Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современное состояние проблемы фурункула челюстно-лицевой области (обзор литературы) собственные исследования
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 35
2.1. Общая характеристика клинических наблюдений 35
2.2. Методы исследования 36
2.2.1. Микробиологические методы 36
2.2.2. Молекулярно-генетический метод (полимеразно-цепная реакция) . 39
2.2.3. Клинико-лабораторные и иммунологические методы 40
2.3. Лечение больных фурункулом челюстно-лицевой области 42
2.4. Статистические методы обработки полученных результатов 43
ГЛАВА 3. Микробиологический пейзаж кожи, раневого отделяемого, слизистой оболочки носа и зева больных фурункулом челюстно-лицевой области 45
3.1. Сравнительная характеристика микрофлоры раневого отделяемого у больных фурункулом челюстно-лицевой области 45
3.2. Особенности микрофлоры слизистой оболочки зева, переднего отдела носа и кожи лица у больных фурункулом челюстно-лицевой области 49
ГЛАВА 4. Молекулярно-генетические особенности клинических штаммов staphylococcus aureus 56
ГЛАВА 5. Эпидемиологические особенности фурунку ла челюстно-лицевой области 70
ГЛАВА 6. Особенности клинико-иммунологического статуса больных фурункулом челюстно-лицевой области 76
6.1. Клинико-иммунологическая характеристика больных фурункулом челюстно-лицевой области 76
6.2. Оценка эффективности лечения больных фурункулом челюстно-лицевой области по традиционной схеме и с применением иммуномо-дулятора «Бестим» 85
Заключение 90
Выводы 98
Практические рекомендации 99
Список использованной литературы 100
- Методы исследования
- Клинико-лабораторные и иммунологические методы
- Особенности микрофлоры слизистой оболочки зева, переднего отдела носа и кожи лица у больных фурункулом челюстно-лицевой области
- Оценка эффективности лечения больных фурункулом челюстно-лицевой области по традиционной схеме и с применением иммуномо-дулятора «Бестим»
Введение к работе
Актуальность проблемы
Актуальность проблемы фурункула в практике челюстно-лицевого хирурга связана с широкой распространенностью указанной патологии среди пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями, которые занимают одно из ведущих мест в структуре хирургических болезней, несмотря на повсеместно проводимые оздоровительные и профилактические мероприятия. Научно-практический интерес к данной проблеме обусловлен высокой частотой внутричерепных осложнений фурункула челюстно-лицевой области (ЧЛО) (5-14 % случаев), что связывают с недостаточной исследованностью этиопатогенетиче-ских взаимосвязей данной нозологии [Багаутдинова В.И., 2004; Бобров В.М., 2005; Вернадский Ю.И., 2007].
В качестве основных предикторов, определяющих формирование фурункула, рассматривают нарушения эндокринной, иммунной систем организма, но наиболее значимыми из них считают особенности микрофлоры [Сетдикова Н.Х. и др., 2000; Галкина Т.С. и др., 2001; Гурьев В.Н., 2003; Бабушкин А.А., 2004; Волкова Е.Н. и др., 2004; Кабаева Т.И. и др., 2004; Мохаммед К.С., 2004; Дашкова Н.А. и др., 2006]. Последнее, объясняет необходимость более детального исследования биологических свойств возбудителя, что позволит проводить эффективную этиотропную и патогенетическую терапию.
Учитывая, что основными факторами в этиологии фурункула являются условно-патогенные микроорганизмы, в ходе диагностики всегда встает проблема оценки их этиологической значимости. До настоящего времени при этом оценивались фенотипические признаки, которые могли варьировать в широких пределах. В этой связи представляется актуальной и своевременной молекуляр-но-генетическая характеристика патогенного потенциала выделяемой при фурункуле челюстно-лицевой области микрофлоры.
Селекция культур с этиологически значимыми при фурункуле признаками, безусловно, происходит под давлением факторов иммунитета макроорганизма,
поэтому представилось оправданным рассмотрение указанных выше вопросов в контексте с клинико-иммунологическими особенностями течения фурункула челюстно-лицевой области.
Цель исследования
Молекулярно-генетическая характеристика микрофлоры фурункула челюстно-лицевой области, оценка сопряженных с этим клинико-иммунологических особенностей заболевания для адекватной коррекции выявленных нарушений.
Задачи исследования
-
Исследовать микробиологический пейзаж кожи, раневого отделяемого и слизистой оболочки переднего отдела носа и зева больных фурункулом челюстно-лицевой области.
-
Молекулярно-генетическая характеристика клинических штаммов Staphylococcus aureus, выделенных при фурункуле челюстно-лицевой области.
-
Установить клинико-эпидемиологические особенности фурункула челюстно-лицевой области.
-
Оценить иммунологический статус больных фурункулом челюстно-лицевой области и установить особенности, предрасполагающие к развитию указанного заболевания.
-
Провести комплексную клиническую оценку эффективности иммуномоду-лятора «Бестим» в терапии больных фурункулом челюстно-лицевой области на основании результатов исследований микрофлоры и оценки иммунного статуса.
Научная новизна исследования
Впервые при фурункуле челюстно-лицевой области выявлены фрагменты ДНК, специфичные соответствующим детерминантам факторов патогенно-сти S. aureus.
Наиболее распространенными генетическими маркерами этиологической значимости S. aureus, выделенных при фурункуле ЧЛО, по результатам исследования, являются фрагменты ДНК метициллин-резистентности (MRSA), цито-
литического токсина Panton-Valentine лейкоцидина (PVL-F) и энтеротоксина С (SEC3) (р<0,05).
Впервые исследована эпидемиология фурункула челюстно-лицевой области в г. Уфе.
Впервые для иммунокоррегирующей терапии патогенетически обосновано и предложено включение в схему комплексного лечения больных фурункулом челюстно-лицевой области иммуномодулятора «Бестим».
Практическая значимость работы
Впервые у больных фурункулом челюстно-лицевой области определены и предложены для типирования культур и молекулярно-генетическои оценки их этиологической значимости генетические маркеры (MRSA, PVL-F, SEC3) S.aureus.
На основании клинико-иммунологического и микробиологического мониторинга установлена эффективность препарата «Бестим» в комплексном лечении больных фурункулом челюстно-лицевой области.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты исследования внедрены в практическую деятельность отделения челюстно-лицевой хирургии МУ «Городская клиническая больница № 21» Городского округа г. Уфа. Основные положения диссертации используются в учебном процессе при проведении практических занятий у студентов и курсантов на кафедрах хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, лабораторной диагностики ИПО ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава».
Положения, выносимые на защиту
1 Особенность микробиоценоза больных фурункулом челюстно-лицевой области, заключается в появлении патогенных штаммов S.aureus, несущих фрагменты ДНК метициллин-резистентности (MRSA), Panton-Valentine лейкоцидина (PVL-F), энтеротоксина С (SEC3). Для установления этиологической значимости микрофлоры оптимальной является полимеразная цепная реакция.
-
Иммунный статус больных фурункулом челюстно-лицевой области характеризуется дисбалансом Т-клеточного (CD3+), гуморального (IgA, IgG) звеньев системы иммунитета и подавлением поглотительной активности фагоцитирующих клеток.
-
Применение препарата «Бестим» в комплексном лечении фурункула челюстно-лицевой области положительно влияет на состояние клеточных и гуморальных факторов иммунной системы, а также повышает эффективность терапевтических мероприятий при данной патологии.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы представлены на Международных, Всероссийских, региональных научно-практических конференциях: XII Международной научной конференции и III Международной научной онкологиче- ской конференции «Здоровье семьи — XXI век, онкология — XXI век» (Пермь, 2008); 73-й итоговой Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых Республики Башкортостан (Уфа, 2008); II Международной студенческой научной конференции с участием молодых ученых «Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (Москва, 2010); VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика- 2010» (Москва, 2010); II ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2010); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы стоматологии» (Уфа, 2010); Республиканской конференции молодых ученых Республики Башкортостан с международным участием «Медицинская наука - 2010», посвященной Году Республики, Дню Медицинского работника (Уфа, 2010).
Диссертация доложена и обсуждена на совместном заседании кафедр лабораторной диагностики ИПО, фундаментальной и прикладной микробиологии, оториноларингологии, стоматологии и челюстно-лицевой хирургии ИПО, госпитальной педиатрии и ЦНИЛ Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный ме-
дицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (протокол от «17» ноября 2010 г. № 87).
Диссертация апробирована на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 208.006.05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (протокол от «29» декабря 2010 г. № 7).
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения диссертации соответствуют формуле специальностей 03.02.03 — «Микробиология», 14.01.14 - «Стоматология» (медицинские науки). Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования данных специальностей, конкретно пунктам 2 и 3 паспорта микробиологии и пункту 3 - стоматологии.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 3 -в рецензируемых изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации основных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 120 страницах текста, содержит 20 таблиц, 17 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы (одна глава), собственных исследований (5 глав), заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы. Список литературы содержит 194 источника (98 - отечественных и 96 - зарубежных).
Работа выполнена в соответствии с федеральной целевой программой «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., в рамках реализации мероприятия 1.2.1. Государственный контракт № П 385 от 30 июля 2009 г.
Методы исследования
Фурункул челюстно-лицевой области (ЧЛО) представляет собой одну РІЗ наиболее часто встречающихся в челюстно-лицевой хирургии форм гнойно-воспалительного заболевания, поражающего до 85% людей в возрасте от 12 до 24 лет [2, 12,96].
Частота фурункула ЧЛО у молодого и трудоспособного населения, его опасность для жизни подчеркивает необходимость неотложной медицинской помощи больным, обусловливает практическую и социальную значимость данной патологии [48, 57].
В последние годы частота этой патологии, её внутричерепных осложнений и сепсиса неуклонно растет, от 5 до 14% случаев, что объясняется не только и даже не столько несовершенством применяемых методов лечения, сколько недостаточным изучением патофизиологических и патоморфологических процессов, являющихся основой клинической симптоматики данной патологии [6, 8, 180].
Изучение этиологии фурункулеза позволило констатировать, что микрофлора, вегетирующая на коже лица человека, является условно патогенной, способной вызывать ФЛ, однако наиболее частой причиной развития ФЛ является стафилококк, и в первую очередь, S.aureus, высеваемый в последнее время в монокультуре из гнойного очага ФЛ в 60-97% случаев [32, 70, 76].
Стафилококки распространены повсеместно, колонизируют кожные покровы и поверхности слизистых оболочек человека. Свойства образовывать скопления, напоминающие гроздья винограда в результате деления во взаимно перпендикулярных плоскостях, определило их название (от греческого Sta-phyle — виноградная гроздь, coccos - зерно, ягода). Пиогенные кокки, вызывающие развитие гнойного абсцесса у человека и формирующие неправильные кластеры, впервые описаны в 1880 г. шотландским хирургом A. Ogston
и, практически, одновременно Луи Пастером. Несколько позднее, F J. Rosen-bach (1884) выделил стафилококки в чистой культуре. Он использовал предложенный A. Ogston термин в таксономическом смысле, описав род Staphylococcus. Однако таксономическое положение рода в течение длительного времени оставалось не определенным и многократно пересматривалось [23, 63, 64]. Согласно 9 изданию «Определителя бактерий Берджи» (1997) стафилококки были отнесены к группе грамположительных факультативно анаэробных кокков вместе с родами Aerococcus, Enterococcus, Gemella, Lactococcus, Leuconostoc, Melissococcus, Pediococcus, Saccharococcus, Stomatococcus, Streptococcus, Trichococcus и Vagococcus. От других представителей этой группы стафилококков отличает совокупность свойств, включающая характерное взаиморасположение микробных клеток в культуре, способность к росту в температурном интервале от 6,5С до 45С, при рН среды в пределах 4,2-9,3, в присутствии повышенных концентраций NaCl (до 15%) и 4-0% желчи. Однако содержание гуанидина + цитозина в структуре ДНК Staphylococcus на уровне 30-39%, а таюке ряд других таксономических критериев, в том числе и параметры ДНК - ДНК-гибридизации и 16S рРНК сиквенса, свидетельствовали о филогенетической близости данного рода к родам Enterococcus, Bacillus, Listeria и Planococcus. Это привело к тому, что в последние годы таксономическое положение рода было вновь пересмотрено. Согласно современной классификации, основанной, преимущественно, на данных геносистема-тики, род Staphylococcus вместе с другими, менее известными, родами: Gamel-la, Micrococcus, Jeotgalicoccus и Salinococcus, образует семейство Staphylococ-сасеае, которое относят к порядку Bacillales, классу Bacilli, группе бактерий с плотной клеточной стенкой. Филогенетически наиболее близкими ему являются представители рода Bacillus из семейства ВасШасеае, а также представители семейства Listeriaceae, которые также отнесены к порядку Bacillales (Вег-gey s Manul, 2001; Todar s Online Textbook of Bacteriology, 2005).
Основной экологической нишей для стафилококков считаются кожные покровы и слизистые оболочки теплокровных животных и человека, однако они могут быть изолированы из пищевых продуктов и воздуха, значительно реже из пыли и воды. Стафилококки - неподвижные и не образующие спор бактерии. По типу питания они хемоорганотрофы, по типу дыхания - факультативные анаэробы. Выраженная метаболическая активность стафилококков позволяет им колонизировать, а в последующем и активно вегетировать в различных органах и тканях макроорганизма хозяина. Некоторые виды могут формировать капсулу и биопленки, которые повышают устойчивость микроорганизмов к действию неблагоприятных факторов внешней среды, антибиотиков и дезинфектантов, а также механизмов иммунной защиты хозяина, обеспечивают им возможность колонизовать поверхность синтетических полимеров медицинского назначения, способствуют длительной персистенции микробов в условиях макроорганизма [23, 63].
Клеточная стенка содержит два главных компонента: пептидогликан и связанные с ним тейхоевые кислоты. В отличие от других грамположитель-ных факультативно анаэробных кокков стафилококки чувствительны к действию лизостафина - эндопептидазы, гидролизующей глицил-глициновые связи в межпептидных мостиках пептидогликана, но устойчивы к действию лизоци-ма. Устойчивость к лизоциму обусловлена О-ацетилированием N-ацетилмурамовой кислоты в молекуле пептидогликана [112].
Род Staphylococcus насчитывает около 50 видов и подвидов (Bacterial nomenclature Upo-date, 2006), большинство из которых являются комменсалами с различной хозяйской специфичностью. Наиболее патогенным среди них как для человека, так и для многих млекопитающих, является вид Staphylococcus aureus. Это объясняется способностью представителей данного вида экспрессировать большое количество потенциальных факторов патогенности, участвующих в колонизации и развитии инфекционного процесса [168, 182]. Наиболее известной таксономически значимой характеристикой S.aureus явля 13 ется способность коагулировать плазму крови, которая обусловлена продукцией внеклеточно секретируемого протеина с молекулярной массой около 44 Ша. Взаимодействуя с протромбином, плазмокоагулаза активирует процесс превращения фибриногена в фибрин. Образовавшийся сгусток защищает микробные клетки от действия бактерицидных факторов макроорганизма и обеспечивает благоприятную среду для их размножения [23, 182].
S.aureus распространен повсеместно, входит в состав нормальной микрофлоры человека, обычно колонизирует носовые ходы, кожные покровы, обитает в толстой кишке и влагалище [10, 29, 39]. Вместе с тем, по данным зарубежных авторов S.aureus это обычный комменсал человека и его первичное место распространения это влажный чешуйчатый эпителий передних носовых ходов. Около 20% популяции постоянно колонизированы S. aureus, 60% перемежающиеся носители, и 20% никогда не встречаются с этим микроорганизмом [171]. Золотистый стафилококк находят у детей в возрасте нескольких дней (около 30% новорожденных колонизированы штаммами S.aureus в течение первой недели после рождения) [119], но в течение нескольких месяцев число носителей резко сокращается, и основную группу составляют лица старшего возраста (бактерии выделяют у 15-30% клинически здоровых взрослых лиц). В большинстве случаев носительство ограничено несколькими неделями или месяцами; хроническое носительство типично для персонала медицинских учреждений; пациентов, страдающих атопическим дерматитом [190], контактным дерматитом [166], псориазом, кожной Т-клеточной лимфомой [47, 176], а также регулярно использующих инъекции различных препаратов (наркоманы, больные сахарным диабетом, лица с повторными гемодиализами и др.). Механизм инфицирования обычно связан с переносом возбудителя из участков колонизации на травматизированную поверхность, существенную роль играют также тесные контакты с носителями.
Клинико-лабораторные и иммунологические методы
Так, были рекомендованы методы вызывания некроза поверхностного слоя кожи химическими препаратами: кристаллами марганцевокислого калия или кристаллического салицилового натрия, налагаемыми на поверхность фурункула, кристаллической салициловой кислоты, криотерапия фурункула че-люстно-лицевой области. При лечении карбункулов лица была предложена лучевая терапия: ультрафиолетовое облучение, рентгенотерапия и азеротера-пия [48, 49, 55, 56, 60, 74, 135]. В качестве эффективного биологического средства был предложен метод лечения фурункулов медицинскими пиявками [97]. Пиявки, приложенные в область фурункула, с кровью отсасывали некротические массы, вместе с тем гирудин, входящий в состав пиявок оказывал бактерицидное действие. Данный способ сокращал сроки лечения на два дня.
Многие авторы отмечали, что при «злокачественных» карбункулах лица и наличии быстро прогрессирующего инфильтрата и тромбофлебита спасти больного не удается, так как все выше перечисленные методы лечения хороши только на ранних стадиях [97, 98].
Существенное место в санации организма при фурункулезе занимает этиотропное лечение, которое включает антибиотики, сульфаниламидные препараты. Антимикробные препараты занимают важное место в лечении и профилактике осложнений фурункулеза [38, 43, 86]. Вопрос об их рациональном применении достаточно сложен и требует дальнейшего изучения. Для анти-биотикопрофилактики гнойно-септических осложнений большинство исследователей рекомендует руководствоваться принципом "разумной достаточности": используемый препарат должен обладать активностью против основных представителей микроорганизмов данной нозологии. В литературных источниках встречаются многочисленные сообщения о формировании резистентных к антибиотикам штаммов стафилококков [38, 81, 82, 114, 125, 138, 182, 189]. Предпринимались попытки улучшить эффективность терапии фурункулеза комбинированным применением двух или больше различающихся по механизму действия антибиотиков, антибиотиков с витаминами группы В, десен 32 сибилизирующими и антигистаминными препаратами, антибиотиков и стафилококковой аутовакцины [78], физиотерапией (УВЧ, УФО) и местной терапией [48, 49, 54, 55, 87].
Однако известно, что благоприятный исход большинства инфекционных заболеваний зависит от состояния иммунной системы и её способности к формированию иммунологических реакций, направленных на элиминацию возбудителя заболевания.
Многочисленные публикации свидетельствуют об угнетающем действии антибиотиков на синтез иммуноглобулинов, специфических антител. Под их влиянием снижается активность лизоцима, комплемента фагоцитоза, подавляется реакция бласттрансформации на фитогемагглютинию [78]. В результате бессистемного применения антибиотиков формируются новые госпитальные штаммы микроорганизмов, что, по мнению многих авторов, может вызвать рост заболеваемости госпитальными инфекциями [67, 82, 102]. Неблагоприятное воздействие антибактериальных препаратов на микрофлору кишечника создает опасность развития дисбактериоза с преобладанием условно-патогенных грамотрицательных бактерий. Перспективным направлением в профилактике и лечении гнойно-воспалительных заболеваний является использование иммунных препаратов, направленных на пассивное повышение или активную стимуляцию специфического антибактериального иммунитета больных. Преимущество биопрепаратов перед антибиотиками состоит в том, что под их влиянием не наступает адаптации возбудителя, не формируются устойчивые штаммы, не развивается дисбактериоз.
Наиболее широкое применение в качестве активной специфической иммунотерапии, направленной на повышение защитных сил организма, получил стафилококковый анатоксин, который не утратил своей популярности до настоящего времени. С благоприятными терапевтическими результатами использовали стафилококковый анатоксин для лечения больных пиодермиями, в том числе фурункулезом, в качестве монотерапии. Положительный терапевтический эффект стафилококкового анатоксина обусловлен гипосенсибилизирующим действием, формированием стойкого антитоксического и менее выраженного антимикробного иммунитета, повышенной элиминацией возбудителя из организма, активацией фагоцитоза, усилением клеточного и гуморального иммунитета более выраженными при сочетанной терапии стафилококковым анатоксином и антифагином [78, 84, 97]. Как следует из приведенных литературных данных, одновременно с положительной клинико-иммунологической оценкой стафилококкового анатоксина при стафилококковых инфекциях предпринимаются многочисленные попытки повысить результаты лечения путем комбинации препарата с другими лекарственными средствами. Последнее, иллюстрирует недостаточную терапевтическую эффективность стафилококкового анатоксина.
Из других стафилококковых иммунопрепаратов в терапии больных хроническими пиодермиями применяются стафилококковый антифагин, стафилококковая вакцина, стафилококковая формоловая и аутовакцина, стафилококковый бактериофаг, антистафилококковая плазма, поливалентная стафилококковая аутовакцина, в качестве монотерапии и в комбинации с другими лекарственными Средствами, адсорбированный стафилококковый анатоксин [71, 78, 97]. Клинические наблюдения показывают, что достигаемый под влиянием указанной фармакотерапии положительный эффект нестоек и после отмены ее отмечается обострение.
Таким образом, применение специфических активных и пассивных стафилококковых иммунопрепаратов в качестве монотерапии и в комплексе не решило проблему лечения пиодермии и фурункулеза в частности. Изучение иммунологических сдвигов при хроническом течении фурункула позволило внедрить в практику неспецифическую иммунокоррекцию. Первыми препаратами были: пирогенал, продигиозан, левамизол (декарис), нуклеинат натрия. Позднее были использованы препараты химического проис 34 хождения (Т-активин, ликопид и др.), современные немедикаментозные методы лечения (лазеротерапия, магнито-лазеротерапия и др.) [33, 34, 36, 45, 46]. Отсутствие достаточно полных данных о патогенезе фурункулеза ограничивает применение перечисленных способов лечения без показателей иммунного статуса. Трудности в лечении фурункулеза зачастую связаны и с наличием сопутствующей патологии, что, как правило, ухудшает иммунологические параметры.
Хирургическое лечение при фурункулезе заключается в создании благоприятных условий для эвакуации гнойного отделяемого, осуществляя вскрытие очага воспаления [97].
Таким образом, лечение фурункула челюстно-лицевой области складывается из мероприятий местного воздействия на очаг воспаления и общего воздействия на организм.
Вышеизложенное обуславливает необходимость подробного изучения комплекса свойств возбудителя фурункула челюстно-лицевой области, с использованием ПНР анализа, и сопоставление полученных данных с микробиологическим статусом тканей, прилежащих к очагу воспаления, поскольку это позволит определить место и значение биологических свойств инфекционного фактора в механизме развития фурункула челюстно-лицевой области; оптимизировать диагностические и лечебные мероприятия при указанной патологии.
Особенности микрофлоры слизистой оболочки зева, переднего отдела носа и кожи лица у больных фурункулом челюстно-лицевой области
Качественное определение микроорганизмов. Взятие материала осуществляли стерильным ватным тампоном по общепринятой методике. Взятый материал помещался в стерильные пробирки и доставлялся в лабораторию не позднее, чем через 1-2 часа после забора, или в пробирку с буфером и доставлялся в лабораторию в течение суток. Мазок после предварительной микроскопии (окраска по Граму), где проводилась предварительная дифференцировка грам-положительной и грамотрицательной флоры, засевали на питательные среды. Посев производили на сахарный и солевой бульон, на 5% кровяной агар, жел-точно-солевой агар, мясо-пептонный агар и среду Эндо. Материал помещали в термостат при температуре 37 С на 24 часа.
При определении чувствительности к антибиотикам методом дисков, штаммы считали высокочувствительными при наличии зоны задержки роста более 12 мм, чувствительными - при наличии зоны задержки роста 7-12 мм, слабочувствительными - при наличии зоны задержки роста 2-7 мм и штаммы считали нечувствительными, когда отсутствовала зона задержки роста или зона задержки роста была менее 2 мм, т. е. штаммы были устойчивы к данному антибиотику. При необходимости использовали твердые питательные среды с определенной концентрацией антибиотиков.
Определение плазмокоагулазной активности. Под действием фермента коагулазы и активатора ее, содержащегося в плазме и тканях некоторых видов животных, образуется тромбиноподобное вещество, которое и свертывает фибриноген, образуя гель.
Для реакции использовали цитратную кроличью плазму. Перед постановкой реакции плазму разводили 1:3—1:5 физиологическим раствором и разливали в стерильные пробирки по 0,3-0,5 мл. В пробирку вносили одну петлю суточной агаровой культуры и эмульгировали в цитратнои плазме кролика, тщательно размешивая. Пробирки выдерживали при 37 С. Результаты учитывали через 1, 2, 4, 8 и 24 часа. Любую степень свертывания плазмы расценивали как положительный результат.
Определения гемолитической активности культур готовили на 5% кровяном агаре. С этой целью приготовили чашки с питательным агаром, содержащим 5% отмытых физиологическим раствором эритроцитов барана, кролика и человека.
На поверхность питательной среды засеяли штрихами исследуемые культуры. Посевы инкубировали при 37 С в течение суток, после чего учитывали результаты.
Определение лецитовителазной активности культур стафилококка. Посев культур производили бляшками на желточно-солевой агар (ЖСА) и инкубировали при 35—37 С в течение 2 суток. В положительном случае при осмотре посевов вокруг колоний отмечалось помутнение в среде и образование на поверхности среды радужного венчика.
Определение ДНК-азной активности стафилококка. Для определения ДНК-азной активности на плотную среду, содержащую высокополимерную ДНК, засевали бляшками исследуемые культуры и, после выращивания их при 37С, заливали поверхность питательной среды небольшим количеством (5— 7 мл) соляной кислотой. Через 2-3 минуты кислоту сливали и учитывали результаты. Нерасщепленная ДНК, под действием соляной кислоты, выпадала в виде непрозрачного преципитата в зоне деполимеразной ДНК.
Определение фибринолитической активности. К 100 мл МПА с 1% глюкозы, расплавленного и охлажденного до 45 С добавляли 4-5 мл плазмы. Среду нагревали на водяной бане и разливали в чашки. После застывания агара производили посев по 15 бляшек на чашку. При наличии в культуре фермента фибринолизина вокруг бляшки наблюдалось просветление среды. Определение фосфатазной активности культур стафилококка.
К 100 мл МПА добавляли 10 мл 0,1% раствора фенолфталеина натрия. Посев культуры производили бляшками. После 18-24 часовой инкубации при 37 С на выросшие колонии воздействовали парами аммиака. Для этого на дно крышки чашки Петри наливали несколько капель тройного нашатырного спирта и наблюдали за порозовением бляшек (положительная реакция).
Количественное определение микроорганизмов. Существенное значение в объективной оценке течения раневой инфекции, эффективности проводимого лечения и дальнейшего прогноза течения заболевания имеет количественное определение микроорганизмов. Определяли количество микроорганизмов в 1 грамме ткани, взятой из глубины раны по общепринятой методике по числу колониеобразуюших частиц (КОЭ) в 1 мл испытуемого материала.
Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей, полученных посредством Интернета в обновляемых версиях «GenBank» для подбора прай-меров и оптимальных условий для ПЦР, сайтов эндонуклеаз рестрикции, выравнивания сиквенсов, проводили с помощью пакета компьютерных программ Lasergene (DNASTAR, Inc. США) с использованием IBM-совместимых персональных компьютеров.
Для амплификации различных фрагментов ДНК был использован метод полимеразно-цепной реакции (ПЦР).
Объем реакционных смесей для ПЦР варьировал от 20 мкл, в зависимости от целей эксперимента. В этом случае реакционная смесь объемом 20 мкл содержала 0,2 мкл геномной ДНК (20 нг/мкл), 2 мкл 10-кратного буфера для Taq-полимеразы, поставляемого в наборе с используемым ферментом, 100 мкМ каждого из дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ), 100 нг (0,1 мкМ) каждого праймера и 2 е.а. Taq-полимеразы. Во избежание испарения жидкости на поверхность каждой реакционной смеси наслаивали 50 мкл вазелинового масла. ПНР проводили в амплификаторах МС-16 («ДНК-технология», Россия).
На начальном этапе проводилась денатурация ДНК при 94 С, после чего следовали 25-30 циклов амплификации, каждый из которых включал стадию денатурации ДНК в течение 30 сек при 94 С, стадию отжига праймеров продолжительностью 30 сек при температуре от 57 до 62 С (в зависимости от длины и нуклеотидной последовательности использованных праймеров), и стадию элонгации в течение 20 сек при температуре 72 С, которая оптимальна для активности Taq ДНК полимеразы.
На заключительной стадии реакционная смесь выдерживалась при температуре 72 С в течение 2 мин для завершения построения комплементарных цепей фрагментов ДНК и исключения копий, содержащих не полностью достроенные молекулы. В некоторых случаях, для оптимизации ПЦР и уменьшения количества неспецифичных продуктов амплификации использовалась специальная процедура, получившая название «горячего старта». При этой процедуре добавление Taq ДНК полимеразы, разбавленной в 10 мкл соответствующего 1-кратного буфера, в реакционную смесь осуществлялось только после нагрева последней до 94 С, что исключало возможность неспецифичного отжига праймеров на нуклеотидных последовательностях с низкой гомологией. По завершении амплификации из реакционной смеси отбирали аликвоту объемом 10 мкл и анализировали в 1,5%-ном агарозном геле.
Оценка эффективности лечения больных фурункулом челюстно-лицевой области по традиционной схеме и с применением иммуномо-дулятора «Бестим»
Полученные нами данные отражают селективную недостаточность гуморального звена иммунитета по IgA, что способствует персистенции возбудителя на слизистых оболочках полости носа и зева. Повышенный уровень IgG у больных с рецидивирующим течением фурункула ЧЛО свидетельствует наличие хронического воспалительного процесса.
Таким образом, у больных фурункулом челюстно-лицевой области наблюдаются изменения в крови, характеризующие наличие острого воспалительного процесса (лейкоцитоз, ускоренное СОЭ). Снижение общего количества лимфоцитов, Т-лимфоцитов связано с миграцией этих клеток в очаг воспаления. Недостаточность фагоцитарной активности нейтрофилов обуславливает тяжесть процесса и является фактором риска развития грозных осложнений. Кроме того, недостаточность фагоцитоза является одним из факторов, способствующих накоплению ЦИК, которые в свою очередь могут утяжелять течение процесса. Установленное нами снижение уровня IgA у больных с фурункулом ЧЛО является одной из причин, обуславливающих персистенцию возбудителя на слизистых оболочках, и согласуется с установленной нами высокой частотой обнаружения S.aureus у больных фурункулом челюстно-лицевой области в секрете носоглотки.
Полученные нами результаты свидетельствуют об активной мобилизации факторов защиты на дисбиотический процесс в микроэкосистеме кожи, полости носа и зева, наблюдающийся при фурункуле, однако некоторые показатели сигнализируют об угнетении механизмов естественной защиты, что и нашло свое отражение в низких значениях основных тестов естественной резистентности.
В настоящее время лечение фурункула в большинстве случаев проводят по схеме, включающей мероприятия, направленные на элиминацию условно-патогенной микрофлоры. Существенное место в санации организма занимает этиотропная терапия, включающая противомикробные препараты [6, 24, 28, 32, 38, 49, 83]. Однако известно, что характерной особенностью острых и особенно хронических пиодермии является определенные изменения местной и общей иммунореактивности, что затрудняет лечение, способствуя хронизации процесса.
Частые рецидивы фурункула, служащие маркерами иммунных нарушений, требуют выработки общепризнанных единых взглядов на возможность их коррекции. Использование существующих лечебных подходов не способствует окончательному решению данной проблемы. В то же время создаются новые иммуно-тропные препараты, особенности влияния которых, на пациентов с фурункулом следовало бы прояснить и разработать необходимые терапевтические алгоритмы.
В этой связи задачей нашего исследования явилась сравнительная оценка эффективности терапии фурункула в соответствие со стандартной схемой и при использовании лекарственных препаратов, направленных на восстановление дисбаланса иммунной системы.
В качестве иммунокорригирующей терапии мы использовали лекарственный препарат «Бестим» (у-Б-глутамил-Ь-триптофан натриевая соль).
От каждого пациента, в схему лечения которого включено инъекционное введение иммуномодулятора «Бестим», было получено письменное информированное согласие на проведение исследования.
В зависимости от проводимой терапии все больные фурункулом челю-стно-лицевой области были разделены на две клинические группы. Первая клиническая группа состояла из больных, страдающих острым фурункулом (п=22), которые получали традиционное лечение, заключающееся в проведении местных воздействий непосредственно на очаг гнойно-некротического воспаления, в виде вскрытия и дренирования фурункула с последующим наложением мазевых повязок (левомеколь), а также в системном воздействии -проведении антибактериальной, дезинтоксикационной, антикоагулянтной, ги-посенсибилизирующей терапии. Вторую группу сформировали больные хроническим рецидивирующим фурункулезом (п=23), которым в период острых клинических проявлений дополнительно к традиционному лечению был на 86 значен иммуномодулятор «Бестим», вводимый по схеме, рекомендуемой производителями препарата, один раз в сутки внутримышечно в терапевтической дозе 100 мкг, курс лечения составил 5 инъекций.
Больные обеих сравниваемых групп статистически значимо не отличались между собой по возрасту, социальному статусу и клиническим проявлениям (р 0,05).
Для оценки эффективности использованного нами препарата «Бестим», проводилось контрольное иммунологическое и бактериологическое исследование после окончания курса лечения, при этом учитывали состояние клеточного и гуморального звена иммунной системы, динамику количественного состава отделяемого носа и зева (КОЕ/мл) в ходе лечения.
В результате проведенного исследования установлено, что в группе больных фурункулом челюстно-лицевой области после проведенного традиционного курса терапии без применения иммуномодулируїощих препаратов изменений в клеточном звене иммунной системы не отмечалось, по сравнению с показателями больных, в комплексное лечение которых были включены инъекции иммуномодулятора.
Динамика изменений отдельных иммунологических параметров до и после лечения представлена в таблице 19.
Как следует из полученных данных, средние показатели процентного и абсолютного количества лимфоцитов изучаемых групп показывают увеличение значения показателей лимфоцитов у больных фурункулом лишь после иммунокорригирующей терапии относительно начала лечения (р 0,005).
Из таблицы следует, что при сопоставлении средних значений CD3+, CD4+, CD8+ лимфоцитов больных фурункулом челюстно-лицевой области до и после лечения отмечалось статистически значимое увеличение в процентном и абсолютном выражении CD3+, CD4+, CD8+ клеток у больных после проведенного курса терапии с применением иммуномодулирующего препарата «Бестим» относительно показателей до лечения (р 0,05).
Таким образом, удалось установить положительную динамику в изменении показателей CD3+, CD4+, CD8+ лимфоцитов в группе больных с иммунологической поддержкой.
Результаты измерения уровня фагоцитарной активности нейтрофилов выявили значимое повышение показателя в группе больных с иммунокоррекцией: 58,74±4,80% относительно параметров до лечения: 52,96±4,86% (р 0,005).
Изучение изменений сывороточных уровней иммуноглобулинов (IgA, IgM, IgG) у пациентов в динамике показало, что после лечения наблюдалось достоверное повышение содержания IgA во 2-ой группе относительно показа 88 телей до лечения - 1,79±0,31 г/л и 1,40±0,33 г/л, соответственно (р 0,05); статистически значимых изменений показателей IgG и IgM в 1-ой (1,27±0,31 г/л; 12,94±2,66 г/л соответственно) и во 2-ой (1,32±0,34 г/л; 13,25±3,40 г/л соответственно) группах после соответствующей терапии, как следует из таблицы 20, выявлено не было (р 0,05).
Циркулирующие иммунные комплексы определяли у пациентов обеих групп после лечения. Среднее значение ЦИК при фурункуле достоверно понижалось относительно начала лечения в группе больных с иммунокоррекци-ей (р 0,005).
Таким образом, анализ полученных данных показал, что в результате применения иммуномодулятора «Бестим» в комплексном лечении пациентов с фурункулом челюстно-лицевой области у больных отмечена активация клеточного звена иммунитета. Она характеризовалась увеличением уровня CD3+, CD4+, СБ8+лифоцитов по сравнению с исходным. Показатели гуморального иммунитета у больных характеризовались повышением уровня IgA в сыворотке крови. Естественные факторы защиты при применении «Бестим» у больных фурункулом челюстно-лицевой области характеризовались повышением уровня IgA, что косвенно отражает улучшение состояния слизистых оболочек.
При исследовании микробиологического статуса окружающих тканей обратило на себя внимание положительная динамика в изменении общего микробного числа секрета носоглотки.
Результаты проведенного исследования показали, что ОМЧ отделяемого переднего отдела носа и зева в 1-й и 2-й группах изменялось различным образом. В 1-й группе больных с традиционным методом лечения ОМЧ секрета статистически значимо не изменялось, при этом S.aureus был выделен в высоком титре (р 0,001). Во 2-й группе больных с иммунокорригирующей терапией, ОМЧ отделяемого носоглотки монотонно уменьшалось от 1-го к 5-му дню лечения (Хи-квадрат = 23,43, р 0,0001, коэффициент конкордантности = 0,51).
Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать вывод о клинической эффективности и безопасности иммунокоррекции препаратом «Бестим» в составе комплексной терапии больных фурункулом ЧЛО на фоне иммунодепрессии. Учитывая современные аспекты патогенеза данной нозологии и особенности препарата «Бестим», можно говорить об иммунопа-тогенетически обоснованной терапии, что позволит улучшить результаты лечения и уменьшить риск развития рецидивов.
