Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Проблема оценки генетического риска и стратегия исследований генотоксичности отдельных компонентов и комплексных систем 11
1.2. Бактериальные тест-системы и их применение для изучения суммарного мутагенного загрязнения воды 14
1.3. Основные виды сточных вод, поступающих в водоемы 24
1.4. Переработка и обеззараживание жидких отходов 30
1.4.1. Хлорирование воды 35
1.4.2. Озонирование воды 36
1.4.3. Обеззараживание воды бактерицидными лучами 36
1.5. Классификация осадков сточных вод 38
1.6. Генотоксическая оценка осадков сточных вод 43
1.7. Пути и проблемы утилизации осадков сточных вод 47
Глава 2. Материалы и методы 50
2.1. Образцы проб и способы их приготовления 50
2.2. Аналитические методы 55
2.2.1. Химический анализ состава исследуемых образцов 55
2.2.2. Определение свободного гистидина в образцах 56
2.3. Санитарно-бактериологический анализ проб 58
2.3.1. Определение коли-титра исследуемых проб 58
2.3.2.Определение перфрингенс-титра 59
2.4. Токсикологический анализ образцов 60
2.4.1. Методика определения токсичности с использованием тестерных организмов гидробионтов 60
2.4.2. Определение токсичности исследуемых образцов на микроорганизмах 60
2.5. Выявление ДНК-повреждающего эффекта сточных вод и осадков сточных вод 61
2.6. Оценка мутагенности образцов в тесте Эймса 62
2.7. Статистическая обработка результатов 64
Глава 3. Результаты и обсуждение 65
3.1. Содержание органических и неорганических веществ в образцах 65
3.2. Показатели загрязненности осадков сточных вод согласно коли- и перфрингенс-титру 73
3.3. Токсикологические эффекты исследуемых образцов 73
3.4. Генотоксическое действие сточных вод и их осадков 76
3.4.1. ДНК-повреждающая активность образцов 76
3.4.2. Прямое и непрямое мутагенное действие образцов 77
3.5. Содержание свободного гистидина в образцах сточных вод и их осадков 84
Заключение 86
Выводы 95
Литература 97
- Бактериальные тест-системы и их применение для изучения суммарного мутагенного загрязнения воды
- Классификация осадков сточных вод
- Определение свободного гистидина в образцах
- Оценка мутагенности образцов в тесте Эймса
Бактериальные тест-системы и их применение для изучения суммарного мутагенного загрязнения воды
Для оценки мутагенности предложено около двухсот различных систем, многие из которых хорошо разработаны и довольно широко применяются. Однако не существует универсальной тест-системы, которая могла бы выявить
все основные типы генетических повреждений. Понятие мутагенности, таким образом, не абсолютно, а является тест-специфичным признаком. Это ведет к необходимости использования в работе по выявлению и оценке мутагенности исследуемых агентов целого набора методов. При этом современный подход оценки мутагенной активности основывается на использовании модельных тест-систем, где в качестве тест-объектов служат самые различные виды организмов: от бактериофагов и вирусов до млекопитающих и клеток человека in vivo и in vitro [Дубинин, 1986]. В последние годы много сделано для разработки методов скрининга и исследования мутагенного потенциала химических соединений и суммарной мутагенной активности природной среды. Предпочтительными критериями тестов стали: 1) достаточная степень разработанности, значительный масштаб применения; 2) быстрота выполнения; 3) низкая стоимость; 4) возможность внедрения метода в практику работ лабораторий негенетического профиля (токсикологического, гигиенического и т.д.) [Фонштейн с соавт., 1977].
Широкое признание исследователей получили следующие методы [Абилев, Порошенко, 1986]: 1) тест Эймса на Salmonella typhimurium (с метаболической активацией и без нее) и различные его модификации; 2) оценка частоты генных мутации в культурах клеток различного происхождения; 3) учет аберраций хромосом и сестринских хроматидных обменов в клетках млекопитающих и человека in vivo и in vitro; 4) определение однонитевых и двунитевых разрывов ДНК. Микроорганизмы широко используются в качестве индикатора во многих ускоренных методах изучения мутагенной активности химических соединений [Абилев, 1986]. С точки зрения современной токсикологии представляется оптимальным применять не батарею разнообразных тестов, а какой-либо чувствительный тест на генные мутации (тест Эймса), сопровождая его пробой на кластогенный эффект у млекопитающих для выявления генотоксичности исследуемого вещества [Klaassen, 1996]. Прогностические возможноти проб на генотоксичность определяют обычно сравниванием с пробами на канцерогенность на грызунах, принимая во внимание ряд недостатков тестирования, высокий спонтанный уровень опухолеобразования у грызунов, трудности режима дозирования [Tennant et al.,1987 Prival, Dunkel,1989]. Преимущественное использование микроорганизмов в тест-системах обусловлено тем, что микроорганизмы имеют высокую скорость размножения, доступные условия выращивания, гаплоидны, просты в уничтожении и не концентрируют на себе внимание общественности, выступающей против использования животных в тестах [Фонштейн с соавт., 1985]. Микробные тест-системы являются в настоящее время наиболее быстрыми, достаточно чувствительными и воспроизводимыми. Абсолютным приоритетом по степени использования обладает тест Эймса на Salmonella typhimurium, который выявляет не только сам эффект исследуемого соединения, но и позволяет определить тип преимущественной мутации -замену пар азотистых оснований или сдвиг рамки считывания [Maron, Ames, 1983], а также обладает высокой степенью чувствительности по регистрации мутагенных и канцерогенных веществ [Ashby, Tennat, 1991; Gold et al., 1993]. Более того, было установлено, что тест Salmonella/микросомы выявляет негенотоксические канцерогены промоторного действия (гормоны, микроволокны) по достоверному усилению ответа на стандартный промутаген [Derringer et al.,1993]. Также широко используются тесты, позволяющие оценить генотоксичность различных веществ: тест по реверсии ауксотрофности по триптофану у штамма Escherichia coli WP2 к прототрофности (регистрируют обратные мутации), тест на индукцию SOS-функции клетки при повреждении ДНК у Escherichia coli [Quillardet, Hofnung, 1985, 1993; Alberts et al., 1989], тест на появление устойчивости к арабинозе у Salmonella typhimurium (прямые мутации) (Jurado et al., 1994), тест на повреждение ДНК у штаммов Bacillus subtilis, дефектных по некоторым путям репарации (геотест), тест с Saccharomyces cerevisiae, где определяется способность соединения влиять на индукцию SOS-функций клетки, репарационные и
Классификация осадков сточных вод
Осадки сточных вод образуются в результате очистки сточных вод. К осадкам относят все примеси, задерживаемые главным образом первичными и вторичными отстойниками, флотационными, фильтрационными и другими сооружениями после механической, биологической очистки. Таким образом, к основным видам осадков сточных вод относятся первичные осадки, активный ил (биопленка) и шламы [Ние, 1995; Евилевич, Евилевич, 1988; Туровский, 1982; Евилевич, 1979] (рис.2). Состав и концентрация токсичных соединений варьирует в зависимости от инфраструктуры городов, а также от технологической схемы очистки сточных вод [Латыпова и др., 1999]. Осадки классифицируют следующим образом [Евилевич, Евилевич, 1980]: Осадки грубые (отбросы), задерживаемые решетками. В состав отбросов входят крупные взвешенные и плавающие примеси преимущественно органического происхождения (бумага, тряпье, дерево, солома, кухонные отбросы). Количество отбросов, задерживаемых решетками с прозором 16-20 мм, на одного человека в год составляет в среднем 8л при влажности 80% и объемной массе 750 кг/куб.м. Осадки тяжелые, задерживаемые песколовками. В их состав в бытовых сточных водах входят песок, обломки отдельных минералов, кирпич, уголь, кости, зерна, битое стекло и т.п. Количество задерживаемых тяжелых примесей на одного человека в сутки составляет 0,02л при влажности 60% и объемной массе 1,5т/куб.м. Осадки плавающие (жировые вещества), задерживаемые жироловками или всплывающие в отстойниках. Количество этих примесей третьей группы на одного человека в сутки составляет 2л при влажности 60% и объемной массе 0,6т/куб.м. Максимальное количество жировых веществ выделяется при обработке сточных вод пищевой промышленности.
Осадки первичные (сырые), задерживаемые первичными отстойниками. В бытовых сточных водах эти осадки представляют собой студенистую, вязкую суспензию с кисловатым запахом. Органические вещества в них составляют 75-80%; они быстро загнивают, издавая неприятный запах. Количество нерастворенных взвешенных примесей, оседающих в первичном отстойнике, при двухчасовом отстаивании бытовых стоков (с учетом 60% эффективности) принимается 40г абсолютно сухой массы на одного человека в сутки. Осадки вторичные (активный ил, биопленка и шламы). Активный ил, задерживаемый отстойниками после аэротенков, представляет биоценоз микроорганизмов и простейших, обладает свойством флокуляции. Активный ил отличается высокой влажностью 99,2-99,7%. После отстойников -уплотнителей влажность уменьшается чаще всего на 98%, а при флотационном уплотнении - до 96-97%, в термогравитационных уплотнителях - до 95-96%. В других специальных уплотнителях влажность может быть снижена до 90%. Количество избыточного ила для бытовых сточных вод на одного человека в сутки определяется по формуле согласно СНиП 2-04-03-85; для производственных сточных вод - по опытным и расчетным данным, а для высоконагружаемых биофильтров считается равным 28 г. при влажности 90%. Шламы, задерживаемые отстойниками или другими сооружениями после физико-химической очистки чаще всего выделяются в результате локальной очистки или доочистки промышленных сточных вод с применением реагентной обработки, фильтрования, электролиза, адсорбции, ионного обмена, обратного осмоса, экстракции и других методов [Евилевич, Евилевич, 1988].
Осадки сброженные и осадки из аэробных стабилизаторов. Существуют различные способы сбраживания, отличающиеся глубиной и скоростью распада. В двухъярусных отстойниках процесс распада осадков происходит при щелочном брожении и за 1-7 месяцев достигает 50%. В метантенках, как и в двухъярусных отстойниках, процесс распада осуществляется в щелочной среде, но протекает более быстро благодаря подогреванию осадков, перемешиванию и соблюдению режима загрузки сырым осадком. При мезофильном сбраживании и температуре подогрева до 27-32С процесс распада длится не более 20-25 дней. При термофильном брожении и температуре подогрева осадка до 50-55С распад его протекает более глубоко и длится всего 8-10 дней. Структура сброженного осадка при этом более мелкая и однородная, цвет - почти черный или темно-серый, влажность достигает 85%. Такие осадки отличаются хорошей текучестью и легко обезвоживаются. Кроме этого возможно сбраживание осадков в аэробных стабилизаторах.
Преимущество этого способа сбраживания заключается в отсутствии запаха, меньшей взрывоопасное сооружений, более простой эксплуатацией и меньшей стоимостью строительства сооружений. Однако, аэробная стабилизация требует дополнительных энергозатрат на аэрирование осадка (для стабилизации 1куб.м. активного ила, смешанного с первичным осадком, расход воздуха составляет 230-240 куб.м). При температуре 10-20С процесс длится 8-15 дней, что приводит к минерализации органических веществ на 30-40%. Оставшиеся органические вещества практически стабильны. После аэробной стабилизации осадки уплотняются в отстойниках и за 5-15 часов достигают влажности 96-98%, при этом улучшается их водоотдача. Заключительной стадией обработки осадков сточных вод является их обезвоживание, которое осуществляют либо механическим путем (центрифуги, фильтр- и вакуум прессы), либо подсушиванием на иловых площадках [Hue, 1995]. Достаточно часто обезвоженные осадки подвергаются компостированию. Наилучшие результаты получают при использовании для компостов анаэробно сброженного осадка сточных вод. При этом осадок сточных вод смешивают с каким либо наполнителем (торф, древесные стружки, лигнин и др.) в
Определение свободного гистидина в образцах
Химические анализы образцов сточных вод и осадков сточных вод проведены на базе Министерства экологии и природных ресурсов РТ совместно с лабораторией аналитического контроля согласно перечню стандартных методик, внесенных в государственный реестр методик количественного анализа на 01.09.98 г. для сточных вод, почв и отходов [Государственный реестр методик..., 1998]. 2.2.2. Определение свободного гистидина в образцах методом ТСХ Метод определения свободного гистидина разработан нами на базе ТСХ аминокислот [Кирхнер, 1981]. Водные образцы наносили на пластинки ТСХ в количестве 10 мкг/мл. Для определения количества гистидина в почве проводили его предварительную экстракцию. Один грамм ОСВ суспендировали в 10 мл дистиллированной воды и выдерживали 12 часов при комнатной температуре, 5 мл экстракта центрифугировали 10 минут при 10000 об/мин на центрифуге MPW-310.
Надосадочную жидкость пропускали через мембранный фильтр (диаметр пор 0,2мкм). Экстрагировали диэтиловым эфиром дважды по 5 мл для обессоливания исследуемого раствора, чтобы предотвратить размывание задней границы пятен и их деформацию. Водную фазу 2 мл испаряли досуха в сушильном шкафу при 60 С. После упаривания перерастворяли исходным объемом (2мл) 10% изопропанола и использовали для нанесения проб на хроматограмму. Разделение осуществляли в системе Н-бутанол-уксусная кислота-вода (15:3:7). Образцы наносили в количестве 10 мкл/пятно. Для проявления использовали 0,2% раствор нингидрина в ацетоне. Использовали пластинки Silufol [Avalier, Чехословакия]. Известно, что доза гистидина необходимая для удвоения ревертантов в тесте Эймса равна 150 моль/чашку [Nylund, Enistoo, 1993], т.е. 232 мкг/мл. Таким образом, концентрация гистидина в почвенной вытяжке, анализируемой в тесте Эймса не должна превышать 232 мкг/мл. Минимальная обнаруживаемая этим методом концентрация гистидина составляет 7 мкг/мл (рис.5). Для анализа концентрации гистидина готовили стандартные растворы аминокислоты в концентрации 10, 50, 100, 200, 280 мкг/мл. Растворы метчиков готовили в 10% изопропаноле, испаряли досуха в сушильном шкафу при 60С и перерасворяли исходным объемом 10% изопропанола. Пластинки трижды прогоняли (длина пробега растворителя 12,5 см; 6,25см; 12,5см, соответственно) и после каждого прогона сушили 5 минут в сушильном шкафу при температуре 50 С [Козаренко с соавт., 1981].
После окончания разделения пластинку сушили, обрабатывали хроматограммы проявителем, а затем нагревали 5-10 мин. при 80С. Оценку присутствия гистидина в образцах осадков сточных вод проводили по значению Rf полученных пятен, а также - визуально по площади пятна и характеру окраски. Величина Rf определяется как отношение расстояния, пройденного растворенным веществом (то есть от линии старта до середины пятна этого вещества) к расстоянию, пройденному фронтом растворителя. Rf гистидина в использованной системе растворителей составляет 0,14. Необходимо отметить, что аминокислоты аргинин и лизин имеют близкие значения Rf (ОД и 0,17 соответственно). Однако они, в отличие от гистидина, дают более светлые пятна. Таким образом, если полученное в результате анализа пятно имеет окраску и значение Rf, совпадающее с таковыми для гистидина, по размерам попадает в диапазон концентраций метчиков гистидина 200-280 мкг/мл, то делается вывод, что образец содержит критическую концентрацию свободного гистидина, которая может быть причиной ложноположительных результатов в тесте Эймса. Непосредственно перед анализом готовили серийные разведения осадка: навеску осадка (5г) переносили в стерильную фарфоровую чашку, увлажняли стерильной водопроводной водой (45 мл) и растирали до пастообразного состояния. Образующуюся массу переносили в стерильную колбу и встряхивали ее на протяжении 3-10 минут. Затем готовили серию последовательных -9 -Л. разведении (10 " ,10 " ,10 " и т.д.), которые использовали для определения коли-и перфрингенс-титров [Захарова, Сайманова, 1982]. Разведенную исходную суспензию (10 л, 10 2, 103,10"4,10"5, что соответствует 0,1; 0,01; 0,001; 0,0001 и 0,00001 г осадка, соответственно) вносили в количестве 1 мл в пробирки с 5 мл среды Кесслера. Посевы инкубировали в термостате при 37С в течение 24 ч. При наличии в среде газообразования и/или помутнения из этих сосудов производят высев петлей на сектора среды Эндо в чашки Петри. Чашки инкубируют в термостате при 37С 24 часа. Если на среде выросли малиново-красные колонии с металлическим блеском (или без него), то из них делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При выявлении в мазках грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазу, наносят на изолированную колонию диметилпарафенилдиамин (ДМПФД). Проба положительная, если колония синеет. Если проба на оксидазу отрицательная, то проверяют ферментативные свойства выделенной культуры путем посева на среду с глюкозой. Появление в среде кислоты и газа подтверждает наличии кишечной палочки в исследуемом разведении (Черкес, 1982).
Оценка мутагенности образцов в тесте Эймса
Принцип метода заключается в том, что штаммы бактерий Salmonella typhimurium культивируют на специальной среде, на которой могут расти лишь те микроорганизмы, у которых произошла мутация от ауксотрофности по гистидину к прототрофности. Без внешних воздействий такие мутации происходят с низкой частотой. Если в среду культивирования ввести химический мутаген, то частота мутаций значительно увеличивается, что регистрируется по числу колоний микроорганизмов, выросших на селективной среде. Использовали набор мутантных штаммов Salmonella typhimurium, сконструированных Б. Эймсом (Ames et al., 1973) и предоставленных ВНИИ по БИСХ, г. Купавны: ТА 100 - his G46, rfa, uvr, рКт 101, bid ; ТА98 - his D 3052, rfa, pKm 101, uvr, bio . В силу гаплоидности Salmonella всевозникшие мутации проявляются фенотипически. Мутация в гистидиновом опероне (his") вызывает ауксотрофность по этой аминокислоте у мутантов. Мутация в гене uvr А приводит к нарушению процесса эксцизионной репарации, благодаря чему возникшее повреждение ДНК остается неисправленным и, таким образом, увеличивается чувствительность тестерного штамма к некоторым мутагенам. Делеция в гене uvr В проходит также и через ген Ыо. При r/a-мутации ("шероховатые колонии") нарушается синтез липополисахаридов, в результате чего клетка теряет патогенность, а также возрастает проницаемость её клеточной стенки и облегчается проникновение мутагенов в клетку.
Штаммы дополнительно несут плазмиду рКМ 101, несущую маркер устойчивости к ампициллину, а также ген ити С, что увеличивает вклад ошибочной репарации в процесс мутагенеза, и, следовательно, чувствительность штаммов. Штамм ТА100, регистрирует мутации типа замены пар оснований (his G46), а штамм ТА98 регистрирует мутации типа сдвига рамки считывания. (Maron, Ames, 1983). Применяли полуколичественный метод учета генных мутаций с метаболической активацией и без нее. Метод дает возможность исследовать мутагенность как исходного препарата, так и его метаболитов. Метаболические превращения соединения происходят в слое полужидкого агара, в который вместе с тест - культурой вносят микросомную фракцию, полученную из клеток печени крыс. Лиофилизированную микросомную фракцию получали из Института генетики и экологии микроорганизмов, г. Пермь. Двенадцатичасовую культуру, подращенную до плотности 3-4 х 10 кл/мл, центрифугировали 15 минут при 2000g. Образовавшийся осадок ресуспендировали в минимальной солевой среде (рН = 7,4). В пробирки с 3 мл полуобогащенного 0,6% верхнего агара, растопленного до 45С, вносили 0,1мл бактериальной суспензии, 0,1мл исследуемого экстракта и 0,5мл микросомной активирующей смеси (MAC), содержащей кофакторы (в случае варианта с метаболической активацией); либо без нее. Смесь наслаивали на нижний селективный агар. Чашки инкубировали 48 часов при 37С (Ильинская с соавт., 1995). В негативном контроле в слой верхнего агара вместе с суспензией бактерий добавляли 0,1мл растворителя. В качестве позитивного контроля использовали препараты, для которых показан мутагенный эффект в аналогичных модификациях опыта с метаболической активацией и без нее. Без метаболической активации использовали нитрозометилмочевину (100мкг/мл) -для ТА 100 и нитрозогуанидин (5мкг/мл) для ТА98.
С метаболической (ЮОмкг/мл) - для ТА100 и бенз(а)пирен (5мкг/мл) для ТА98. Учет производили по индукции обратных мутаций к гистидиновой прототрофности. Сравнивали число колоний - ревертантов на опытных и контрольных чашках. О наличии мутагенного эффекта судили по превышению чистоты возникших ревертантов в опыте по сравнению со спонтанным фоном группе из трех независимых экспериментов. Приведенные в работе значения, являются средними расчетными, среднеквадратическое отклонение не превышает 15% (а 15%). Разницу двух групп данных считали достоверной, если критерий вероятности соответствовал Р 0,05. Превышение нормативных показателей для СВ муниципальных очистных сооружений г. Казани было обнаружено для железа, алюминия, азота нитратов, меди, СПАВ, кобальта, нефтепродуктов, формальдегида, цинка, фторидов (табл.7). Сравнительная характеристика химических показателей образцов хлорированной и нехлорированной проб показала, что данные СВ имеют практически одинаковые результаты анализов (табл.8). Обнаружено некоторые превышение нормативных показателей для азота аммонийного, железа, никеля.
Превышение нормативных показателей для образца СВ с завода «Оргсинтез» было незначительным и обнаружено для алюминия, нефтепродуктов. Содержание органических веществ и отдельных химических соединений представлены для всех образцов СВ в табл. 7, 8. Результаты представлены в сравнении с показателями, допускаемыми ГОСТом. Нормы ГОСТа обозначены в таблице как ПДС (предельно допустимый сброс). Превышенное содержание определенных химических веществ в табл. 7, 8 выделено подчеркиванием. Интересно отметить, что на выходе СВ из очистных сооружений во всех пробах превышено содержание аммонийного нитратного азота. Эти показатели, в отличие от ионов железа, алюминия, меди и фторидов, не нормализуются в процессе прохождения очистных сооружений. Снижается, но не достигает нормального уровня и содержание нефтепродуктов, а также в ряде проб и общее БПК (табл.7).
