Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 . Биологические свойства метаболитов лактобактерий (обзор литературы) 11
1.1. Лактобактерии - облигатные представители нормальной микрофлоры организма человека 11
1.2. Антибактериальные метаболиты лактобактерии 19
1.3. Иммуномодуляторы на основе лактобактерии 26
ГЛАВА 2. Материалы и методы 39
ГЛАВА 3 . Получение препарата «микростим» из культуральной жидкости лактобактерий 59
3.1. Разработка способа получения препарата 60
3.2. Изучение физико-химических параметров препарата «Микростим» 70
3.3. Оценка стабильности препарата 74
3.4. Исследование устойчивости препарата «Микростим» в секретах желудочно-кишечного тракта 74
ГЛАВА 4 . Оценка безопасности препарата «микростим» 77
4.1. Исследование общетоксического действия препарата 77
4.2. Характеристика аллергенных свойств 83
ГЛАВА 5. Исследование бактериотропного действия препарата «микростим» 86
5.1. Изучение пробиотической активности препарата 86
5.2. Оценка антибактериального действия препарата «Микростим» 95
ГЛАВА 6 Характеристика иммуномодулирующеи активности препарата «микростим» 108
6.1 Влияние препарата на показатели первичного иммунного ответа 108
6.2 Исследование действия препарата «Микростим» на фагоцитоз in vitro и in vivo 112
6.3 Характеристика иммунотропной активности препарата при экспериментальном иммунодефиците 117
6.4 Оценка влияния препарата «Микростим» на пролиферацию Т-лимфоцитов in vitro 123
Обсуждение 127
Выводы 140
Список литературы 141
Приложения 172
- Лактобактерии - облигатные представители нормальной микрофлоры организма человека
- Разработка способа получения препарата
- Исследование общетоксического действия препарата
- Изучение пробиотической активности препарата
Введение к работе
Актуальность проблемы. Современные условия жизнедеятельности человека характеризуются постоянным влиянием неблагоприятных факторов, интенсивность воздействия которых часто превышает компенсаторные возможности экологической системы «организм хозяина — его микрофлора» [6, 25, 45, 135]. В связи с этим особую актуальность приобретают исследования в области создания препаратов, предназначенных для поддержания и восстановления симбиотических микробиоценозов [11, 136, 142, 159, 167, 185, 204, 264]. При разработке пробиотиков нового поколения в качестве перспективных рассматривают препараты на основе биологически активных метаболитов бактерий - представителей нормальной микрофлоры организма человека [17, 34, 90, 249]. Экзометаболиты индигенных бактерий стимулируют рост резидентной микрофлоры, подавляют патогенные микроорганизмы, способствуют регенерации эпителия слизистой оболочки и оказывают иммуномодулирующее действие [7, 21, 122, 224, 225]. Из пробиотиков этой группы в России до настоящего времени применялся только импортный лекарственный препарат1 «Хилак форте», содержащий продукты жизнедеятельности четырех видов микроорганизмов, в том числе лактобактерий [33, 85, 92, 104, 143].
Дисбактериозы и кишечные инфекции неизменно сопровождаются нарушением иммунного статуса [14, 59, 80, 84, 114, 135, 250]. Поэтому в комплексную терапию данных патологических состояний рекомендуют включать иммунокорригирующие препараты [6, 30, 66, 71]. Несмотря на интенсивное развитие исследований, направленных на создание новых иммуномодулирующих средств, в широкой клинической практике количество используемых иммуномодуляторов, в том числе бактериального происхождения, относительно невелико [49, 68, 79, 86, 123, 127, 145, 247].
В связи с известной биологической активностью метаболитов лактобактерий [12, 62, 201, 225, 229] и потребностью практической медицины в
препаратах, обладающих пробиотическим и иммуномодулирующим действием, является актуальной разработка нового лекарственного средства на основе продуктов жизнедеятельности лактобактерий и оценка его бактерио- и иммунотропной активности.
Цель настоящего исследования — получение и изучение иммунобиологических свойств нового препарата «Микростим».
Основные задачи исследования:
Разработать эффективный способ выделения низкомолекулярных метаболитов лактобактерий. Создать на их основе препарат «Микростим».
Изучить острую, хроническую токсичность и аллергенность препарата «Микростим».
Исследовать бактериотропное (пробиотическое и антибактериальное) действие препарата «Микростим».
Оценить иммуномодулирующее действие препарата «Микростим» в экспериментах in vivo и in vitro.
Научная новизна. Разработан и запатентован способ выделения и стабилизации метаболитов лактобактерий (патент на изобретение РФ № 2224018, приоритет от 21.11.2001). По разработанному способу впервые получен препарат «Микростим». Охарактеризованы его физико-химические свойства и проведена оценка безопасности, включающая характеристику острой, хронической токсичности и аллергенных свойств. Изучено действие препарата «Микростим» на бактерии нормофлоры и патогенные микроорганизмы. Разработан оригинальный метод оценки антибактериального действия пробиотиков, содержащих бактериальные метаболиты, на основе реакции угнетения микробиолюминесценции (патент на изобретение РФ № 2187801, приоритет от 10.07.2000). Исследовано иммуномодулирующее действие препарата «Микростим».
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные расширяют существующее представление о возможности использования метаболитов лактобактерий в качестве сырьевого источника для
получения лекарственных препаратов, обладающих пробиотической и иммуномодулирующей активностью. Показано стимулирующее влияние «Микростима» на рост, активность кислотообразования и антагонистическую активность лакто- и бифидобактерий. Выявлено антибактериальное действие «Микростима» на патогенные и условно-патогенные микроорганизмы и способность повышать их антибиотикочувствительность. Охарактеризовано влияние метаболитов лактобактерий на показатели гуморального иммунного ответа, активность фагоцитирующих клеток и пролиферативную активность лимфоцитов. Проведена оценка иммунотропной активности «Микростима» в условиях экспериментального иммунодефицита.
Практическая значимость работы заключается в том, что получен новый препарат «Микростим», расширяющий спектр лекарственных средств для нормализации микроэкологического и иммунного статуса человека. Способ его изготовления из культуральной жидкости лактобактерий штамма Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ является составной частью комплексного технологического процесса в производстве пробиотиков. На препарат «Микростим» разработана нормативная документация (экспериментально-производственный регламент, проект фармакопейной статьи предприятия, проект инструкции по применению).
Основные положения, выносимые на защиту
Новый препарат «Микростим», содержащий низкомолекулярные метаболиты лактобактерий, нетоксичен, не обладает аллергенными свойствами, стабилен при контакте с секретами желудочно-кишечного тракта и в процессе хранения.
«Микростим» обладает стимулирующим влиянием на рост и функциональную активность лакто- и бифидобактерий, антибактериальным действием по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам и повышает их чувствительность к антибиотикам.
Иммунотропная активность «Микростима» характеризуется стимуляцией гуморального иммунного ответа и фагоцитарной активности
нейтрофилов и макрофагов, способностью восстанавливать сниженные показатели иммунитета при экспериментальном иммунодефиците и влиянием на пролиферативную активность Т-лимфоцитов.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Юбилейной межвузовской научно-практической конференции ПГФА «Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования: итоги и перспективы», Пермь, 2000; Всероссийской конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Томск, 2001; Пленарном заседании Пермского филиала Всероссийского общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов, Пермь, 2001; Международной научно-практической конференции памяти Г.И. Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования», Москва, 2002; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке», Пермь, 2003; VII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», Санкт-Петербург, 2003; Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии», Уфа, 2004.
Диссертация апробирована на расширенном заседании научно-технического совета филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» и расширенном заседании научной проблемной комиссии по микробиологии, аллергологии и иммунологии Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и рекомендована к защите.
По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ. Полученные результаты исследования защищены двумя патентами на изобретения РФ.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 176 страницах, содержит 36 таблиц и 18 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, четырех глав экспериментальных
исследований, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 287 источников, из них 147 отечественных и 140 иностранных, трех приложений.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена на базе лаборатории пробиотиков в соответствии с планом НИР НИИ вакцин и сывороток филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» (номер госрегистрации 01.200.108829).
Лактобактерии - облигатные представители нормальной микрофлоры организма человека
С современных позиций микрофлору человека рассматривают как совокупность микробиоценозов, занимающих многочисленные экологические ниши на коже и слизистых всех открытых внешней среде полостей макроорганизма [6, 45, 134]. В пределах каждого микробиоценоза различают индигенную (аутохтонную, облигатную, резидентную) микрофлору, которая характерна для данного вида макроорганизма и участвует в эволюции вида, и временную (аллохтонную, транзиторную) микрофлору широко распространенную в окружающей среде [164, 219, 270]. Благодаря наличию сложной и разветвленной системы кооперации между населяющими макроорганизм популяциями, микроэкологическая система человека выступает как единое целое, согласованно работающее в интересах всей системы и организма хозяина, в котором она локализована [135, 150, 261].
Наиболее сложные по составу микробиоценозы - это микрофлора толстой кишки, рта и носоглотки. В полости рта встречается более 300 видов микробов [268], в кишечнике - более 500 [25, 153, 162]. Общая численность бактериальных клеток у взрослого человека достигает 1014, что на порядок больше числа клеток всех органов и тканей макроорганизма [11,218].
Максимальное количество бактерий присутствует в толстом кишечнике, где оно составляет 400 млрд. микробных клеток на 1 г содержимого [6, 191, 243, 266]. Биомасса микробов, заселяющих кишечник взрослого человека, достигает 3 кг [219].
Основу нормальной микрофлоры кишечника составляют облигатно-анаэробные бактерии (бифидобактерии и бактероиды), на долю которых приходится 90% всех микроорганизмов. Остальные 10% микроорганизмов аэробные и факультативно-анаэробные бактерии: лактобактерии, кишечная палочка, энтеробактерии, стрептококки и другие [153, 200, 255, 270].
Микробиоценоз желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) представляет собой сложно организованную систему, в структуре которой можно выделить две основные популяции: просветную и пристеночную [254]. Формирование просветного микробиоценоза зависит от многих экзогенных и эндогенных факторов, а его окончательный состав является результатом смешивания транзиторных и индигенных микроорганизмов. Наибольшее количество микробов составляет пристеночную микрофлору, содержащуюся в муциновом слое [21, 134].
Впервые на существенную роль нормальной микрофлоры в жизнедеятельности человека столетие назад указал в своих работах русский ученый Илья Рїльич Мечников. Он же первым предложил поддерживать оптимальный состав микрофлоры кишечника с помощью микробов и продуктов их жизнедеятельности [233].
Нормальная микрофлора кишечника выполняет и регулирует многие процессы в организме человека [12, 25, 45, 153, 219]. Одной из важнейших функций нормофлоры является обеспечение колонизационной резистентности, под которой понимают совокупность механизмов, придающих стабильность индигенной микрофлоре и предотвращающих заселение макроорганизма посторонними микробами [278]. Колонизационная резистентность обусловлена целым рядом факторов, среди которых: - эффект «экранирования» слизистой от проникновения условно патогенных микроорганизмов за счет высокой адгезивной активности индигенных бактерий [254, 270]; - выработка нормальной микрофлорой комплекса веществ, оказывающих антагонистическое действие [148, 153, 157, 162, 171]; - стимуляция местного иммунитета, активация синтеза секреторного IgA, -который препятствует адгезии условно-патогенных микроорганизмов к эпителиальным клеткам [122, 220, 237, 250]; - конкуренция с экзогенными микробами за питательные субстраты [243].
Микроорганизмы нормальной микрофлоры принимают активное участие в процессах переваривания и всасывания пищи. Они усиливают гидролиз белков, сбраживают углеводы, метаболизируют жиры и клетчатку [162, 175, 255, 272]. Нормофлора регулирует перистальтику ЖКТ через образование и катаболизм биогенных аминов (брадикинина и гистамина); продукцию простагландинов; метаболизм желчных кислот с образованием метаболитов, ускоряющих моторику [6].
Индигенные микроорганизмы способствуют всасыванию и участвуют в синтезе витаминов группы В, витамина К, фолиевой, никотиновой, аскорбиновой кислоты и ряда незаменимых аминокислот, способствуют абсорбции в кишечнике солей железа, кальция и витамина D [134, 219].
Нормофлора оказывает морфокинетическое действие [25]. Стимуляция роста эпителиальных клеток микроорганизмами, по мнению W. Roediger [254], обусловлена тем, что продукты микробного метаболизма служат дополнительным важным источником питания клеток слизистой оболочки. Кроме того, жирные кислоты, продуцируемые анаэробами, стимулируют регенерацию эпителия. Их отсутствие в просвете кишечника приводит к развитию язвенного колита и других заболеваний [7]. Микроорганизмы ЖКТ участвуют в водно-солевом обмене [107], в рециркуляции желчных кислот, обмене холестерина, стероидов и других макромолекул [239, 272].
Продуктами жизнедеятельности индигенных бактерий являются летучие жирные кислоты, гормоны и медиаторы, влияющие на функцию печени, сердечно-сосудистой системы, кроветворения, обмен веществ и т.д. [7, 134, 150, 243, 253, 258].
Симбионтная микрофлора осуществляет детоксикацию экзогенных и эндогенных субстратов и метаболитов, утилизируя непереваренные пищевые вещества и инактивируя канцерогенные соединения [168]. Ряд индигенных бактерий имеет высокую активность нитратредуктазы (пропионибактерии, пептококки, вейлонеллы, грамотрицательные энтеробактерии и другие), за счет чего они предотвращают развитие метгемоглобинемии при высоком содержании нитратов. Особенно это важно у детей раннего детского возраста, имеющих высокую долю фетального гемоглобина [219].
Хорошо известна иммуномодулирующая функция облигатных микроорганизмов кишечника [12, 30, 128, 198, 205, 224]. Опыты на гнотобионтах показали, что антигенная стимуляция представителями нормальной микрофлоры необходима для формирования лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми, и для полноценного функционирования иммунной системы всего организма [21, 122]. Становление иммунного ответа формируется в первые часы неонатального периода именно под влиянием микробного окружения [13, 114]. При отсутствии микроорганизмов происходит уменьшение глубины крипт слизистой, снижение высоты ворсин, истончение собственной пластины, уменьшение пейеровых бляшек. По сравнению с обычными животными безмикробные особи характеризуются более низким содержанием Ig всех типов, сниженной фагоцитарной активностью [252]. Размер селезенки у гнотобионтов уменьшен почти в два раза, слабо выражен лимфопоэз [129].
Разработка способа получения препарата
Проведение сравнительного анализа состава и биологической активности кулътуралъных жидкостей производственных штаммов лакто- и бифидобактерий с целью выбора штамма-продуцента Исследование фракционного состава фильтратов КЖ методом гельхроматографии на сефадексе G-75 показало, что КЖ различных производственных штаммов лакто- и бифидобактерий имеют однотипный хроматографический профиль (рис. 1). В КЖ определяются 2 фракции с пиками разной величины в области молекулярных масс (ММ) 25000 Д и 415 Д (рис. 1, А, Б).
Величина первого пика КЖ и фильтрата питательной среды, используемой для культивирования лакто- и бифидобактерий (контроль), совпадают, что позволяет предположить наличие в данных фракциях прежде всего неутилизированных компонентов питательной среды (рис. 1, В). Второй пик в обоих вариантах КЖ значительно больше, чем аналогичный пик питательной среды, что позволяет сделать вывод о том, что преимущественно именно в данной фракции содержатся метаболиты бактерий. КЖ лактобактерий штамма L. plantarum 8Р-АЗ отличается более высоким количественным содержанием продуктов жизнедеятельности по сравнению с КЖ других исследованных штаммов лакто- и бифидобактерий.
В ходе скрининговых экспериментов на модели теста кислотообразования установлено, что фильтраты КЖ различных штаммов лакто- и бифидобактерий оказывают пробиотическое действие in vitro практически в равной степени. Во всех случаях внесение 10% КЖ в среду культивирования (обезжиренное молоко) вызывало статистически значимо более высокий прирост кислотности по сравнению с контрольной пробой (внесение 10% физиологического раствора). Значительных отличий в величинах коэффициентов стимуляции кислотообразования в данной серии экспериментов не выявлено (табл. 2).
Хроматографический профиль фильтрата КЖ Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ (А), фильтрата КЖ Bifidobacterium bifidum 1 (Б) и фильтрата казеиново-дрожжевой питательной среды (В) на сефадексе G-75.
Стандарты: V0 - свободный объем колонки (голубой декстран); 1 - овальбумин (43000 Д); 2 - химотрипсиноген (25000 Д); 3 - рибонуклеаза (13700 Д); 4 - бацитрацин (1450 Д); 5 - Suc-Ala-Ala-Ala-pNa (415 Д). Таблица 2 Пробиотическое действие культуральных жидкостей различных штаммов
Учитывая полученные результаты, решено было провести сравнительное исследование влияния КЖ на клетки иммунной системы in vitro с использованием скрининговой методики, применяемой для оценки иммунобиологической активности препаратов тимуса [77].
Проведенные эксперименты показали (табл. 3), что КЖ лакто- и бифидобактерий, а также препарат сравнения «Хилак форте» обладают иммунобиологической активностью (восстановление количества Еа-РОК превышает 40%). КЖ штамма L. plantarum 8Р-АЗ отличается более высокой иммунобиологической активностью (восстановление количества Еа-РОК у данного образца составляет 71%). Даже при разведении этой КЖ в 100 раз сохраняется достаточно высокая иммунобиологическая активность.
В КЖ присутствуют компоненты питательной среды, поэтому было проведено сравнительное исследование иммунобиологической активности фильтрата казеиново-дрожжевой питательной среды. Полученный в данном тесте отрицательный результат свидетельствует о влиянии на тимоциты именно микробных метаболитов, которые содержатся в КЖ. Таблица З Иммунобиологическая активность КЖ и препаратов сравнения
Таким образом, принимая во внимание количество продуцируемых метаболитов и их биологическую активность, для получения препарата был выбран наиболее перспективный в производственном отношении вариант -культуральная жидкость лактобактерий штамма/,, plantarum 8Р-АЗ.
Исследование общетоксического действия препарата
Штамм Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ, используемый для получения препарата «Микростим», хранится в коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича и разрешен к медицинскому применению. Безвредность производственного штамма контролируется согласно ФС 42-0054-00 «Лактобактерин сухой» [120]. Препарат «Лактобактерин сухой», получаемый на основе штамма L. plantarum 8Р-АЗ, применяется в медицине уже более 30 лет, в том числе назначается новорожденным и беременным женщинам во все сроки гестации. За весь период использования препарата не отмечено каких-либо побочных эффектов, препарат не обладает мутагенным, тератогенным и эмбриотоксическим действием. В связи с этим, исследование мутагенного, эмбриотоксического и тератогенного действия препарата не проводилось.
«Микростим» не содержит никаких компонентов, кроме тех, что входят в состав препарата «Лактобактерин сухой». Напротив, в препарате «Микростим» отсутствуют бактериальные клетки и среда высушивания (сахароза, желатоза, молоко), что еще более снижает аллергизирующее действие препарата и риск индивидуальной непереносимости. Препарат «Микростим» не содержит стабилизаторов и консервантов. Исследование общетоксического действия препарата
Оценка общетоксического действия препарата «Микростим» проведена на двух видах животных по показателям острой и хронической токсичности в соответствии с требованиями Фармакологического комитета МЗ РФ [36, 98].
Оценка острой токсичности препарата «Микростим» При однократном введении препарата в максимально возможных дозах per os - 1 мл (по 0,5 мл с интервалом 15 мин), подкожно - 0,5 мл и внутрибрюшинно - 0,5 мл не выявлено статистически достоверных отличий в динамике прироста массы тела контрольных и опытных групп мышей.
За весь период наблюдения гибели животных в контрольных и опытных группах не было, поведенческие реакции не изменялись. При вскрытии мышей на 14 сутки наблюдения никаких изменений внутренних органов макроскопически не обнаружено. Исследование гистологической структуры органов и тканей подопытных животных сравнительно с контрольными не выявило изменений, вызванных воздействием препарата.
Максимально переносимая доза препарата «Микростим» не выявлена из-за отсутствия реальной возможности ввести мышам более 50 мл/кг. Эта доза препарата у мышей при внутрижелудочном введении не вызывала никаких патологических явлений и гибели животных. По этой же причине не определена LD5o Оценка острой токсичности лиофильно высушенного препарата «Микростим»
Для исследования токсического влияния максимальных доз жидкий препарат был лиофильно высушен. Полученную сухую массу растворяли в 0,9% растворе натрия хлорида и вводили подопытным мышам per os и внутрибрюшинно в восьми дозах (табл. 8).
В максимально переносимых дозах (8890 мг/кг per os и 2000 мг/кг внутрибрюшинно) «Микростим» вызывал у мышей через 10-15 мин после введения небольшую одышку и снижение двигательной активности. Эти явления проходили через 1 ч после введения препарата.
В токсических дозах (более 13330 мг/кг per os и более 3000 мг/кг внутрибрюшинно) сухой препарат вызывал значительную одышку, адинамию, потерю реакции на звук и «механический зажим». При внутрибрюшинном введении отмечена болевая реакция по типу «уксусных корчей», что объясняется низким рН (4,2) и высокой кислотностью концентрированного препарата. Гибель мышей наступала через 15-30 мин после введения препарата. В последующие дни наблюдения гибели животных не было.
Таким образом, LD50 препарата при внутрижелудочном введении составила 17470 мг/кг, а при внутрибрюшинном введении - 3930 мг/кг. Проведенные исследования позволяют заключить, что по классификации К.К. Сидорова [ПО] препарат относится к VI классу токсичности (относительно безвредный).
Изучение хронической токсичности препарата «Микростим» Длительность эксперимента по оценке хронической токсичности определена в 3 месяца на основании рекомендованного курса лечения в течение 3-х недель. Расчет доз препарата проведен исходя из средней терапевтической суточной дозы для взрослого человека массой 70 кг - 10 мл, т.е. 0,14 мл/кг. Крысам обоего пола вводили дозу в 10 раз превышающую терапевтическую -1,4 мл/кг. В течение всего периода наблюдения у подопытных животных не отмечалось признаков интоксикации и существенных изменений в поведении. Гибели животных не было. Динамика прироста массы тела подопытных крыс достоверно не отличалась от контрольных. При оценке в тесте «открытое поле» не выявлено отличий между поведенческими реакциями животных контрольной и опытной групп.
Фоновые показатели периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина, лейкограмма и СОЭ) контрольной и опытной групп крыс достоверно не отличались и соответствовали показателям нормы здоровых животных [111]. Введение препарата «Микростим» в течение первых двух недель вызвало достоверное увеличение количества сегментоядерных нейтрофилов (рис. 9), другие показатели не отличались значимо от контрольной группы
Изучение пробиотической активности препарата
Согласно литературным данным в составе экзометаболитов лактобактерий имеются стимуляторы и ингибиторы роста, вещества, влияющие на выживаемость и антагонистическую активность микробных клеток [7, 15, 18, 62, 134]. Следовательно, препарат «Микростим», содержащий комплекс продуктов жизнедеятельности лактобактерий, может оказывать самое разнообразное действие на микроорганизмы. Изучение пробиотической активности препарата
Учитывая предполагаемую сферу применения препарата «Микростим» в качестве пробиотика, прежде всего необходимо было оценить влияние его на бактерии, являющиеся представителями нормальной микрофлоры организма человека. Существенная роль в микробиоценозе отводится бифидо- и лактобактериям, поэтому именно они и были выбраны в качестве объекта исследования. В ходе экспериментов использовали культуры производственных штаммов бактерий, применяемых при получении препаратов «Лактобактерий сухой» и «Бифидумбактерин сухой» (L. plantarum 8Р-АЗ, L. fermentum 90Т-С4, В. bifidum 1). Исследовали влияние препарата «Микростим» на рост, активность кислотообразования и антагонистическую активность бактерий.
Влияние препарата «Микростим» на рост и активность кислотообразования лакто- и бифидобактерий Проведенные эксперименты показали, что «Микростим» оказывает выраженное стимулирующее действие на рост и активность кислотообразования лакто- и бифидобактерий при использовании обезжиренного молока, 0,5% раствора глюкозы, 0,5% раствора сахарозы и МПА, т.е. на относительно «бедных» питательных средах, не являющихся селективными для исследуемых микроорганизмов. При использовании селективных питательных сред (МРС для лактобактерий и среда Блаурокка для бифидобактерий) эффект стимуляции менее выражен и проявляется только на начальном этапе развития культуры. Подобное действие бактериальных метаболитов отмечают и другие авторы [20], объясняя данный факт высокой концентрацией в селективной питательной среде биологически активных веществ, стимулирующих рост бактерий. Действие дополнительно вносимых метаболитов в данном случае нивелируется, так как бактериальная культура и без того имеет максимально благоприятные условия для роста.
Проведенные эксперименты показали, что внесение 10% препарата «Микростим» в среду культивирования (0,5% раствор глюкозы) увеличивает накопление биомассы лактобактерий практически в 2 раза Влияние препарата «Микростим» на накопление биомассы L. plantarum 8Р-АЗ.
По оси ординат - оптическая плотность контрольной (культивирование в 0,5% растворе глюкозы) и опытной проб (культивирование в 0,5% растворе глюкозы с добавлением 10% препарата). -р 0,001 по f-критерию Стьюдента в сравнении с контролем.
Необходимо отметить, что препарат сравнения «Хилак форте», содержащий метаболиты бактерий нормофлоры, в данном тесте in vitro не оказывает стимулирующего влияния на рост и активность кислотообразования лакто- и бифидобактерий. Напротив, при внесении 10% «Хилак форте» в 0,5% раствор глюкозы рост и кислотообразование лакто- и, особенно, бифидобактерий угнетается. Данный эффект можно объяснить низкой величиной рН и высокой кислотностью препарата.
«Микростим» достоверно стимулирует рост и кислотообразование разных производственных штаммов: штамма-продуцента - L. plantarum 8Р-АЗ, гомологичного штамма лактобактерий - L. fermentum 90Т-С4 и гетерологичного штамма - В. bifidum 1 (табл. 14 и 15). Влияние его на рост бифидобактерий статистически значимо (р 0,001) ниже, чем на лактобактерий (табл. 14).
Стимулирующее действие препарата «Микростим» проявляется на различных питательных субстратах и в присутствии различных углеводов (глюкоза, сахароза, лактоза). При этом прирост оптической плотности культуры лактобактерий статистически значимо (р 0,001) выше на глюкозе, чем на сахарозе. Стимуляция активности кислотообразования на всех трех использованных средах не имеет четко выраженных отличий (табл. 15). Таблица 15 Стимулирующее влияние препарата «Микростим» на активность кислотообразования лакто- и бифидобактерий
Стимулирующее влияние на рост и кислотообразование лактобактерий на 0,5%) растворе глюкозы предложено использовать в качестве показателя специфической активности препарата «Микростим». Данный метод контроля включен в проект ФСП на препарат. Описание методики и расчет коэффициента стимуляции (КС) подробно изложены в главе 2.
