АГТУ, посвященной 80-летию основания АГТУ (Астрахань, 2010), 1-ой научно-практической конференции «Новейшие технологии освоения месторождений углеводородного сырья и обеспечение безопасности экосистем Каспийского шельфа» (Астрахань, 2010), V–ой международной конференции «Биология: от молекулы до биосферы» (Харьков, 2010), Международной конференции с элементами научной школы «Экокультура и фитобиотехнологии улучшения качества жизни на Каспии» (Астрахань, 2010), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 21 научная работа, в том числе 6 статей в рецензируемых научных журналах, входящих в Перечень ВАК.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы и приложений. Материалы диссертации изложены на 159 страницах машинописного текста, иллюстрированы 12 таблицами и 17 рисунками. Список использованной литературы включает 216 источников, из них 47 на иностранных языках.
Автор выражает огромную благодарность и признательность за неоценимую помощь в работе и поддержку научному руководителю доктору биологических наук, профессору Дзержинской И.С., доценту Куликовой И.Ю. за консультации при проведении лабораторных исследований, а также всем сотрудникам кафедры «Прикладная биология и микробиология» Астраханского Государственного Технического Университета.
Нефть как источник загрязнения акваторий
Нефть - самый распространенный источник топлива в мире и относится к наиболее опасным загрязнителям биосферы. Несовершенство технологий добычи, транспортировки, переработки и хранения нефти приводят к ее значительным потерям.
Нефть и нефтепродукты не относятся к наиболее опасным для человека токсичным загрязнениям, однако в общей массе загрязнений они составляют большую долю, а, следовательно, и большую долю в ущербе, наносимом природе (Прикладная экобиотехнология, 2010). Так настоящим экологическим бедствием являются разливы нефтяных углеводородов на поверхности морей и океанов. Такого типа загрязнения обнаруживаются повсеместно во всех районах Мирового океана. Космической съемкой зафиксировано, что уже почти 30% поверхности океана покрыто нефтяной пленкой, особенно загрязнены воды Средиземного моря, Атлантики и их берега (Артемов, 2004).
Нефтяные разливы связаны как с погрузо-разгрузочными работами, так и с авариями танкеров. На долю таких аварий приходится около 6% от всего мирового загрязнения акваторий. В 3 раза больше поступает нефти в акватории за счет промывки цистерн танкеров, в 4 раза интенсивнее загрязняют моря и океаны сбросы нефтехимических заводов, почти столько же нефти поставляют и аварии морских буровых (Давыдова, 2004; Госсен, 2006). Кроме того, регулярно и повсеместно происходят аварии и утечки на подводных нефтепроводах, но в большинстве случаев их масштабы достаточно ограничены (Резанов, 1994). Предельно допустимая концентрация (ПДК) нефтяных углеводородов в морской воде составляет 0,05 мг/л. Однако, при транспортировке нефти в Мировом океане по разным данным ежегодно разливается от 5 до 16 млн. т нефти. Например, только в Балтийском море разливы нефти достигают нескольких тысяч тонн в год. На основании статистических данных можно с большой вероятностью прогнозировать, что общие объемы разливов нефти будут возрастать (Израэль, 1989; Матишов, 1999; Патин, 2001; Сребняк, 2008).
В то же время нефтяные углеводороды являются неотъемлемым природным компонентом морской среды. Еще до широкого использования нефти человеком она постоянно присутствовала в водах Мирового океана. Ежегодно в моря поступает до 200 тыс. т углеводородов за счет естественных выходах нефти и газа на морском дне или на побережье (Израэль, 1989). Также углеводороды, близкие или идентичные нефтяным, попадают в морскую среду при разложении морских организмов после их гибели (Миронов, 2002). Углеводороды выделяют многие организмы: некоторые виды водорослей, губок, кораллов, различные виды моллюсков. Цветение и отмирание диатомовых водорослей повышает концентрацию углеводородов в воде, что может в определенной степени искажать значение истинного нефтяного загрязнения (Квасников, 1981; Миронов, 1985; Израэль, 1989; Патин, 2001; Миронов, 2002).
По данным Н.Д. Мазманиди (1974) нефть относится к токсическим веществам с комбинированным действием. Каждый из компонентов нефти может выступать как самостоятельный токсикант, с другой стороны в природных водах нефть циркулирует как групповой токсикант, до того момента пока не подвергнется деструкции и трансформации под действием биотических и абиотических факторов (Мазманиди, 1974).
При попадании в морскую среду гидрофобная нефть образует тонкую пленку на поверхности воды, которая при солнечном освещении растекается, толщина пленки уменьшается до 0,05 мм (Петров, 1978). Так, 1 т нефти может покрыть тонким слоем площадь поверхности воды в 1200 га, который частично препятствует газообмену между водой и воздухом (Прикладная экобиотехнология, 2010). Нефтяные пятна как бы закупоривают воду, задерживают доступ кислорода и этот эффект приводит к тому, что все живые организмы, находящиеся под этой пленкой, постепенно задыхаются (Квасников, 1981). Даже тончайшая мономолекулярная пленка заметно снижает интенсивность фотосинтеза одноклеточными водорослями, одной растительностью, подавляет образование кислорода в воде, угнетает развитие нейстонных сообществ, препятствует доступу воздуха личинкам рыб (Мосевич, 1951; Алексеева, 2008; Прикладная экобиотехнология, 2010). Таким образом, нефть пагубно влияет на все звенья биологической цепи. Известно, что для полной минерализации 1 л нефти расходуется кислород, содержащийся в 400 тыс. л морской воды (Zo Bell, 1964). При концентрации нефти в воде в количестве 0,10-0,01 мг/л икринки рыб погибают за несколько суток. Достаточно вылить в воду 1 л нефти, чтобы погубить более 100 млн. личинок рыб и других морских организмов (Коронелли, 1993; Миронов, 2002; Артемов, 2004; Давыдова, 2007).
Также установлено, что при попадании нефти в море разрываются пищевые цепи, в результате чего прерываются связи в экосистеме и разрушаются ее составляющие. Вследствие этого даже при восстановлении жизни на данном участке возможны очень сильные преобразования в доминантах экологических ниш, что проявляется в снижении биоразнообразия живого мира (Сребняк, 2008).
С химической точки зрения нефть и продукты ее переработки представляют собой сложную смесь нескольких тысяч углеводородов (в основном жидких и составляющих - 90% по массе) с примесью производных, содержащих серу (меркаптаны, тиофены, дисульфиды, тиофаны и др.), азот (гомологи пиридина, гидрохинолина и др.) и кислород (нафтеновые кислоты, асфальтены, смолы и др.), соотношение которых варьирует в нефти различных месторождений, разных пластов и залежей. Нефть, получаемую непосредственно из скважин, называют сырой нефтью (Прикладная экобиотехнология, 2010). Сырая нефть содержит также некоторое количество воды (до 10%), растворенных углеводородных газов (до 4 %), минеральных солей (главным образом хлоридов - до 4 г/л) и многие микроэлементы, соотношение концентраций которых (чаще всего ванадия и никеля) может служить дополнительной характеристикой происхождения и свойств нефти (Шарипов; 1995; Патин, 1997, 2001; Рябов, 2004).
Сложность химического состава нефти совпадает с представлениями об образовании нефти. Так, существует теория органического или осадочно-миграционного происхождения нефти, в основе этой теории лежат научные данные о синтезе углеводородов из биогенного органического вещества (Доценко, 2001). Этот процесс рассматривается как стадийный и сводится к образованию нефти в результате длительного теплового, бактериологического и химического воздействия на органические остатки растительных и животных организмов. Эта теория объясняет сложную химическую природу нефти (Давыдова, 2007).
По физическим характеристикам нефть представляет собой вязкую, маслянистую жидкость с характерным запахом. Цвет ее зависит от растворенных в ней смол, она бывает темно-бурого, буро-зеленоватого цвета, иногда светлая, почти бесцветная. На свету нефть слегка флуоресцирует. Под действием ультрафиолетового света нефть светится голубым или желто-бурым светом (Рябов; 2004, Давыдова, 2004, 2007).
В водной среде нефть присутствует в виде нескольких агрегатных состояний: поверхностных пленок (сликов); растворенных форм; эмульсий (типа "нефть в воде" и "вода в нефти"); взвешенных форм (плавающие на поверхности и в толще воды мазутно-нефтяные образования, сорбированные на взвесях нефтяные фракции); осажденных на дне твердых и вязких компонентов; аккумулированных в гидробионтах соединений (Леонов, 2006).
Как известно, в воде нефть не растворяется, поскольку она легче воды, то образует на водной поверхности растекающиеся (до мономолекулярного слоя) пятна, а при интенсивном перемешивании образует стойкие, медленно расслаивающиеся эмульсии (Бойко, 2007). Смешиваясь с водой, нефть образует эмульсии двух типов: прямые «нефть в воде» и обратные «вода в нефти». Прямые эмульсии, составленные каплями нефти диаметром до 0,5 мкм, менее устойчивы и особенно характерны для нефти, содержащей поверхностно-активные вещества. После удаления летучих и растворимых фракций, остаточная нефть чаще образует вязкие обратные эмульсии, которые стабилизируется высокомолекулярными соединениями типа смол и асфальтенов и содержат 50-80% воды - «шоколадный мусс». Под влиянием абиотических процессов вязкость его повышается и начинается его слипание в агрегаты - нефтяные комочки размером от 1 мм до 10 см (Нельсон-Смит, 1977; Унгер, 1995; Немировская, 2004; Давыдова, 2007).
По фракционному составу нефть разделяют на легкую, которая быстро улетучивается, среднюю и тяжелую (Солнцева, 1998). Плотность нефти зависит от месторождений и колеблется от 0,77 до 0,980 г/см (легкая 0,85, средняя 0,85- 0,90, тяжелая 0,90). Содержание в нефти легких фракций сказывается на плотности больше, чем содержание смол, так как различие в плотности между легкими и средними фракциями больше, чем между средними фракциями и смолами. Более 80 % доказанных мировых запасов нефти относится к тяжелому типу нефти, характеризующейся высокой плотностью и большим содержанием асфальтенов, металлов (ванадий, никель) и серы (Рябов, 2004; Бойко, 2007).
Изучение численности сапротрофной и углеводородокисляющей части гетеротрофного пикопланктона
Самоочищение морей и океанов - сложный процесс, при котором происходит разрушение компонентов загрязнения и включение их в общий круговорот веществ. В процессе самоочищения водоемов основную роль играют планктон, бентос, перифитон, нейстон. В самоочищении водоемов от нефтяных углеводородов особое значение имеют мельчайшие представители планктона - бактерии и микроводоросли, так называемый пикопланктон. В его составе выделяют гетеротрофную и автотрофную части. Гетеротрофная часть представлена бактериями, среди которых обнаруживаются углеводородокисляющие. Изучение влияния гетеротрофного пикопланктона на самоочищающую способность воды на исследуемом участке Северного Каспия включали гидрохимические анализы воды. В приложениях 1, 2, 3 представлены данные о концентрации нефтепродуктов в водах исследуемого участка Северного Каспия в мелководной зоне, на свале глубин и в приглубой зоне в период проведения экспедиционных работ. В результате исследования установлено, что содержание нефтепродуктов по всему исследуемому участку находится в пределах от 0,005 до 0,068 мг/л. На большей части станций не отмечено превышения ПДК (0,05 мг/л), кроме 3-х станций: ст. 5 в летний период в поверхностном слое на свале глубин,, где концентрация нефтепродуктов составляет 0,057 мг/л (1,14 ПДК), ст. 10 и ст. 12 в летний период поверхностном слое приглубой зоны, где концентрация нефтепродуктов составляет 0,052 и 0,068 мг/л (1,04 и 1,36 ПДК) соответственно.Таким образом, для исследуемого участка Северного Каспия не отмечено повышенного нефтяного загрязнения.
Микробиальный планктон, помимо выполнения роли промежуточного звена между автотрофными организмами и метазойным планктоном участвует в первичном продуцировании органического вещества и регенерации биогенов (Ильинский, 2000; Сребняк, 2008). В результате биотического круговорота веществ, включающего процессы продукции органического вещества, их трансформацию и деструкцию происходит самоочищение вод. Круговорот органических веществ, осуществляемый через трофические связи бактериального, растительного и животного населения вод, имеет основное значение для процессов самоочищения (Миронов, 2000). Поэтому определение численности сапротрофных и углеводородокисляющих микроорганизмов, участвующих в процессах трансформации органического вещества является неотъемлемой частью при изучении процесса самоочищения морской воды.
Результаты исследования количественного состава сапротрофов и углеводородокисляющих микроорганизмов представлены в таблице 1 в виде средней численности для отдельных районов, горизонтов и сезонов года.
При анализе данных, представленных в таблице 1, установлено, что в летний период количество сапротрофных микроорганизмов выше, чем в осенний и зимний периоды. Так в мелководной зоне на поверхностном горизонте численность сапротрофных микроорганизмов снижалась от 50,8±2,2 103 КОЕ/мл летом до 23,2±1,3 103 КОЕ/мл осенью и 20,3±0,8 103 КОЕ/мл зимой. Для придонного горизонта мелководной зоны также характерно снижение численности сапротрофов при снижении температуры воды. Так летом отмечено содержание сапротрофов 48,0±2,3 10 КОЕ/мл, осенью 19,8±0,9 103 КОЕ/мл, а зимой 14,7±0,4 103 КОЕ/мл. Для поверхностного горизонта свала глубин характерно изменение численности сапротрофов от 48,6±2,6 103 КОЕ/мл летом до 22,5±0,9 103 КОЕ/мл осенью и 18,5+1,3 10" КОЕ/мл зимой. Для придонного горизонта свала глубин также отмечается снижение численности сапротрофов, так для лета характерно 44,3±3,6 103 КОЕ/мл, для осени 16,7±1,0 103 КОЕ/мл, для зимы 12,7±0,7 103 КОЕ/мл. Для поверхностного горизонта приглубой зоны характерно изменение численности сапротрофов со снижением температуры воды с 44,2±1,4 103 КОЕ/мл в летний период до 19,1 ±1,2 103 КОЕ/мл осенью и 17,5±0,8 1(Г КОЕ/мл зимой, для придонного горизонта 43,4±1,8 1(Г КОЕ/мл летом, 17,3±0,4 103 осенью и 11,5±0,5 103 КОЕ/мл зимой.
В результате анализа полученных данных можно сделать вывод, что на численность сапротрофов в воде исследуемого участка Северного Каспия оказывало влияние изменение температуры и глубины исследуемой акватории, то есть снижение температуры воды (с 25,4-30,3 С летом до 9,8 17,4С осенью и зимой) вызывает снижение численности сапротрофов в 2 и более раз. Отмечено, что с ростом глубины (от мелководных станций к приглубым) а также в направлении от поверхности ко дну численность сапротрофов снижается. Так, установлено, что разница между численностью поверхностного и придонного горизонта в летний период составляет от 1,8% до 8,8%, осеннего - 9,4% до 25,8%», зимнего от 27,6% до 34,3% . Численность сапротрофов в летний период в мелководной зоне превышает таковую свала глубин и приглубой зоны на 4,3% и 13%, в осенний период на 3% и 17,6%, в зимний - 8,9%о и 13,7% соответственно.
Установлено, что углеводородокисляющие микроорганизмы присутствовали во всех исследуемых пробах воды. Для углеводородокисляющих микроорганизмов четкой зависимости численности от глубины не отмечено, понижение температуры воды до 11,4 - 17,4 С (осенний период) вызывает снижение численности углеводородокисляющих микроорганизмов на 18 - 38%), а дальнейшее понижение температуры до 9,8 13,9С (зимний период) не влияет на численность данной группы микроорганизмов. Так, в поверхностном горизонте мелководной зоны содержание углеводородокисляющих микроорганизмов снижается с 24,1±1,2 102 КОЕ/мл летом до 18,0±0,6 102 КОЕ/мл осенью и 19,7+0,9 102 КОЕ/мл зимой, в придонном — с 24,5+0,6 10z КОЕ/мл летом до 16,8+0,5 10 КОЕ/мл и 16,7+0,9 10z КОЕ/мл осенью и зимой, соответственно. Для поверхностного горизонта свала глубин численность углеводородокисляющих микроорганизмов в летний период составляет 22,7+0,4 10 КОЕ/мл, в осенний 17,5±0,9 102 КОЕ/мл и 18,2±1,7 102 КОЕ/мл в зимний. Для придонного горизонта свала глубин показатели численности следующие: 20,4±1,4 10 КОЕ/мл для летних проб, 12,5+0,1 102 КОЕ/мл осенью и 14,6+0,7 102 КОЕ/мл зимой. Для приглубой зоны в поверхностном горизонте численность клеток углеводородокисляющих микроорганизмов снижается с 21,1+1,6 10 КОЕ/мл летом, до 16,5+0,8 102 КОЕ/мл осенью и 15,5+0,5 102 КОЕ/мл зимой, в придонном горизонте летом численность клеток составила 19,0+0,8 10 КОЕ/мл, осенью - 14,2+0,3 102 КОЕ/мл, зимой - 13,5+0,7 102 КОЕ/мл. Отмечено, что разница численности между осенними и зимними показателями одной зоны практически отсутствует, что свидетельствует о присутствии в воде в осенне-зимний период времени психроактивных микроорганизмов, для которых характерен широкий оптимум развития и изменение температуры на 2 - 4С не влияет на их физиологическую активность (таблица 1).
Процентное соотношение численности между сапротрофами и углеводородокисляющими микроорганизмами представлено на рисунке 2.
Выделение углеводородокисляющих бактерий, исследование их культуральных, морфологических и физиолого-биохимических свойств
Для выделения углеводородокисляющих микроорганизмов использовали метод накопительных культур, с использованием минеральных сред Миллса (Mills, 1978), М-9 (Тумайкина, 2007; Павлова, 2008), магниево-калиево-дрожжевую среду (МКД), Чапека (Дзержинская, 2008) с добавлением нефти, дизельного топлива и керосина (1 % по объему) как единственных источников углерода и энергии. В составе каждой из данных сред присутствует отличительный компонент, так для среды Миллса - NaCl, среды М9 - Na2HP04, Чапека - (NH4)2S04, МКД - дрожжевая вода.
Среди углеводородокисляющих микроорганизмов различают мезофильные виды, способные к деструкции нефти в диапазоне температур от 20 до 35С, и психроактивные (диапазон от 0 до 35С), приспособленные к сезонным изменениям климата и имеющие селективные преимущества перед стенотермными видами, поскольку активны и в теплое, и в холодное время года (Нетрусов, 2004). В связи с этим, изучались как мезофильные, так и психроактивные углеводородокисляющие микроорганизмы.
Всего поставлено 32 накопительные культуры на минеральных средах Миллса, М9, Чапека и МКД с исследуемыми нефтепродуктами, пронумерованные от 1 до 16 для накопительных культур, культивируемых при температуре 25-28С, и от 17 до 32 для накопительных культур, культивируемых при 6-8С. В таблице 5 показана номенклатура вариантов накопительных культур мезофильных микроорганизмов и признаки их готовности.
При анализе данных таблицы 5 отмечено, что в накопительных культурах с нефтью № 1, 5 и 13 обнаружены все признаки готовности. В накопительной культуре № 9 отмечено только образование мути и изменение цвета среды.
В накопительных культурах с керосином № 2 и 6 наблюдаются появление осадка, изменение цвета среды и образование пленки. В накопительной культуре № 10 обнаружено помутнение и изменение цвета среды, а в накопительной культуре № 14 только помутнение среды. Таким образом, во всех накопительных культурах с керосином обнаружен рост углеводородокисляющих микроорганизмов.
В накопительной культуре с бензином № 15 обнаружены все признаки роста, в накопительных культурах № 7 и 11 отмечено появление осадка, помутнение и изменение цвета среды, в накопительной культуре № 3 отмечено только изменение цвета среды. Таким образом, во всех накопительных культурах с бензином отмечено развитие углеводородокисляющих микроорганизмов.
Для накопительных культур с дизельным топливом № 12 и 16 отмечено появление осадка и мути, для накопительной культуры № 8 наблюдается только появление мути, а в накопительной культуре № 4 признаки готовности не обнаружены. Таким образом, углеводородокисляющие микроорганизмы не обнаружены только в накопительной культуре с дизельным топливом на среде Миллса.
Для 14 из 16 накопительных культур психроактивных микроорганизмов характерно появление признаков роста, свидетельствующее о развитии углеводородокисляющих микроорганизмов (таблица 6).
В накопительной культуре психроактивных микроорганизмов с нефтью № 29 обнаружены все признаки готовности, в накопительных культурах №17 и 25 отмечено изменение цвета среды, а в накопительной культуре № 21 -появление мути. Таким образом, во всех накопительных культурах психроактивных микроорганизмов с нефтью обнаружен рост углеводородокисляющих микроорганизмов.
В накопительной культуре с керосином № 22 отмечено появление мути и изменение цвета среды, № 18 и 26 - только изменение среды, а № 30 -только появление мути. Таким образом, во всех накопительных культурах с керосином обнаружен рост углеводородокисляющих микроорганизмов.
В накопительных культурах с бензином № 23 и 27 отмечено появление мути и изменение цвета среды, № 19 - появление осадка и изменение цвета среды, а в накопительной культуре № 31 отмечено только появление мути. Таким образом, во всех накопительных культурах с бензином обнаружен рост углеводородокисляющих микроорганизмов.
В накопительных культурах с дизельным топливом № 28 и 32 отмечено появление мути, а в накопительных культурах № 20 и 24 признаки готовности не обнаружены. Таким образом, углеводородокисляющие микроорганизмы не обнаружены в накопительных культурах на средах Миллса и М-9 при температуре культивирования 6-9С.
В результате исследования признаков готовности накопительных культур установлено, что в 3-х накопительных культурах (№ 4, 20, 24) они отсутствуют, таким образом, не наблюдается рост углеводородокисляющих микроорганизмов. Отсутствие роста отмечено на среде Миллса при температурах 25-28 и 6-8С и среде М-9 при температуре 6С в присутствии дизельного топлива. Дизельное топливо является более сложным производным нефти с содержанием преимущественно углеводородов с длинной углеродной цепью, в отличие от более коротких углеродных цепей керосина и бензина. Кроме этого необходимо отметить, что среда Миллса содержит большое количество соли NaCl (24 г/л), содержание которой в воде Северного Каспия значительно ниже и такой избыток мог негативно сказаться на развитии микроорганизмов.
В 5-й накопительных культурах (№ 1, 5, 13, 15, 29) наблюдались все исследуемые признаки готовности. Из них 4 поставлены на минеральных средах с нефтью, что свидетельствуют о более активном развитии углеводородокисляющих микроорганизмов в средах с содержанием нефти, чем с отдельными нефтепродуктами. Из 5 накопительных культур, в которых отмечено появление всех признаков готовности, 3 поставлены на среде МКД, содержащей дрожжевую воду. Это свидетельствует о том, что в присутствие дополнительных источников углерода устойчивость микроорганизмов выше по сравнению с развитием на минеральных средах.
Таким образом, в 29 накопительных культурах были отмечены признаки роста углеводородокисляющих микроорганизмов.
Из 29 накопительных культур, в которых отмечен рост микроорганизмов, производился глубинный высев разведений на плотные среды того же состава с внесением тех же нефтепродуктов. Посевы инкубировали при температурах развития накопительных культур (6-8С и 25-28С). На чашках были выявлены колонии и изучены их культуральные свойства. Всего было выявлено 84 изолята. Нумерация изолятов, данные о том, из каких накопительных культур они выделены и их культурально-морфологические свойства представлены в приложении 4. Учитывались только бактериальные штаммы. Колонии были различной формы, цвета, размеров, консистенции, структуры, отличались профилем и краем. Выявленные изоляты рассевали на поверхность тех же самых сред с нефтепродуктами методом истощающего штриха. В результате было получено 84 изолированных колоний и изучены их морфологические свойства. Установлено, что среди них присутствуют Г+ кокковые и палочковидные спорообразующие и неспоровые бактерии, а также Г палочки. Таким образом, всего выделено 67 изолятов мезофильных и 17 изолятов психроактивных бактерий.
Для дальнейшего скрининга углеводородокисляющих форм использовали периодические пересевы изолятов на ранее употребляемые среды с теми же углеводородами. При периодических пересевах отбирали изоляты образующие изолированные колонии на всех исследуемых средах. В результате при пересевах отобрано 43 мезофильных и 5 психроактивных изолята, способных образовывать колонии на минеральных средах с исследуемыми углеводородами в качестве единственного источника углерода и энергии.
Таким образом, для дальнейших исследований отобрано 43 мезофильных и 5 психроактивных изолятов.
Для определения способности штаммов окислять жидкие не летучие углеводороды выделенные изоляты рассевали на минеральную среду радиальными штрихами от лунки с исследуемым нефтепродуктам к периферии чашки. Наличие или отсутствие роста по штриху по сравнению с контролем (рост на среде без углеводорода) свидетельствует о способности или неспособности к окислению нефтепродуктов.
Идентификация активного нефтедеструктора, обладающего хозяйственно-полезными свойствами
В результате проведенного скрининга установлено, что среди исследуемых бактерий только штамм Serratia sp. 16 обладает всеми литическими свойствами, высокой эмульгирующей активностью к бензину, керосину и дизельному топливу, имеет гидрофобную клеточную стенку, обладает наиболее высокой деструктирующей активностью по отношению к нефти, моторному маслу и парафину, а также не токсичен по отношению ко всем исследуемым тест-объектам. По этому данный штамм был отобран для дальнейшего изучения его филогенетического положения.
При проведении секвенирования вариабельных участков 16S rDNA штамма Serratia sp. 16 получена нуклеотидная последовательность для исследуемого штамма. В результате первичного скрининга данной последовательности по базе данных GenBank и RDP-II установлено, что исследуемый штамм принадлежит к следующим систематическим группам Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae; Serratia, причем гомология с некоторыми видами рода Serratia составляет 99% (Приложение 10).
Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий, доступными из базы данных GenBank.
По данным анализа было построено филогенетическое дерево с гомологичными штаммами (рисунок 17).
Критерием отнесения микроорганизма к тому или иному виду считается гомология не менее 97%. По этому критерию исследуемый штамм можно отнести к нескольким видам рода Serratia.
Анализ филогенетического родства, построенный с использованием типовых штаммов близкородственных бактерий показал, что наиболее близким к исследуемому штамму является вид Serratia grimesii. Уровень сходства последовательностей 16S рРНК штамма Serratia sp. 16 с видом Serratia grimesii составил 99% (Приложение 10).
Род Serratia представлен вездесущими в природе палочковидными перитрихиальными аспорогенными грамотрицательными бактериями. Данный род включает десять видов бактерий. Представители рода Serratia выделяются из воды, почвы, животных (включая человека) и поверхности растений (Grimont, 1992). Штаммы данного рода синтезируют фунгицидные компоненты, стимулируют создание азотфиксирующих симбиотических взаимоотношений и выступают в качестве патогенов насекомых (Grimont, 1992; Kalbe, 1996; Zhang, 1996, 1997). Вид Serratia grimesii был впервые описан в 1982 г. H.A.D. Grimont (Grimont, 1982). Согласно определителю Бержди представители рода Serratia прямые палочки, грамотрицательные, перетрихи, факультативные анаэробы.
При изучении культурально-морфологических особенностей штамма № 16 установлено, что это облигатно аэробные грамотрицательные неспорообразующие боченковидные палочки. Клетки - прямые или слегка изогнутые 0,5-0,8 х 0,9-2,0 мкм, подвижны (перитрихи), клетки располагаются одиночно или парами, имеют при этом V-образное расположение. При росте на ПА и на минеральных средах с нефтепродуктами (М9, МКД, Миллса) штамм образует колонии круглой формы с правильным краем, выпуклым профилем, блестящие, непрозрачные, слизистые, светло-бежевого цвета.
Известно из литературных источников, что данный вид обладает фунгицидной активностью по отношению к грибам рода Fusarium (Marilyn, 2008). Также отмечено, что данный вид бактерий способен к синтезу термолизиноподобной металлопротеиназы - гримелизина (Божокина, 2008). В литературе много указаний на способность штаммов рода Serratia к деструкции нефти и нефтепродуктов. Так, активными деструкторами нефтяных углеводородов являются представители видов Serratia marcescens, Serratia odorifera, Serratia plymuthica (Пат. № 2157838). Анализ литературных источников показал отсутствие информации о наличии у вида Serratia grimesii способности к деструкции нефти и нефтепродуктов.
Таким образом, нами впервые доказана способность выделенного штамма Serratia grimesii к эмульгации и деструкции нефти и нефтепродуктов, определены гидрофобные свойства клеточной стенки данного микроорганизма и установлено отсутствие острой токсичности как самого штамма, так и очищенной на его основе морской воды от нефти для гидробионтов. Также доказаны Фунгицидные и фитостимулирующие свойства данного штамма.
Таким образом, новый штамм Serratia grimesii может быть использован для активизации процессов деструкции нефти в морской среде и прибрежной зоне.
