Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 7
1.1.. Bacillus и Pseudomonas как доминанты ризоценозных ассоциаций 7
1.2.Ассоциативная азотфиксация 10
1.3. Инокуляция азотфиксирующими бактериями небобовых растений 12
1.4.Влияние тяжелых металлов на микроорганизмы 17
1.5.Фитотоксичность тяжелых металлов и роль микробных ассоциаций 23
Экспериментальная часть 26
2.Объекты и методы исследований 26
3.1. Влияние инокуляции семян бактериальными ризоценозами на урожайность и качество растительной продукции 37
3.1.1.Урожайность и качество зерна яровой пшеницы при инокуляции семян ризоценозными ассоциациями 37
3.1.2.Урожайность и качество корнеплодов моркови при инокуляции семян ризоценозными ассоциациями 44
3.2.Фунгистатическая активность бактериальных ассоциаций и их чувствительность к различным антибиотикам 49
З.З.Мультисубстратное тестирование бактериальных ассоциаций и их интродукция в ризосферу растений 53
3.3.1.Влияние бактериальных ассоциаций на спектр потребления субстратов естественных микробных сообществ при их интродукции в ризосферу растений 57
4.1. Влияние инокуляции семян ризоценозными ассоциациями на урожай и качество зерна яровой пшеницы на почве с повышенным содержанием Zn и Cd 62
4.1.1.Урожай и качество зерна пшеницы на почве с повышенным содержанием Zn 62
4.1.2.Урожай и качество зерна пшеницы на почве с повышенным содержанием Cd 70
4.2.0бщая численность и качественный состав ризосферного комплекса яровой пшеницы под влиянием Zn и Cd 75
4.3.Урожай и качество салата в зависимости от инокуляции семян ризоценозными ассоциациями на почве с повышенным содержанием Zn и Cd 79
4.3.1.Урожай и качество салата на почве с повышенным содержанием Zn...79
4.3.2.Урожай и качество салата на почве с повышенным содержанием Cd...88
Выводы 94
Литература 96
Приложения 120
- Bacillus и Pseudomonas как доминанты ризоценозных ассоциаций
- Инокуляция азотфиксирующими бактериями небобовых растений
- Влияние инокуляции семян бактериальными ризоценозами на урожайность и качество растительной продукции
- Влияние инокуляции семян ризоценозными ассоциациями на урожай и качество зерна яровой пшеницы на почве с повышенным содержанием Zn и Cd
Введение к работе
Проблема биологической фиксации атмосферного азота - одна из важнейших в области сельскохозяйственной биологии. Большие успехи в изучении молекулярных, биохимических и физиологических механизмов азотфиксации позволяют проводить не только традиционные исследования по симбиотической азотфиксации, но и открывают возможность обеспечения азотом небобовых культур за счет его фиксации из атмосферы. С этой целью особенно перспективно в агробиотехнологии применение не одновидовых популяций (чистых культур) микроорганизмов, а их ассоциаций или консорциумов (Рыбальский, Лях, 1990; Панкратова и др., 2004; Holguin et al, 1992; Khammas, Kaiser, 1992).
По сравнению с чистыми культурами бактериальные ассоциации характеризуются повышенной эффективностью и стабильностью действия на растения, чем и определяется перспективность их использования для интенсификации ассоциативной азотфиксации в ризосфере (Злотников и др., 1997). К тому же механизмы положительного влияния азотфиксирующих бактерий на растения разнообразны в зависимости от конкретной агроэкологической обстановки (Кожемяков, Тихонович, 1998). Наиболее важное значение из них имеют: фиксация атмосферного азота, стимуляция роста и развития и улучшение питания растений, повышение устойчивости их к различным стрессовым условиям, подавление фитопатогенов и микробостатический эффект (Умаров, 1986; Бойко, 1989; Смирнов, Киприанова, 1990; Тимофеева и др., 1999; Шабаев, 2004; Zaady, Окоп, 1994). Ризобактерии (PGPR - «plant growth-promoting rhizobacteria»), по последним данным (Шапошников, 2003; Кравченко и др., 2003) обладают антигрибной активностью и способностью приживаться в ризосфере овощных культур, снижая
уровень развития фитопатогенов.
Не менее важен и актуальный вопрос о применении азотфиксирующих бактерий для снижения фитотоксичности тяжелых металлов на растения в связи с техногенным поступлением химических элементов в окружающую среду. Однако имеющихся экспериментальных данных недостаточно и вопрос о применении микроорганизмов в снижении токсигенного по отношению к растениям эффекта тяжелых металлов пока остается открытым. В связи с этим необходимо выявить наиболее эффективные микроорганизмы, возможно ризосферные ассоциации, для сельскохозяйственных культур, обеспечивающие биоконтроль в условиях повышенного загрязнения тяжелыми металлами и максимально повысить микробный потенциал почвы и ризосферы.
С таких позиций использование мультиинокулюмов, к которым относятся и природные ризосферные бактериальные ассоциации, актуально и может быть перспективным приемом, повышающим биоразнообразие и активность ризосферного комплекса.
Цель исследований - выяснение природы действия естественных ризоценозных ассоциаций дикорастущей тропической культуры Sesbania sp. на небобовые растения (пшеница, салат, морковь).
Задачи исследований:
-определить результативность действия ассоциаций при инокуляции исследуемых культур (небобовых растений) в условиях вегетационных и микрополевых опытов;
-установить антифунгальную и антибиотическую активности тест-ассоциаций;
-оценить спектр потребления субстратов до и после интродукции ассоциаций №6 и 23 в ризосферу растений (на примере кресс-салата) и по кластерной характеристике МСТ ассоциаций сделать заключение об их приживаемости в новом местообитании;
-определить результативность действия ассоциаций при инокуляции ими семян исследуемых небобовых культур на почвах, содержащих разные дозы Zn и Cd, их детоксикационный эффект;
-выявить изменения общей численности и качественного состава ризосферного комплекса яровой пшеницы при одновременной инокуляции исследуемой культуры и внесении в почву Zn и Cd.
Работа выполнена на кафедрах микробиологии и агрономической и биологической химии РГАУ - МСХА имени К.А.Тимирязева. Автор считает своим долгом поблагодарить кандидата биологических наук, доцента кафедры микробиологии Г.В.Годову и сотрудников кафедр, где выполнялась данная работа. Огромную признательность выражаю также доктору биологических наук, профессору кафедры биологии почв МГУ им. М.В.Ломоносова П.А.Кожевину за обстоятельные консультации и содействие в проведении мультисубстратного тестирования бактериальных ассоциаций.
Bacillus и Pseudomonas как доминанты ризоценозных ассоциаций
Остановимся на характеристике бактерий pp. Bacillus и Pseudomonas, поскольку в составе исследованных нами ассоциаций они составляют наиболее значительную часть. Представители этих родов настолько широко распространены в природе, что их можно назвать вездесущими. Это обусловлено способностью данных бактерий усваивать различные соединения и развиваться в разных экологических системах (Розанова, Кузнецов, 1974; Рубан, 1986; Нетрусов, 2004; Riviere, Gatellier, 1976; Gotoetal, 1978).
Широкое распространение бацилл в природе связывают и с их способностью выживать в неблагоприятных условиях, в частности, в состоянии спор (Скворцова, 1983). Бациллы обнаружены в почвах разных типов, особенно в ризосфере растений (Чеботарь, 1995; Мальцева и др., 1995; Кравченко, 2000).
Бактерии p. Pseudomonas также встречаются в почвах разных географических зон. Они - постоянные обитатели ризосферы растений. В прикорневой зоне они нередко доминантные формы, участвуют в трансформации органических соединений, обеспечивая растения необходимыми элементами питания (Цуркан, Емнова, 1989; Кравченко, 2000; Добровольская, 2002).
Многие виды Bacillus и Pseudomonas развиваются на поверхности растений и семян, в некоторых случаях в тканях семян, причем они часто фитопатогенны (Нетрусов, 2004; Dowler, 1973). Так, P. syringae вызывают потери урожая злаков. Одним из факторов патогенности этих бактерий является токсин - сирингомицин (Анисимова и др., 1989). В то же время pp. Bacillus и Pseudomonas привлекают внимание как агенты биоконтроля и защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов (Свешникова, 2003; Шабаев, 2004; Kloepper et al, 1980).
В последние годы произошли существенные изменения в классификации этих бактерий: вместо одного p. Bacillus выделяют 10, большинство из которых представляют собой виды бацилл, переведенные в ранг рода на основании типа пептидогликана и ряда физиолого-биохимических особенностей (Лысак и др., 2003). Род Pseudomonas дополнен множеством родов, отличающихся от него фенотипически и филогенетически (Заварзин, Колотилова, 2001). Многие виды Pseudomonas выделены в отдельные роды (Лысак и др., 2003).
В процессе культивирования бациллы и псевдомонады могут накапливать в значительных количествах пигменты, антибиотики, аминокислоты, полисахариды, токсины, витамины и некоторые органические вещества, используемые в иммунологии и медицине (Стейниер и др., 1979; Скворцова, 1981, 1984; Рубан, 1986).
Бактерии p. Bacillus отличаются высоким уровнем азотфиксации. Фиксация атмосферного азота у В. polymyxa при культивировании в лабораторных условиях составляет 1,5-2,8 мг N2/r потребленного углерода (Чеботарь, 1995; Мальцева и др., 1995).
Давно известна способность псевдомонад к денитрификации, а недавно окончательно признана их способность к азотфиксации (Рубан, 1986; Haahtela et al, 1983). Показано (Prevost et al, 1998), что псевдомонады проявляют высокую азотфиксирующую активность, сопоставимую с активностью азотобактера. Азот, фиксированный в почве при их внесении, минерализуется и усваивается растениями в течение периода вегетации (Шабаев, 2004).
Бациллы и псевдомонады стимулируют рост и развитие растений (Ремпе, 1972; Нетрусов, 2004). К стимуляторам роста растений, образуемым псевдомонадами, относятся фитогормоны, а также, сидерофоры - низкомолекулярные вещества, которые облегчают транспорт железа в микробные клетки и клетки корня (Свешникова, 2003). Некоторые штаммы бактерий p. Pseudomonas защищают растения от заморозков, предотвращая кристаллообразование на надземных частях растений при резком кратковременном понижении температуры (Нетрусов, 2004).
Виды pp. Bacillus и Pseudomonas активно участвуют в процессах биоремедиации - устранения загрязняющих агентов из окружающей среды посредством биологической активности (Нетрусов, 2004), что имеет значение с экологической точки зрения.
Для деградации неприродных соединений или ксенобиотиков бактерии pp. Bacillus и Pseudomonas способны адаптировать свои ферменты к таким субстратам. В частности, псевдомонады разлагают ДДТ, фосфороорганические пестициды, ПАВ и другие синтетические полимеры (Рыбальский, Лях, 1990).
Бактерии p. Bacillus расщепляют полисахариды, белки, жиры и другие макромолекулы (Гусев, Минеева, 2003). В окислительных условиях бактерии pp. Bacillus и Pseudomonas способны даже к деструкции резины, пластиков и других полимерных соединений (Нетрусов, 2004).
Инокуляция азотфиксирующими бактериями небобовых растений
В опытах ВИУА (Завалин и др., 1997) с использованием стабильного изотопа 15N показано, что урожай яровой пшеницы формируется от 24 до 38% за счет биологического азота в благоприятный и до 15% в неблагоприятный по погодным условиям год в случае инокуляции семян препаратами диазотрофов. На долю азота удобрений в зависимости от погодных условий года приходится от 5 до 20%. В обоих случаях высока доля почвенного азота.
К настоящему времени доказано (Мишустин, Шильникова, 1968; Dart, Wani, 1982), что связывание молекулярного азота осуществляют только прокариотные бактерии, цианобактерии, актиномицеты. Бактерии представляют собой самую многочисленную группу азотфиксаторов различных систематических групп: Arthrobacter, Bacillus, Beijerinckia, Corynebacterium, Derxia, Enterobacter, Pseudomonas, Klebsiella и др.
Важным достижением в области азотфиксации явилось обнаружение повышенной азотфиксирующей активности в фитоплане (ризосфере и филлосфере) небобовых растений, позволившее выделить как самостоятельный раздел ассоциативную азотфиксацию. Установлено (Садыков, Умаров, 1980; Умаров, 1983), что около 65% бактерий ризосферы и около 50% бактерий филлосферы разных видов растений фиксируют азот. По другим данным (Dart, Wani, 1982), из 3700 культур микроорганизмов из ризосферы растений 50-80% обладали нитрогеназной активностью.
Экологической нишей, в которой происходит ассоциативное связывание атмосферного азота служит фитоплана - зона обитания микроорганизмов на поверхности подземных и надземных органов растений, где в виде продуктов экзосмоса и корневого опада имеется необходимое энергетическое обеспечение, существует обмен метаболитами, а также создаются условия, способствующие активации нитрогеназы - пониженное парциальное давление 02, дефицит легкодоступных соединений азота, повышенная влажность, температура (Печуркин и др., 1997; Шабаев, 2004).
Тесное взаимодействие растений и диазотрофных бактерий присуще всем растениям и обеспечивает им автономность в отношении азотного питания (Умаров, 2001).
Эффективность процесса ассоциативной азотфиксации значительно ниже, чем у бобово-ризобиальных систем, но ассоциативные диазотрофы могут размножаться в ризосфере пшеницы, ячменя, риса, кукурузы, проса, сорго, рапса и многолетних злаковых трав (Берестецкий, Васюк, 1983; Васюк, 1989; Jagnow, 1979) и их общий вклад в баланс азота высок. На долю ассоциативной азотфиксации приходится до 75% азота, поступающего в экосистемы за счет биологической фиксации азота (Умаров, 1983, 1986).
В почвах умеренного климата за счет ассоциативной азотфиксации связывается за сезон не менее 30-50 кг/га (Умаров, 1983,2001). Наиболее высоких значений (до 30 кг/га/месяц) в данной зоне ассоциативная азотфиксация достигает в ризосфере риса (Калининская и др., 1977). Высший уровень ассоциативной азотфиксации (200-600 кг/га/год) обнаружен М.М.Умаровым (1983) в ризосфере многих тропических растений как культурных, так и дикорастущих.
На процесс ассоциативного связывания атмосферного азота влияет также комплекс физических факторов, таких как влажность и температура почвы, освещенность растений, температура и относительная влажность воздуха, концентрация диоксида углерода в атмосфере (Умаров, 1983). Большое значение при этом имеет правильное применение минеральных азотных удобрений (Клевенская, 1981; Степанов, 1985; Кураков и др., 1989; Кожемяков, Доросинский, 1990; Волкогон, 1997; Vinogradova et al, 1997).
Влияние инокуляции семян бактериальными ризоценозами на урожайность и качество растительной продукции
Необходимость увеличения производства производства растениеводческой продукции при одновременном снижении доз азотных удобрений и улучшения экологической обстановки значительно повышает интерес к биопрепаратам ассоциативных азотфиксаторов, применяемых для инокуляции семян небобовых культур (Умаров, 1986; Васюк, 1989; Кожемяков, Доросинский, 1990; Zavalin et al, 1998). Особенно это актуально для земледелия России в настоящий период, поскольку вследствие известных экономических обстоятельств, питание азотом возделываемых растений происходит в основном за счет почвенных запасов и биологической фиксации азота атмосферы (Верниченко, 2002). Однако применение ассоциативных микроорганизмов, как положения биологического земледелия еще не узаконено и не имеет достаточного научного экономического обоснования и к тому же характеризуется непостоянством их действия в реальных полевых условиях (Шабаев, 2004).
Нами были поставлены микрополевые опыты для изучения влияния бактериальных ассоциаций на урожайность и качество яровой пшеницы, сорт «Приокская» и моркови, сорт «Нантская 4» в течение 2001-2002 гг.
Урожайность яровой пшеницы колебалась по годам исследований в зависимости от погодных условий периодов вегетации. В 2001 г. при благоприятных погодных условиях, растения накапливали большую биомассу и более высокую зерновую продуктивность, чем в 2002 г., характеризовавшимся засушливыми условиями в период вегетации.
Анализ данных (рис. 3, приложение 3) показал, что урожайность пшеницы в значительной степени определялась дозой азота и инокуляцией семян ассоциациями. При полном минеральном азотном питании изучаемый показатель был достоверно выше по сравнению с фоновым вариантом и составил 258,3-250,0 г/м2 против 190,0-178,2 г/м2 в 2001-2002 гг. соответственно. Прибавки урожая достигали 68,3-71,8 г/м . При внесении 1/3 дозы азота от полной превышение данного показателя относительно фона составило лишь 38,9 г/м в 1-й год опыта и 42,1 г/м во 2-й год.
Действие ассоциаций №6, 23 и 25 на продуктивность пшеницы изучали на фоне с минеральным азотом (1/3 от полной дозы), который можно рассматривать как «стартовую» дозу для диазотрофов в период начального размножения в ризосфере. Инокуляция семян пшеницы ассоциациями была высоко результативной, способствуя достоверному увеличению урожайности культуры относительно фона в среднем на 69,2 г/м2 в 2001 г. и на 71,7 г/м2 в 2002 г. По отношению к варианту с низкой обеспеченностью азотом превышение составило в среднем 30, г/и2 (13,2%) в 2001 г. и 29,6 г/м2 (13,4%) в 2002 г. Наиболее высокие показатели урожая стабильны в варианте с инокуляцией семян ассоциацией №23.
Масса 1000 зерен - один из показателей, существенно значимый для формирования урожая. Выявлено достоверное увеличение массы 1000 зерен относительно фона в вариантах с внесением азотного удобрения и с инокуляцией семян ассоциациями (приложение 4). Наиболее существенными различиями характеризовались варианты с ассоциациями №6 и 23, где повышение показателя относительно фона составило в среднем за два года в 1,3 и 1,4 раза соответственно.
Важной характеристикой продуктивности яровой пшеницы служит структура урожая. Азотное удобрение и инокуляция семян ассоциациями увеличили общую биомассу яровой пшеницы по сравнению с фоном, хотя и в разной степени (табл. 3). Полное минеральное азотное удобрение повысило общую биомассу растений относительно фона на 25,1% в среднем за два года. При этом на фоне низкой обеспеченности растений азотом увеличение данного показателя составило 13,9 и 15,1% в 2001-2002 гг. соответственно. Наибольшей биомассой растений характеризовались варианты с инокуляцией семян. Применение инокулянтов повышало изучаемый показатель относительно фона в среднем на 29,5% в 2001 г. и на 32,2% в 2002 г.
Влияние инокуляции семян ризоценозными ассоциациями на урожай и качество зерна яровой пшеницы на почве с повышенным содержанием Zn и Cd
Рост концентрации тяжелых металлов в окружающей среде увеличивает их содержание во всех компонентах экосистемы, способствует передвижению по трофической цепи и может серьезно влиять на здоровье человека (Ягодин, 1995; Соколов, Черников, 1999; Черных и др., 1999).
Подвижность тяжелых металлов в почве и их поступление в растения зависят от вида растений, почвенных и климатических исследований (Рэуце, Кырстя, 1986; Овчаренко, 1995; Добровольский, 1997; Лебедева и др., 1998). Доступность тяжелых металлов определяется свойствами почвы, изменяя которые можно существенно влиять на накопление тяжелых металлов в растительной продукции (Овчаренко, 1997).
В последние годы появились исследования по закреплению металлов в почве и снижению их фитотоксичности с помощью микроорганизмов, сорбирующих тяжелые металлы и уменьшающих тем самым их накопление в сельскохозяйственной продукции (Кожемяков, 2001; Юдкин, Степанок, 2001; Емцев, 2004). Однако имеющихся экспериментальных данных явно недостаточно и вопрос о применении микроорганизмов и, в частности, ассоциативных ризосферных бактерий для снижения токсигенного по отношению к растениям эффекта тяжелых металлов пока остается открытым.
Анализ урожая яровой пшеницы показал, что он в значительной степени определялся инокуляцией семян ассоциациями, дозами металла и уровнем минерального питания растений (табл. 12).
Для выявления роли ассоциаций ризоценозов на урожай зерна были введены варианты без инокуляции семян с дозой азота 1/3 от полной. В данных вариантах изучаемый показатель оказался ниже в 1,3-1,5 раза по сравнению с вариантами с инокуляцией семян. Это позволило судить о положительной роли диазотрофов в формировании урожая. При этом урожай в вариантах с инокуляцией находился на уровне и даже выше, чем в контроле (без инокуляции с полной дозой азота). Максимальной величиной характеризовался вариант с ассоциацией №23. Прибавка урожая зерна пшеницы по сравнению с контролем составила в среднем по обоим фонам 2,2 г/сосуд в 2000 г. и 2,1 г/сосуд в 2001 г.
Фитотоксичность Zn независимо от доз в вариантах с инокуляцией семян проявлялась в меньшей степени по сравнению с аналогичными вариантами контроля (фон 1, фон 2). В данных вариантах Zn снижал урожай пшеницы в среднем на 4,0% при дозе ПО мг/кг почвы и на 7,7% при повышенной дозе элемента. При полуторной дозе фосфора падение урожая зерна составило лишь 3,6-6,8% соответственно. Наиболее существенным детоксикационным эффектом характеризовался вариант с ассоциацией №23, где урожай культуры в зависимости от доз элемента ниже на 3,3-7,5% по фону 3 и на 3,2-6,3%» по фону 4.
Следует отметить, что более высокая обеспеченность растений фосфором характеризовалась и большим уровнем урожая, что, с одной стороны, можно объяснить (Кураков и др., 1989; Гузев, Левин, 2001) положительным действием минерального фосфора на активность ризосферных микроорганизмов. С другой стороны, взаимодействие в почве тяжелых металлов с фосфат-ионами очевидно привело к снижению их подвижности вследствие образования труднорастворимых соединений (Овчаренко, 1997; Черных и др., 1999), а, следовательно, и фитотоксичности.
Во 2-й год при изучении последействия Zn урожай зерна пшеницы во всех вариантах был выше, чем в 1-й год, что, по-видимому, связано со снижением фитотоксического действия металла вследствие уменьшения содержания его подвижных соединений в почве в результате поглощения их растениями. При этом рассмотренные выше закономерности сохранялись. При анализе структурных показателей урожая яровой пшеницы при разных уровнях содержания Zn в почве следует отметить четко прослеживающуюся закономерность, аналогичную изменениям урожая культуры в зависимости от инокуляции семян ассоциациями, вносимых доз Zn и уровня минерального питания растений (приложения 8, 9, 10, 11,12). Так, инокуляция семян ассоциациями №6, 23 и 25 положительно влияла на накопление биомассы. Значительный прирост биомассы растений, как в 2000 г., так и в 2001 г. наблюдался в вариантах с ассоциацией №23, что составило по отношению к контролю в среднем за два года 12,5% при оптимальной дозе фосфора и 7,8% при повышенном уровне фосфорного питания.
Внесение Zn в почву независимо от доз сопровождалось уменьшением биомассы пшеницы, а также массы структурных элементов урожая, не меняя существенно их соотношения в оба года исследований. Соотношение зерна к соломе составило в контроле 1:1,3-1:1,4, а в вариантах с инокуляцией семян сохранялось на одном уровне, а именно 1:1,3.
По всем вариантам опыта общая биомасса и масса отдельных структурных элементов урожая пшеницы была выше на фоне более высокого уровня фосфорного питания растений.
При изучении последействия Zn на структурные показатели пшеницы отмечалась аналогичная закономерность их изменения. Содержание сырого протеина в зерне зависело от инокуляции семян, доз Zn и уровня минерального питания растений, а также внешних условий (табл. 13). Наибольшим количеством протеина в оба года характеризовался вариант с ассоциацией №23.
