Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Биологическое значение ассоциативных взаимоотношений микроорганизмов (Обзор литературы) 14
1. 1. Характеристика микробных ассоциаций 14
1.2. Особенности морфологических и физиологических свойств Blastocystis hominis 22
1.3. Эколого-эпидемиологическая характеристика инвазии B.hominis 36
Глава 2. Материалы и методы исследований 44
2. 1. Характеристика культур, используемых в работе 44
2. 2. Среды культивирования 47
2. 3. Лабораторные животные 47
2. 4. Методика изучения микробиоценоза кишечника 48
2. 5. Методы выявления B.hominis 48
2. 6. Исследование нуклеотидных последовательностей генов, определяющих продукцию факторов патогенности 49
2. 7. Определение биологических свойств микроорганизмов 52
2. 8. Методика культивирования микросимбионтов в ассоциации 55
2.9. Определение вирулентности ассоциативных симбионтов 56
2. 10. Определение структурных компонентов клеточной оболочки ассоциантов-бластоцист 57
2.11. Постановка кератоконъюнктивальной пробы 58
2. 12. Методы статистического анализа 59
Глава 3. Характеристика биологических свойств микросимбионтов в протозойно-бактериальных ассоциациях толстой кишки человека 61
3.1. Изучение взаимосвязи между особенностями строения клеточной поверхности и вирулентностью штаммов В. hominis 61
3.2. Оценка характера изменений микробиоценоза кишечника при бластоцистной инвазии 70
3.3. Характеристика показателя вирулентности Е.соїі в рамках ассоциативного симбиоза с бластоцистами в условиях кишечного биотопа 76
Глава 4. Анализ динамики численности ассоциативных микросимбионтов В.hominis и Е.соїі в процессе взаимоадаптации при совместном культивировании 79
4. 1. Изменение численности эшерихий и высоковирулентных штаммов бластоцист 19
4. 2. Изменение численности эшерихий и умеренновирулентных штаммов бластоцист 93
4. 3. Изменение численности эшерихий и авирулентных штаммов бластоцист 106
4.4. Результаты изучения взаимодействия бактерий Е.соїі с цистами B.hominis 113 Ї
Глава 5. Изучение встречаемости нуклеотидных последовательностей генов патогенности, обеспечивающих поддержание численности популяции Е.соїі в ассоциации с B.hominis in vitro 116
5.1. Определение нуклеотидных последовательностей генов контролирующих синтез фимбрий S, Р и 1 типа 117
5.2. Обнаружение нуклеотидных последовательностей еаеА гена в различных фенотипических группах Е.соїі до и после сокультивирования с бластоцистами 124
5.3. Изучение генетических детерминант токсинообразования в различных фенотипических группах is. coli до и после сокультивирования с бластоцистами 126
5. 4. Сравнительный анализ частоты встречаемости нуклеотидных последовательностей генов патогенности E.coli при ассоциативных симбиотических взаимоотношениях с B.hominis до и после сокультивирования 137
Глава 6. Исследование факторов патогенности Escherichia coli и Blastocystis hominis в алгоритме ассоциативного симбиотического взаимодействия до и после сокультивирования 153
6.1. Анализ биологических свойств E.coli и высоковирулентных бластоцист до и после совместного культивирования 153
6.2. Анализ биологических свойств E.coli и умеренновирулентных бластоцист до и после совместного 169 культивирования
6.3. Анализ биологических свойств E.coli и авирулентных бластоцист до и после совместного культивирования 183
Глава 7. Оценка патогенности микросимбионтов E.coli, полученных после совместного культивирования с ассоциантами B.hominis in vivo 189
7.1. Сравнительный анализ уровня экспрессии факторов патогенности и количества генов патогенности в геноме Е. coli 194
Заключение 199
Выводы 223
Список литературы
- Особенности морфологических и физиологических свойств Blastocystis hominis
- Исследование нуклеотидных последовательностей генов, определяющих продукцию факторов патогенности
- Оценка характера изменений микробиоценоза кишечника при бластоцистной инвазии
- Изучение генетических детерминант токсинообразования в различных фенотипических группах is. coli до и после сокультивирования с бластоцистами
Введение к работе
Актуальность проблемы. Микробное сообщество является первичным звеном любых биоценозов и экосистем (Звягинцев, Добровольская, Лысак, 1993). Подавляющее большинство микробных биоценозов представляют собой сложившиеся симбиотические ассоциации, в которых между микроорганизмами складываются сложные и неоднозначные связи (Нетрусов и др., 2004; Дяковецкая, Лапшина, Шулаева, Фёдоров, 2005).
Популяции микроорганизмов, вступая в сложные взаимоотношения – конкурентные или кооперативные, при заселении различных частей органов, тканей макроорганизма формируют специфический его «микросимбиоценоз» (Проворов, 2001; Бухарин и др., 2006).
Анализ направленности межмикробных взаимоотношений ассоциативных микросимбионтов позволяет прояснить патогенез широкого спектра заболеваний, правильно оценить происхождение тех или иных аномалий в структуре микросимбионтов, приводящих к изменению их типичных или проявлению новых биологических свойств (Бухарин, Усвяцов, Хуснутдинова, 2000, 2003, 2007; Миллер, 2000).
Изменения важных характеристик вирулентности участников микросимбиоценоза, наряду с их количественной оценкой, может существенно сказаться на течении заболеваний, осложнённых дисбиозом кишечника (Воробьев, Гинцбург, Бондаренко, 2000; Постникова и др. 2004; Багдасарян, 2007).
В последние годы появились данные о важной роли в формировании патобиоценозов кишечника, помимо бактерий и грибов, таких простейших как Еntamoeba hystolytica, Giardia lamblia и Criptosporidium (Воробьев и др., 2001; Плотников, 2002; Крылов, 2004). Менее известен протозооз, обусловленный паразитированием преимущественно в толстой кишке простейших Blastocystis hominis (Guignard et al., 2000; Taamasri et al., 2000; Abe, Wu, Yoshikawa, 2003). Возбудитель бластоцистной инвазии является микроорганизмом, к усилению агрессии которого, с одной стороны, могут приводить факторы, снижающие защитные силы макроорганизма, а с другой стороны - микроорганизмы, входящие в состав биоценоза.
Известно, что в природных биоценозах простейшие могут служить хозяевами для широкого круга патогенных и условно-патогенных бактерий (Домарадский, 1998; Литвин, 2003). Наибольший интерес среди микробов, вступающих в симбиотические связи с простейшими, привлекли микобактерии, псевдомонады, иерсинии, холерные вибрионы, сальмонеллы, эшерихии, франциселлы, кампилобактеры, листерии (Ермолаева, Романова, Тартаковский, 2005).
Работами В.И. Пушкаревой и соавт. (1989, 1990, 1996, 2003) показано, что бактерии, находясь в клетке простейших, избегают массовой гибели, а их хозяева – простейшие поддерживают их численность и вирулентность.
Проводимые исследования по характеристике ассоциативного симбиоза простейших с другими микроорганизмами ограничиваются изучением механизмов выживания и их взаимодействия вне макроорганизма, который также представляет собой среду обитания для огромного количества видов микробов (Несвижский, Воробьев, Белоносов, 1997; Шендеров, 1998, 1999; Ардатская, Дубинин, Минушкин, 2001). В связи с этим, вопрос о роли простейших в изменении численности и вирулентности представителей симбиоценозов макроорганизма остается открытым.
Раскрытие механизмов межмикробных взаимодействий, определяющих формирование и поддержание ассоциативных симбиозов организма хозяина в норме и при патологических состояниях, открывает перспективы решения фундаментальных проблем микробиологии – выявления причинно-следственных связей формирования патогенных вариантов микросимбионтов.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось теоретическое обоснование и оптимизация подхода к микробиологическому мониторингу патогенного потенциала микросимбионтов в протозойно-бактериальных ассоциациях.
Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Показать взаимосвязь между особенностями строения клеточной поверхности и вирулентностью микросимбионтов B.hominis.
-
Определить характер изменений микробиоценоза кишечника на фоне бластоцистной инвазии.
-
Дать оценку изменения вирулентности E.coli в рамках ассоциативного симбиоза с бластоцистами в условиях кишечного биотопа.
-
Провести анализ динамики численности популяций B.hominis и E.coli при совместном культивировании.
-
Исследовать взаимодействие вегетативных форм E.coli с цистами B.hominis при действии антибактериальных препаратов.
-
Выявить изменения встречаемости генетических детерминант факторов патогенности, обеспечивающих поддержание численности E.coli в ассоциации с B.hominis in vitro.
-
Дать комплексную оценку направленности изменений биологических свойств участников протозойно-бактериального симбиоценоза при взаимодействии до и после сокультивирования.
Новизна исследования. Показана взаимосвязь между структурными особенностями клеточной поверхности Blastocystis hominis и их вирулентностью. Литическое действие на клетки B.hominis различной вирулентности оказывали ферменты, обладающие протеазной, хитиназной, глюканазной, липазной и целлюлазной активностями. Отмечена закономерность изменения скорости лизиса при действии липазы на все три группы штаммов бластоцист – с усилением вирулентности замедляется скорость лизиса. Целлюлазы способны лизировать клетки только высоко- и умеренновирулентных B.hominis. Это может свидетельствовать в пользу того, что при укреплении клеточной оболочки целлюлозой усиливаются вирулентные свойства бластоцист, а клетки умеренно- и авирулентных вариантов B.hominis имеют области незащищенной мембраны вследствие частичного или полного отсутствия защитной целлюлозной оболочки.
В опытах in vivo установлена диссоциация эшерихий по показателю вирулентности. У штаммов E.coli, выделенных в консорциуме с высоковирулентными бластоцистами значения показателя вирулентности (LD50/lg) были выше, чем с умеренновирулентными и авирулентными.
Впервые исследована динамика численности популяций B.hominis и E.coli при совместном культивировании. Показано, что в результате межмикробного взаимодействия выявлено устойчивое совместное существование популяций эшерихий и бластоцист, с сохранением высокой численности микросимбионтов.
Показано взаимодействие вирулентных и авирулентных E.coli с цистами B.hominis при действии дестабилизирующих факторов, таких как антибактериальные препараты.
Впервые установлено, что в условиях микросимбиоценоза с B.hominis, происходит увеличение частоты встречаемости генетических детерминант факторов патогенности, обеспечивающих адгезию и токсинообразование среди выделенных фенотипических групп E.coli, а также селекция клонов с сочетаниями генов, не встречавшихся у штаммов, изученных до сокультивирования и в монокультурах.
Дана оценка изменения патогенного потенциала микросимбионтов в протозойно-бактериальных ассоциациях после совместной инкубации. Показано, что неферментирующие и гемолитические эшерихии в тандеме с высоко- и умеренновирулентными бластоцистами обоюдно усиливали вирулентность, напротив, кишечные палочки с нормальной ферментативной активностью угнетали активность факторов патогенности бластоцист. В сообществах E.coli с нормальной ферментативной активностью и авирулентных бластоцист отмечен индифферентный характер взаимодействия.
Практическая ценность работы. Полученные в работе данные расширяют и углубляют представления о характере межмикробных взаимодействий, определяющих формирование и поддержание микросимбиоценозов кишечника, что позволит оптимизировать диагностику, профилактику и коррекцию риска формирования патомикробиоценозов.
Разработаны и утверждены «Способ заражения экспериментальных животных бластоцистами» (патент РФ №2224465), «Способ воспроизведения язвы желудка на фоне экспериментального бластоцистоза» (патент РФ №2239236), «Способ воспроизведения ишемии толстого кишечника на фоне бластоцистной инвазии» (патент РФ №2310239). Создан метод сокультивирования микроорганизмов в условиях бактериально-протозойных ассоциаций in vitro (заявка на получение патента РФ №2008147600). Данные методики могут быть использованы в практических лабораториях и научно-исследовательских учреждениях при диагностике и прогнозировании течения широкого спектра заболеваний, ассоциированных с дисбиотическими состояниями кишечника.
Результаты изучения взаимодействия вегетативных форм E.coli с цистами B.hominis при действии стрессорных факторов, а именно антибактериальных препаратов, возможно использовать для оптимизации проведения химиотерапии патологий микробного генеза.
Внедрение в практику. По материалам диссертационной работы написаны монографии «Бластоцистная инвазия и дисбактериоз кишечника», «Экологические параметры микробиоты кишечника при протозойных инвазиях» «Простейшие Blastocystis hominis и их влияние на макроорганизм»; практические рекомендации: «Экологическая характеристика микробиоценоза кишечника», «Особенности микроэкологии кишечника больных псориазом», «Биологические свойства микробов-симбионтов в условиях протозойно-бактериальных ассоциаций макроорганизма», «Дисбиоз кишечника и методы его диагностики».
Основные положения и выводы диссертационной работы включены в лекционные курсы и практические занятия для студентов биологических и медицинских специальностей по темам: «Микробная экология», «Особенности этиопатогенеза эндогенных инфекций», «Инфекционный и постинфекционный иммунитет»; в практику клинической и бактериологической лабораторий ГУЗ Городской клинической больницы №1 г. Ульяновска при диагностике и оценке микробиоценоза кишечника, при определении чувствительности микробов к антибиотикам.
Положения, выносимые на защиту
-
Обоснован симбиотический подход к оценке динамики патогенного потенциала микросимбионтов в ассоциации E.coli–B.hominis, позволяющий выявить некоторые условия селекции вирулентных эшерихий в кишечном биотопе.
-
Молекулярно-генетический анализ при изучении ассоциативных симбиотических взаимодействий способствует выявлению основных направлений взаимоадаптации микроорганизмов в изменяющихся условиях симбиоценоза.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: Российской научно-практической конференции “Актуальные вопросы педиатрии и детской хирургии” (Ульяновск, 2000); VIII съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням "Проблема инфекции в клинической медицине" (Санкт-Петербург, 2002); Юбилейной научной конференции, посвящённой 80 – летию кафедры микробиологии Военной медицинской академии и 300 летию основания Санкт – Петербурга “Современная микробиология в клинической медицине и эпидемиологии (Санкт – Петербург, 2003); II Международной научно – практическая конференция. "Медицинская Экология" (Пенза, 2003); Международной конференции, посвященной 125-летию К.И. Скрябина и 60-летию основания Лаборатории гельминтологии АН СССР – Института паразитологии РАН «Основные достижения и перспективы развития паразитологии» (Москва, 2004); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы здоровья и среды обитания современного человека» (Ульяновск, 2005); Falk Symposium № 142 (Birmengem, 2005); Международной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 2006); I конференции молодых ученых медико-биологической секции Поволжской ассоциации государственных университетов (Ульяновск, 2007); Всероссийской конференции с международным участием «Медико-физиологические проблемы экологии человека» (Ульяновск, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 45 работ, из них 12 статей в рецензируемых научных журналах; изданы 4 практических пособия и 3 монографии; получены 3 патента на изобретение.
Объем и структура диссертации. Текст диссертации изложен на страницах машинописи, содержит введение, 5 глав, заключение, выводы, практические рекомендации, указатель литературы, включающий в себя 102 отечественных и 391 иностранных источников. Иллюстрации представлены 35 таблицами, 57 рисунками.
Основные разделы работы выполнены по плану НИР Института медицины, экологии и физической культуры Ульяновского государственного университета «Биология простейших Blastocystis hominis и их влияние на макроорганизм» (№гос. регистрации 01.200.2211659).
Особенности морфологических и физиологических свойств Blastocystis hominis
Организм человека представляет собой экологическую нишу для разнообразных микроорганизмов, заселяющих его биотопы. Микробиоценозы тела человека представляют собой сложные системы, которые отличаются не только чрезвычайной многокомпонентностыо, но и разнообразным содержанием входящих в него представителей микрофлоры (Арутюнян, Лалаян, Алексанян, 2001). Естественно, что при заселении биотопов макроорганизма между микробами складываются определенные взаимоотношения, которые отражаются на качественной и количественной характеристике того или иного микробного пейзажа (Несвижский, Воробьев, Белоносов, 1997; Шендеров, 1998, 1999).
Анализ проявлений многочисленных микробных ассоциаций позволяет прояснить патогенез ряда инфекционных заболеваний различной этиологии, правильно оценить происхождение тех или иных аномалий в структуре микроорганизмов, приводящих к изменению их типичных, или проявление совершенно новых необычных, биологических свойств (Миллер, 2000).
Большое количество работ по изучению микробных ассоциаций макроорганизма посвящено анализу взаимоотношений грибов рода Candida с другими микроорганизмами (Hoskins, 1994).
В 1979 г. Р.Н.Реброва описала влияние дрожжеподобных грибов, на течение дифтерии и формировании дифтерийного бактерионосительства. C.albicans отягощали инфекционный процесс, вызванный C.diphtheriae, увеличивая вирулентность культур возбудителя, влияя на его антибиотикорезистентность. Отягощающая роль грибов рода Candida на дифтерийную инфекцию объяснялась рядом факторов: усилением вирулентности возбудителя под влиянием грибов; микотической сенсибилизацией макроорганизма; воздействием на макроорганизм комплекса факторов, присущих отдельным возбудителям, а также вновь приобретенных и новых свойств, возникших в ассоциации; нарушением целостности слизистых оболочек грибами и создания условий для внедрения и размножения дифтерийных бактерий (Маркин, Корнишева, Горишов, 2002; Кузнецов, Орлова, Ланин, 2003).
По данным Р.Н. Ребровой (1979) дрожжеподобные грибы могут включаться в ассоциации микробов, населяющие слизистые оболочки дыхательных путей. Присутствие грибов рода Candida способствовало отягощению течения ряда заболеваний: гипертрофической формы хронического фарингита, хронической пневмонии (в ассоциации с S.haemolyticus), бронхиальной астмы, бронхита, туберкулеза легких. При внутривенном заражении кроликов патогенными стафилококками и грибами, заболевание протекало значительно тяжелее, чем моноинфекция. Бактериологические и гистологические исследования печени, почек, легких показали, что оба возбудителя ведут себя как синергисты. В условиях in vitro стафилококки угнетали рост гриба, в то время как гриб стимулировал их размножение (Бойков, Мороз, Бабаева, 2005; Carlson, 1983).
При атопическом дерматите дрожжеподобные грибы выявлялись на кожных покровах чаще, чем у здоровых лиц. Вместе, с этим на коже часто обнаруживались стафилококки, что дало авторам, основание предположить, что продукты метаболизма дрожжеподобных грибов могут представлять своеобразный катализатор для роста стафилококков (Арзуманян, Мокронова, Самуилова, Гервазиева, 1998), Другими исследователями было обнаружено, что E.faecalis и E.coli могут оказывать антагонистическое действие на дрожжеподобные грибы, угнетая мицелиальную трансформацию С. albicans при воздействии на гриб внеклеточных метаболитов этих бактерий (Черкасов, Забирова, Сгибнев, 2001; Kaczmarski, 1999).
Угнетение адгезии грибов рода Candida к акриловым зубным поверхностям наблюдалось при действии на грибковые культуры S.sanguis и P.gingivalis (Nair, 1996). Присутствие S.salivarius также подавляло адгезивную способность С.albicans in vivo и in vitro (deMiranda, 1992). Напротив, S.oralis, S.sanguinis, S.gordonii способствовали колонизации ротовой полости грибами рода Candida (Justin, Sallivan, 2000).
Изучалось также влияние грибов на течение кишечных инфекций. Микотическая сенсибилизация организма создавала фон, на котором тяжелее протекал брюшной тиф и другие кишечные инфекции (Pybiis, 1998). Кроме того, С. albicans в экспериментах in vivo снижали чувствительность бактерий-ассоциантов к антибиотикам (Бухарин и др., 2002; Bailey, 1995).
При язвенной болезни желудка бактерии Helicobacter pylori в достаточно высоком проценте выделяются в ассоциации с грибами рода Candida (чаще всего с C.krusei). Данные микроорганизмы могут сосуществовать без ущерба друг для друга, аргументами чего являются отсутствие антагонистической активности и угнетение фагоцитоза геликобактериями, благоприятствующее развитию грибов-ассоциантов (Брудастов, Валышев, Брудастов, 1994; Баженов, 1997).
Ряд работ посвящено влиянию лактобацилл на ростовые свойства грибов рода Candida. Установлено, что угнетение роста грибов происходит за счет продукции L.acidophilus пероксидазы, перекиси водорода и гипотиоцианата (JacK, 1990; Fitzsimmons, 1994; Collins, 1999). При введении опытным мышам per os L.acidophilus, L.reuteri, L.casei, L.animalis происходило снижение численности грибов в кишечнике, что существенно продлевало жизнь экспериментальным животным, зараженным С. albicans (Wagner, 1997; Makihira, Nicawa, Taraagami, 2002).
Конкурентные взаимоотношения нормальной микрофлоры и C.albicans подтверждаются более интенсивной колонизацией C.albicans желудочно-кишечного тракта безмикробных цыплят и мышей при нормальной функции тимуса у этих животных. У безмикробных крыс для воспроизведения почечных поражений требовалось в 5 раз меньше клеток возбудителя кандидоза по сравнению с нормальными животными (Вельский, Шагалова, Прадиуман Кумар Сингх, 1994; Кубась, 1997).
Имеются многочисленные данные о ключевой роли грибов рода Candida в развитии дисбиотических нарушений кишечника, связанной со способностью данных микробов изменять биологические свойства бактериальной флоры, в частности усиливая персистентный потенциал некоторых условно-патогенных микроорганизмов (Бухарин, 1999; Бухарин и др., 2002).
В современных литературных источниках немаловажное значение придается изучению ассоциаций сальмонелл с другими видами микробов.
Так, исследованиями С.С. Лебензона и соавт. (1986) установлено, что присоединение к сальмонеллезу клебсиеллёзной инфекции способствует возникновению кишечных кровотечений.
Не менее неблагоприятно сказывается на течении сальмонеллёзной инфекции присоединение респираторной вирусной инфекции (ОРВИ). Сочетание сальмонеллеза и ОРВИ усугубляло тяжесть заболевания и способствовало его затяжному течению (Кадынцева, Щукина, 1998; Казарин, Юсуф-Заде, 1998; Новокшанова, Феклисова, Титова и др., 1998).
Исследование нуклеотидных последовательностей генов, определяющих продукцию факторов патогенности
Исследования микробного пейзажа кишечника проводили в период с 2003 по 2007 года на базе бактериологической лаборатории городской клинической больницы №1 г. Ульяновска (табл. 1). В работе использовали штаммы E.coli, выделенные из фекалий 307 пациентов в возрасте от 20 до 75 лет, находившихся на лечении в условиях дневного гастроэнтерологического стационара Городской поликлиники № 5 г. Ульяновска.
Контрольную группу составили 150 практически здоровых лиц репрезентативных по полу и возрасту, из которых 134 (89,3 %) -неинфицированных данными простейшими.
Все наблюдаемые лица этой группы до начала обследования проходили клинический осмотр и анкетирование. Критерием отбора служило отсутствие хронических и острых заболеваний на момент обследования, длительность проживания в г. Ульяновск не менее 10 лет, отрицание использования антибактериальных препаратов в течение последних 3-х лет. Таблица
В качестве контрольных также использовали эталонные штаммы, содержащие гены, детерминирующие синтез факторов патогенности. Для изучения детерминант, обеспечивающих синтез фимбрий Р типа (рарС, рарН), S типа (sfaG, sfaA), 1 типа (fimA), а-гемолизина (hlyB), цитотоксического некротизирующего фактора (cnfl) использовались штаммы уропатогенных E.coli (763/К и 853/63). Контроль специфичности фрагментов, выявляющихся при тестировании штаммов с праймерами, амплифицирующими нуклеотидные последовательности гена еаеА (интимин) осуществлялся с помощью штамма энтеропатогенной E.coli (Н 10407) генов ehx (энтерогемолизин), stxl и stx2 (шигаподобные токсины) - штаммов энтерогеморрагических E.coli 0157:117 Я-10 Я-23. Отрицательным контролем служил штамм E.coli Z-62. 2. 1.3. Культуры B.hominis
Исследования по выделению и первичной идентификации бластоцист из биологического материала проводили на базе бактериологической лаборатории городской клинической больницы №1 г. Ульяновска (табл. 2).
Для получения клинических изолятов бластоцист фекалии собирали в чисто вымытые флаконы, не содержащие следов химических реактивов, дезинфицирующих веществ и антибиотиков. При доступе свободного кислорода бластоцисты погибали в течение нескольких часов, поэтому материал для посева использовали сразу после его поступления. Пробы фекалий заливали равным объемом (1:1) физиологического раствора, суспензировали и фильтровали через один слой марли. Фильтрат в объеме 0,5-1,0 мл вносили в пробирку с питательной средой, засевали одновременно 5-6 пробирок и культивирование проводили в течение трех суток, при температуре 37С (Сахарова, 1997). 2.2. Среды культивирования
Для получения культур простейших В.hominis использовали среду Suresh. Среда Suresh содержит экстракт дрожжей, 0,1 М раствор фосфатного буфера, рн 6,8. В случае необходимости длительного культивирования в среду вносили полную бактериологическую петлю культуры Proteus vulgaris, выращенную на скошенном мясопептонном агаре при температуре 37С (Suresh, Ng, 1993). Анаэробные условия достигали путем наслаивания на среду 1-2 мл стерильного масла, рН среды 7,0-7,2. Аксеничность среды - путем добавления на 1 мл среды 4 тыс.ед. ампициллина, 1 тыс. ед. стрептомицина и 500 мг амфотерицина.
Эксперименты проводили на нелинейных лабораторных мышах массой 22,7+1,5 г, морских свинках массой 254,7+11,3 г, которых содержали в условиях постоянного температурного режима (20 - 25С) и стабильной освещённости. Животные получали полноценное питание. Перед проведением экспериментов и опытные, и контрольные группы находились в карантине. В этот период наблюдали за общим состоянием животных, производили периодическое взвешивание.
Для исключения влияния суточных ритмов на результаты экспериментов все манипуляции (введение культуры, взятие крови и т.д.) проводили в одно и то же время суток, обычно в утренние часы, как у опытных, так и контрольных животных. При необходимости животных забивали внутривенным введением 5% тиопентала. 2. 4. Методика изучения микробиоценоза кишечника
При изучении микробного пейзажа кишечника согласно Приказу № 535 от 22.04.85 МЗ РСФСР «Об унификации микробиологических методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях и лечебно-профилактических учреждениях», определяли как частоту высеваемости отдельных видов, так и их количественные показатели в пересчете на 1 г фекалий (Сорокин, Федорова, 1990; Крылов, Козлович, Решетнева, 1994).
Видовую идентификацию изолированных микроорганизмов проводили на основании изучения их морфологических, тинкториальных свойств, способности к росту в аэробных и/или анаэробных условиях, характера роста на селективных средах, биохимическим и антигенным свойствам.
Для оценки микробиоценоза использовали метод количественного выделения видов и вариантов микроорганизмов, входящих в состав микробиоценоза (Куваева, 1991; Тец, 1997).
Свежие фекалий (3 г) помещали во флакон с консервирующей жидкостью в соотношении 1:3 и тщательно размешивали до получения гомогенной суспензии. Затем полученную суспензию помещали во флакон и плотно его закрывали. В качестве консервирующей жидкости использовали консервант Турдыева, который включает 0,2% водный раствор азотистокислого натрия 80 мл, концентрированного формалина - 10 мл, концентрированного раствора Люголя - 8 мл, глицерина - 2мл (Генис, 1979).
Оценка характера изменений микробиоценоза кишечника при бластоцистной инвазии
В возникновении структурных перестроек внутри микробиоценоза кишечника существенную роль играют взаимоотношения представителей естественных ассоциативных микросимбионтов между собой и с макроорганизмом (Барановский, Кондрашин, 2000; Бухарин и др. 2002). Изменение выраженности патогенности микроорганизмов-ассоциантов создает условия для формирования патобиоценозов, которые в свою очередь могут привести к развитию широкого спектра патологических состояний (Василенко, 2000; Циммерман, 2000; Наумкина и др., 2002; Постникова и др., 2004).
Исследованиями, проведенными нами ранее (2003, 2004), было показано изменение встречаемости и количества некоторых представителей микробного сообщества толстой кишки при бластоцистной инвазии. Тем не менее, остается не изученной зависимость между данными изменениями и вирулентностью паразитов. На основании выше изложенного в нашей работе проводили изучение микробных ассоциаций с характеристикой связи вирулентности бластоцист и количеством микроорганизмов при дисбиозе кишечника.
Данные, подтвержденные линейным регрессионным анализом, демонстрируют снижение высеваемости бактерий рода Bifidobacterium и Lactobacillus при увеличении вирулентности изолированных бластоцист (рис. 4) вирулентность простейших бластоцист LD50/Ig
Характеристика связи вирулентности B.hominis с уровнями высеваемости бактерий родов: 1- Bifidobacterium , 2 - Lactobacillus
При усилении вирулентности бластоцист статистически достоверно снижались количества Bifidobacterium и Lactobacillus со значений lg 9,3±0,4, 8,6±0,3 КОЕ/г до lg 6Д±0,3, 4,3±0,3 КОЕ/г соответственно (р 0,001). Коэффициенты корреляции составили г=-0,9 и г=-0,8 соответственно.
Противоположную направленность имела зависимость, демонстрирующая обсемененность кишечника микробами родов Enterococcus, Clostridium, Staphylococcus и Candida при увеличении вирулентности изолированных B.hominis (рис. 5, 6)
Характеристика связи вирулентности B.hominis с уровнями высеваемости микробов родов: 1- Staphylococcus; 2 - Candida по отношению к вирулентности простейших B.hominis При изменении вирулентности паразитов от LD5o/lg 0 до 5,3±0,2 статистически достоверно изменялась обсемененность кишечника микробами родов Enter-ococcus, Clostridium, Staphylococcus и Candida со значений lg 3,1±0,3, 6,3±0,2, 3,9±0,4 и 2,5±0,3 КОЕ/г до lg 8,1±0,3, 9,2±0,1, 6,2±0,3 и 5,7±0,2 КОЕ/г соответственно (р 0,001). Коэффициенты корреляции составили г=0,7, г=0,9, г=0,8 и г=0,8 соответственно. Полученные результаты по бактериям родов Proteus и Klebsiella имели сходную направленность, но носили менее выраженный характер (рис.7).
Характеристика связи вирулентности B.hominis с уровнями высеваемости бактерий родов: 1 - Proteus; 2 - Klebsiella
При усилении вирулентности бластоцист статистически достоверно увеличивались количества Proteus и Klebsiella со значений lg 3,1±0,3, 2,8±0,4 КОЕ/г до lg 5,1±0,1, 5,2±0,2 КОЕ/г соответственно (р 0,05). Коэффициенты корреляции составили г=0,5 и г=0,7 соответственно. Исследования также выявили, что под влиянием простейших Blastocysts hominis с различной степенью вирулентности, происходило не только резкое уменьшение общего содержания бактерий Escherichia coli с нормальной ферментативной активностью, но и появление большого количества штаммов, обладающих гемолитической и лактозонегативной активностями (рис. 8).
Характеристика связи вирулентности В. hominis с уровнями высеваемости различных фенотипических групп кишечных палочек
Изменение численности различных фенотипических групп бактерий E.coli под влиянием бластоцист проходило в следующих направлениях. Количество лактозонегативных и гемолитических форм эшерихий увеличилось с 0 до lg 3,8±0,3, 5,4±0,1 КОЕ/г соответственно (р 0,001). Коэффициент корреляции составил г=0,8 и г=0,9 соответственно. Угол наклона линии тренда демонстрирует обратную связь численности бактерий с нормальной ферментативной активностью от вирулентности простейших, где г=-0,9. Полученные результаты свидетельствуют о наличии прямой взаимосвязи глубины качественных и количественных изменений внутри микробных ассоциаций кишечника обследованных от вирулентности клинических изолятов B.hominis.
Выявлены основные направления изменений в структуре микробиоценоза, которые сопровождаются значительным снижением представителей бифидобактерии и лактобацилл, а также увеличением содержания тех родов и видов микробов, размножение которых в нормальных условиях подавляется конкуренцией активных симбионтов. Кроме того, под воздействием умеренно- и высоковирулентных штаммов бластоцист в популяции эшерихий происходят изменения, способствующие увеличению содержания клонов с широким набором факторов патогенности.
Характеристика показателя вирулентности бактерий Е.соїі в рамках ассоциативного симбиоза с B.lwminis в условиях кишечного биотопа Потенциально патогенные энтеробактерии в настоящее время приобретают все большее биологическое и медицинское значение. В качестве одной из причин этого явления рассматривают изменение патогенности этих микроорганизмов (Бондаренко, 2001). Тем не менее, исследования гетерогенности эшерихий в протозойно-бактериальных ассоциациях по показателю вирулентности, с последующим количественным выражением, не проводилось.
Проведенные исследования показали, что все 175 гемолитических кишечных палочек, выделенных совместно с высоко- и умеренновирулентными бластоцистами, вызывали гибель мышей. Величина показателя LDso/lg варьировала от 3,1±0,5 до 3,7±0,3, что соответствует умеренновирулентным штаммам. У бактерий, изолированных из ассоциативных симбиозов с высоковирулентными бластоцистами данный показатель был самим высоким и составлял LDso/lg 3,7±0,3. Для эшерихий, выделенных в консорциуме с умеренновирулентными В.hominis LD5o/lg равнялся 3,1±0,5.
Изучение генетических детерминант токсинообразования в различных фенотипических группах is. coli до и после сокультивирования с бластоцистами
Изучение липолитической активности показало увеличение значений коэффициента до 3,4±0,7 ед в 96,9 % случаев (у штаммов, изученных до совместной инкубации - 1,21±0,7 ед, из монокультуры - 0,3±0,06 ед, р 0,001).
Способность продуцировать лецитиназу также увеличивалась у простейших после совместного культивирования с бактериями кишечной палочки. Лецитоветилазная активность проявилась у 74 культур (76,3 %), коэффициент активности составил 3,3±0,1 ед. Из 97 клинических изолятов, выделенных из микробиоценоза толстой кишки только 41 культура (42,27 %) обладала данным видом активности с количественным выражением признака равным 1,45±0,3 ед. Коэффициент лецитоветилазной активности умеренновирулентных штаммов из монокультуры - 0,5±0,04 ед, р 0,001.
Изучение протеолитической активности после проведения совместного культивирования показало, что из 97 культур 35 (36,1 %) пробрели способность гидролизовать молочный белок. У бластоцист с умеренной степенью вирулентности, изученных до взаимодействия in vitro, только 21 изолят (21,65 %) характеризовались данным видом активности. В монокультурах протеолитической активностью обладали 10 штаммов (10,3 %).
Таким образом, синергизм, проявлялся в усилении гемолитической, колициногенной, протеолитической активностей и антибиотикорезистентности со стороны бактерий и увеличении всех видов активности со стороны простейших B.hominis. Антогонизм — только в отношении сахаролитической способности бактерий.
Анализ биологических свойств лактозонегативных Е. соїг и умеренновирулентных простейших после совместного культивирования Оценка изменения патогенного потенциала 43 совместных посевов лактозонегативных бактерий и простейших показала, что синергитическое взаимодействие отмечалось в увеличении коэффициента колициногенной активности и антибиотикорезистентности. Так, значение способности продуцировать колициногены у всех бактерий-ассоциантов достигло 3,2±0,06 ед (у эшерихий, до сокультивирования - 2,05±0,13, в монокультурах -1,6±0,02 ед, р 0,001).
В результате совместной инкубации простейших и бактерий изменилась так же чувствительность последних к антибактериальным препаратам в 100 % случаев (табл. 22).
Усиление антибиотикорезистентности штаммов выделенных после совместного культивирования по отношению к культурам, изученным до взаимодействия на искусственной питательной среде, произошло в 1,3 раза.
Следует отметить, что на 3 чашках (6,7 %) с посевами умеренновирулентньгх бластоцист и лактозонегативных штаммов E.coli, у последних появлялась способность разрушать эритроциты крови человека. Коэффициент ГА составил 1,2±0,03 ед.
Изучение протеолитической активности 43 неферментирующих кишечных палочек выявило синергетическое действие бластоцист на проявление данного признака. Так, данным видом активности до совместного обладали 24 штамма (53,3 %), после - 38 культур (84,4 %). В монокультурах способность гидролизовать белок молока сохранилась у 8 (18,6 %) штаммов.
Сравнительная характеристика сахаролитической активности бактерий кишечной палочки до и после совместного культивирования с умеренновирулентными B.hominis бактерий-ассоциантов после проведения совместного культивирования расщепляли только маннит и сахарозу в течение 48 часов от момента посева. 15 штаммов из консорциума помимо маннита и сахарозы вызывали замедленный гидролиз глюкозы. В монокультурах было отмечен гидролиз лактозы, маннита, сахарозы и глюкозы через 24 часа, арабинозы - через 48.
Из 97 изолятов умеренновирулентных паразитов после совместной инкубации с лактозонегативными кишечными палочками 39 культур (40,2 %) приобрели способность разрушать эритроциты крови человека (рис. 55). Тогда как до инкубации данным свойством обладали только - 27 (27,83 %). инкубации с бактериями кишечной палочки Умеренновирулентные штаммы изолированные из монокультур Соотношение изолятов бластоцист до и после совместного культивирования с эшерихиями в отношении ГА
В монокультуре способность разрушать эритроциты крови человека сохранили только 2 штамма (2,1 %). Коэффициент гемолитической активности штаммов простейших, изученных до взаимодействия на искусственной питательной среде, составил - 1,36±0,03, культур из ассоциации после сокультивирования - 2,1±0,01 и из монокультур - 0,5±0,06 ед, р 0,001.
В исследованиях по изучению факторов патогенности простейших было отмечено увеличение ДНК-азной активности среди умеренновирулентных штаммов, выделенных из консорциума после проведения совместной инкубации. ДНК-азной активностью обладали 77 культур (79,38 %), коэффициент активности равнялся 2,17±0,4 ед, Тогда как в группе изолятов, полученных до сокультивирования, способность к разрушению ДНК выявили у 52 культур (53,61 %), коэффициент активности равнялся 1,44±0,2 ед, Из монокультур бластоцист только 9 (9,3 %) характеризовались ДНК-азной активностью, коэффициент - 0,4±0,03 ед.
Синергизм при изучении межмикробных взаимодействий умеренновирулентных простейших и неферментирующих бактерий также проявился в усилении липолитической активности. Коэффициент липазной активности после взаимодействия in vitro составил 2,25±0,3 ед (у штаммов, выделенных до взаимодействия - 1,21 ±0,7, из монокультуры - 0,3±0,06 ед, р 0,001).
Способность продуцировать лецитиназу также увеличивалась у простейших после совместного культивирования с бактериями кишечной палочки. Лецитоветилазная активность проявилась у 52 культур (53,6 %), коэффициент активности составил 2,6±0,1 ед. Из 97 клинических изолятов, изученных до сокультивирования только 41 культура (42,27 %) обладала данным видом активности с количественным выражением признака равным 1,45±0,3 ед, Коэффициент лецитоветилазной активности умеренновирулентных штаммов из монокультуры - 0,5±0,04 ед, р 0,001.
Изучение протеолитической активности простейших продемонстрировало синергетическое действие бактерий-ассоциантов на проявление данного признака. Исследования показали, что только 8 культур (8,2 %), полученных до проведения совместной инкубации, обладали способностью гидролизовать молочный белок. У бластоцист с умеренной степенью вирулентности, выделенных после взаимодействия на искусственных питательных средах, 21 изолят (21,65 %) характеризовался данным видом активности. В монокультурах протеолитическои активностью обладали 3 штамма (6,98 %).
Таким образом, синергизм отмечен в отношении гемолитической, колициногенной, протеолитическои активностей и антибиотикорезистентности со стороны бактерий и увеличении гемолитической, ДНК-азной, лецитоветилазнои, липолитическои и протеолитическои активностей со стороны простейших B.hominis. Антогонизм — только в отношении сахаролитической способности бактерий.
