Введение к работе
Актуальность исследования. Стафилококковая инфекция является одной из важнейших проблем медицинской практики. Staphylococcus aureus вызывает гнойно-воспалительные заболевания различной локализации от легких до генерализованных форм [А.В. Дехнич с соавт, 2008; K. Iwatsuki et al., 2006]. Факторами, определяющими трудности терапии данной патологии, является множественная лекарственная устойчивость возбудителя, хронический характер болезни, а также возникновение заболеваний на фоне снижения резистентности организма к инфекции [В.Н. Ефремова с соавт, 1998; Е.Н. Волкова с соавт, 2004].
Известен целый ряд комплексных вакцин (Бронхо-ваксом, ИРС-19, Имудон, стафило-протейно-синегнойная, Иммуновак-ВП-4), в состав которых входят антигены стафилококка, и монопрепаратов (Анатоксин стафилококковый очищенный, Анатоксин стафилококквый адсорбированный, Антифагин), обладающих антигенспецифическим, и иммуномодулирующим эффектом. В НИИВС им.И.И. Мечникова разработана и внедрена в производство (на базе ФГУП «НПО «Микроген» МЗСР РФ) поликомпонентная вакцина Иммуновак-ВП-4. Важным компонентом этой вакцины являются стафилококковые антигены, которые составляют основу противостафилококкового монопрепарата «Стафиловак» (разрешен к применению в практике здравоохранения, приказ МЗ РФ №144/53 от 10 апреля 1996г). Антигены выделены из клеточных стенок 4-х штаммов S. aureus (№№5,9,1986,1991), отобранных ранее из 16 штаммов на основе изучения перекрёстной протективной активности [Л.И. Корзая, 1982; В.Н. Ефремова с соавт, 1998;]. Клинические исследования, проведенные на разных базах, показали, что включение данной вакцины в комплексную терапию хронической стафилококковой инфекции, оказывает длительный терапевтический эффект [С.А. Масюкова с соавт.,1993; Е.В. Сорокина, 2006].
В последние годы появились исследования по сравнительной характеристике вакцинных и выделенных от больных штаммов S.aureus. Выявленные различия в их структуре могут влиять на течение эпидемических и инфекционных процессов [О.Ю. Борисова, 1999; И.Э. Борисова с соавт., 2008; R. Preston et al., 1998; P. Cassiday et al., 2000; S. Gandon et al., 2003]. В связи с развитием вакцинологии в направлении создания новых препаратов генетическая характеристика производственных штаммов, с учётом их факторов патогенности, приобретает особый интерес [В.М. Бондаренко, 1997, 2001; А.Л. Гинцбург с соавт., 1999; С.Ю. Комбарова, 2007]. Это явилось предпосылкой для изучения молекулярно-генетических свойств используемых вакцинных штаммов S. aureus, в частности, определение гена, кодирующего синтез белка А, являющегося одним из факторов патогенности и суперантигеном для В-лимфоцитов, вызывающим их поликлональную активацию, что может привести к подавлению иммунного ответа [Р.М. Хаитов с соавт, 2010].
При изготовлении вакцин Иммуновак-ВП-4 и «Стафиловак» до настоящего времени штаммы стафилококка выращивали на плотной питательной среде. Этот процесс трудоемкий, нетехнологичный и малопроизводительный. Использование реакторного культивирования в жидких питательных средах с последующим отделением биомассы методом микрофильтрации устраняет эти недостатки. Так как стафилококковый компонент является довольно лабильным, возникает необходимость определения возможного влияния технологических изменений на свойства антигенных препаратов, приготовленных из культур, выращенных при периодическом реакторном культивировании. Кроме того, если для препарата Иммуновак-ВП-4 на молекулярно-клеточном уровне изучено действие на систему врождённого и адаптивного иммунитета [Н.К. Ахматова, 2006; Н.К. Ахматова, М.В. Киселевский, 2008], то в отношении стафилококкового компонента таких данных нет.
Цель исследования:
Получение антигенных препаратов из вакцинных штаммов S. aureus, культивируемых на плотных питательных средах и в реакторе, их характеристика (химическая, физико-химическая, иммунохимическая) и изучение влияния на эффекторы врождённого и адаптивного иммунитета.
Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи:
1. Охарактеризовать вакцинные штаммы S. aureus по наличию в них гена, ответственного за синтез протеина А.
2. Изучить накопление биомассы вакцинных штаммов S. aureus при выращивании в различных питательных средах.
3. Провести исследование антигенных препаратов, полученных при разных способах выращивания S. aureus (при реакторном культивировании в сравнении с выращиванием на плотной среде) по химическим, физико-химическим, иммунохимическим свойствам и специфической активности.
4. Исследовать влияние антигенных препаратов S. aureus на эффекторы врожденного иммунитета (дендритные клетки, натуральные киллеры, макрофаги).
5. Изучить действие антигенных препаратов на систему адаптивного иммунитета (продукция специфических антител, протективная активность).
Научная новизна работы
Впервые исследованы вакцинные штаммы S. aureus (№№ 5, 9, 1986, 1991) на наличие spa гена, ответственного за синтез протеина А, и установлено его присутствие только в штамме №5. Наиболее иммуногенные вакцинные штаммы №№ 1986 и 1991 обладали внутривидовой антигенной активностью: способствовали образованию в сыворотках иммунизированных мышей высокого уровня IgG-антител.
Антигенные препараты, полученные из культур, выращенных в условиях периодического реакторного культивирования и на плотной среде, обладали сопоставимой специфической антигенной активностью, включали полисахаридсодержащие компоненты, общие с поверхностным полисахаридом и тейхоевыми кислотами S. aureus Wood-46.
Показано, что антигенные препараты, полученные из вакцинных штаммов S. aureus, культивируемых разными методами (при периодическом реакторном выращивании и на плотных средах):
- стимулируют созревание дендритных клеток,
- индуцируют киллерную активность мононуклеарных лейкоцитов мышей (МЛ) и периферической крови доноров (МЛПК),
- индуцируют экспрессию про-, противовоспалительных и регуляторных цитокинов,
- усиливают фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей,
- стимулируют экспрессию TLR2 и взаимодействуют с ним in vitro,
- стимулируют выработку специфических антител;
- увеличивают численность Т-лимфоцитов (CD3, CD4, CD8), В-лимфоцитов (CD19), T-reg лимфоцитов (CD4/CD25/FoxP3);
- способствуют формированию протективной активности против стафилококковой инфекции.
Практическая значимость работы
Обоснована возможность применения способа периодического реакторного культивирования вакцинных штаммов S. aureus при получении антигенных препаратов для профилактики стафилококковой инфекции. Результаты использованы при разработке производственной технологии реакторного культивирования вакцинных штаммов S. aureus и выделения антигенных препаратов стафилококка, входящих в состав Иммуновак-ВП-4.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Среди исследованных вакцинных штаммов S. aureus, только штамм №5 содержит spa ген, ответственный за синтез фактора патогенности протеина А. Наиболее иммуногенные штаммы (№№ 1986 и 1991) не содержат этот ген.
2. Антигенный препарат, полученный из биомассы вакцинных штаммов S. aureus, выращенных при периодическом реакторном культивировании, по сравнению с препаратом из культур с плотной среды, содержит больше белка и полипептидных компонентов, меньше углеводов.
Препараты сопоставимы по специфической антигенной активности, включают полисахаридсодержащие компоненты, общие с поверхностным полисахаридом и тейхоевыми кислотами стафилококковых препаратов сравнения.
3. Стафилококковые антигенные препараты активируют систему врожденного иммунитета: стимулируют созревание дендритных клеток, индуцируют киллерную активность мононуклеарных лейкоцитов мышей и периферической крови доноров, усиливают фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей, стимулируют экспрессию TLR2 на мононуклеарных лейкоцитах и дендритных клетках, взаимодействуют с TLR2 (на модели эмбриональных клеток почки человека), усиливают экспрессию про-, противовоспалительных и регуляторных цитокинов.
4. Установлена способность стафилококковых препаратов активировать адаптивный иммунитет с индукцией высокого уровня IgG-антител и повышением численности активированных Т и В лимфоцитов.
Дендритные клетки, созревшие под влиянием антигенных препаратов, приобретали способность представлять антиген Т лимфоцитам и защищать мышей от стафилококковой инфекции. На примере препарата, полученного при реакторном культивировании, показана протективная активность в отношении стафилококковой инфекции у мышей.
Апробация материалов диссертации и публикации
Основные материалы диссертационной работы доложены на: Объединённом иммунологическом форуме, (Санкт-Петербург, 2008); Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы», (Москва, 2008); научно-практической конференции молодых учёных и специалистов НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, 2008).
Апробация диссертации состоялась 14 сентября 2010 г на совместной конференции отделов микробиологии и иммунологии НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН.
По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них 6 - статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
