Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы .36
1.1.Основные возбудители гнойного бактериального менингита .36
1.1.1.Streptococcus pneumoniae. Факторы патогенности, фенотипы 36
1.1.2. Neisseria meningitidis. Факторы патогенности, фенотипы .39
1.1.3. Haemophilus influenzae. Факторы патогенности, фенотипы 41
1.2.Устойчивость основных возбудителей гнойного бактериального менингита к антибиотикам .42
1.3. Лабораторная диагностика гнойного бактериального менингита .45
1.4. Вакцинопрофилактика .54
Собственные исследования .57
ГЛАВА 2. Анализ распостранения основных возбудителей гнойного бактериального менингита в станах СНГ 57
2.1.Идентификация возбудителей гнойного бактериального менингита в спинномозговой жидкости 57
2.2. Характеристика выделенных штаммов .61
ГЛАВА 3. Профили чувствительности к антибактериальным препаратам возбудителей гнойного бактериального менин гита, выделеных из смж больных детей 66
3.1. Анализ антибиотикочувствительности штаммов S.pneumoniae .66
3.2. Анализ антибиотикочувствительности штаммов N. meningitidis .70
3.3. Анализ антибиотикочувствительности штаммов H.influenzae 72
ГЛАВА 4. Филогенетический анализ штаммов, выделенных из СМЖ 74
4.1. Мультилокусное сиквенс-типирование штаммов S.pneumoniae 74
4.2. Мультилокусное сиквенс-типирование штаммов N.meningitidis 75
4.3. Мультилокусное сиквенс-типирование штаммов H.influenzae 77
ГЛАВА 5. Сравнительый анализ штаммов s. pneumoniae, вызыва
ющих инвазивные и неинвазивные формы инфекций 79
ГЛАВА 6. Алгоритма идентификации возбудителей гнойного бактериального менингита .83
Заключение 85
Выводы 93
Практические рекомендации 94
Преспективы дальнейшей разработки темы 94
Список сокращений .95
Список литературы
- Neisseria meningitidis. Факторы патогенности, фенотипы
- Характеристика выделенных штаммов
- Анализ антибиотикочувствительности штаммов N. meningitidis
- Мультилокусное сиквенс-типирование штаммов N.meningitidis
Neisseria meningitidis. Факторы патогенности, фенотипы
Углеводы 4-х разных типов: глюкоза, мальтоза, лактоза и сахароза добавлялись в пробирки с ЦТА до достижения окончательной концентрации 1% углеводов. В качестве индикатора в питательную среду вносился феноловый красный. С 24 часовой культуры выросшей на кровяном агаре одноразовой петлей снималось 3-5 колоний микроорганизмов. Затем петля с посевным материалом 8 раз погружалась на глубину 10 мм в ЦТА с углеводами. Для каждого углевода использовалась отдельная одноразовая петля. Пробирки с неплотно завинченными крышками помещались в термостат при температуре 35-37C без атмосферы CO2 . Инкубировались посевы на ЦТА не менее 72 часа. Появление видимой мутности и желтого окрашивания в верхней части столбика среды указывало на рост культуры и образование кислоты и интерпретировалось как положительный результат.
Тест Ковача на оксидазу Для приготовления 1% раствора реактива Ковача 0,1 г тетраметил-пара-фенилендиамин дигидрохлорида растворяли в 10 мл стерильной дистиллированной воды, тщательно размешивали и оставляли на 15 минут. На полоску фильтровальной бумаги наносили несколько капель приготовленного раствора Ковача и давали высохнуть ей на воздухе. Пластиковой одноразовой петлей снимали часть выросшей за ночь культуры и втирали ее в пропитанную реактивом филь 16 тровальную бумагу. Изменение цвета в течение 10 секунд на фиолетовый свидетельствовало о положительной реакции.
Определение потребности в X (гемин) и V (НАД) факторах роста
Для исследования использовали 18-24 часовую культуру штаммов выросших на “шоколадном” агаре, инкубированных при 35-37C в атмосфере с 5% CO2. Из выросших культур приготавливали умеренно густую суспензию бактериальных клеток (сопоставимую со стандартом 1,0 по МакФарланду), в триптиказо-соевый бульоне и тщательно перемешивали на вортексе. Пользуясь стерильной петлей, засевали на одну половину чашки с триптиказо-соевым агаром 10 мкл взвеси культуры и давали посеву высохнуть. На чашки с внесенным посевным материалом после высыхания инокулята раскладывали бумажные диски, содержащие гемин, НАД и гемин/НАД. Осторожно переворачивали чашки вверх дном и инкубировали в термостате в течение 18-24 ч при 35-37C в присутствии 5% CO2 . Затем осматривали рост культуры вокруг бумажных дисков. H. influ-enzae давала рост только вокруг бумажного диска, содержащего и гемин и НАД.
Серологический метод Для определения серогрупп и серотипов культур N. meningitidis, H. influ enzae и S. pneumoniae, выпускаются несколько тест систем, принцип действия которых основан на реакции агглютинации. Для серотипирования H. influenzae, N. meningitidis и S. pneumoniae использовались коммерческие тест системы
Pastorex meningitidis Latex kit (Biorad, США), Pneumotest Latex kit (SSI, Дания), индивидуальные антисыворотки к N. meningitidis (BD, США). Постановку реакций и оценку результатов проводили в соответствии с инструкциями по применению производителя.
Реакция иммунного набухания капсулы (проба Нейфельда)
При помощи стерильной петли снимали культуру S. pneumoniae, выросшую за ночь на кровяном агаре, и суспендировали в 0,5 мл 0,85% физиологического раствора, полученная суспензия была умеренной мутности (примерно со 17 ответствовала 0,5 по Макфарланду). Наносили на предметное стекло по 5 мкл индивидуальных антисывороток (SSI, Дания) и метиленовой сини. Добавляли примерно 0,2-1,0 мкл разведенной взвеси клеток и затем перемешивали все три компонента наконечником пипетки. Накрывали взвесь квадратным покровным стеклом площадью 22 мм2 и инкубировали при комнатной температуре (25C) в течение 10-15 мин. Учет результатов осуществляли при увеличении с использованием иммерсионного объектива 1000 микроскопа «Zeiss». Интерпретацию результатов производили согласно инструкции производителя.
Методы на определение антибиотикочувствительности Тест на продукцию -лактамазы
Экспресс-тест на продукцию -лактамазы может дать клинически значимую информацию еще до получения результатов определения чувствительности к АБП, поэтому его проводили сразу после идентификации H. influenzae.
Использовались бумажные диски, пропитанные хромогенным нитроцифи-ном (Oxoid, Великобритания), который образует продукт красного цвета при гидролизе под воздействием - лактамазы. Предварительно прогревали упаковку, внутри которой находился картридж с дисками, до комнатной температуры (25C). Увлажняли диск стерильной дистиллированной водой. Собирали несколько колоний исследуемого штамма и равномерно наносили их на поверхность диска. Появление красного цвета говорило о положительной реакции. Реакция считается отрицательной, если по истечении 30 мин окрашивания не произошло. Положительный результат теста на - лактамазную активность указывал на то, что штамм H. influenzae устойчив к пенициллину, ампициллину и амокси-циллину.
Характеристика выделенных штаммов
Амплификации проводили в 25 мкл смеси, состоящей из 12,5 мкл смеси для ПЦР РВ Platinum Quantitave PCR SuperMix – UDG (Qiagen, США), 0,2 М каждого праймера, 0,3 М зонда, 2 мкл ДНК, 0,5 мкл референтного красителя ROX (Qiagen, США), 4 мкл воды. Для улучшения амплификации был изменен температурный режим, амплификация проводилась при следующих условиях: 1 цикл: 950С - 15 мин; 45 циклов - 940С - 30 сек, 550С - 40 сек, 720С - 15 сек. Детекция сигнала проводилась при 550С. Амплификацию с детекцией накопления продуктов реакции в режиме реального времени производили с помощью амплифи-катора ABI 7500 (Applied Biosystems, США). Значение Ct 38 считалось положительным, а значение Ct 38 – отрицательным.
Наличие детекции генов pbp1a, pbp2x и pbp2b , свидетельствовало об отсутствии мутаций в специфичных участках, к которым были разработаны прай-меры, и штаммы считались генетически чувствительными к пенициллину (гПЧ). Если отсутствовала детекция одного или двух генов, штамм считался генетически промежуточно устойчивым к пенициллину (гППУ), если отсутствовала детекция всех трех генов, штамм считался генетически устойчивым к пенициллину (гПУ). Положительная детекция генов ermB и/или mefA, свидетельствовало о генетической устойчивости к макролидам.
Молекулярно-генетическое типирование штаммов N.meningitidis, H. influ-enzae и S. pneumoniae осуществляли методом МЛСТ. Последовательность прай-меров для амплификации и секвенирования генов «домашнего хозяйства» представлены в таблицах 7-9. Амплификацию генов «домашнего хозяйства» проводили в 25 мкл смеси: 2,5 мкл ПЦР буфера (10) (Fermentas, Латвия): 700 mM Трис-HCl, pH 8,6 / 25 oC, 166 mM (NH4)2SO; 2,5 мкл 25 mM MgCl2 (Fermentas, Латвия); 1 мкл 10mM dNTPs (Fermentas, Латвия) по 1 мкл 20mM прямого и обратного праймера, 0,5 мкл Taq– полимераза(Fermentas, Латвия), 2,5 мкл ДНК, вода для ПЦР – 18 мкл. Амплификацию фрагментов проводили на амплификаторе GeneAmp 2700 (Applied Biosystems, США).
При амплификации фрагментов генов «домашнего хозяйства» H. influenzae применяли следующие условия проведения реакции: 1 цикл: 95C – 15 мин., затем 35 циклов: 94C – 30 сек., 55C – 30 сек., 72C – 1 мин., 1 цикл: 72C – 2 мин., охлаждение до 4C с последующим хранением при 10C.
Для амплификации фрагментов генов «домашнего хозяйства» N. meningit-idis применяли следующие условия проведения реакции: 1 цикл: 95C – 15 мин., затем 35 циклов: 94C – 30 сек., 60C – 45 сек., 72C – 45 сек., 1 цикл: 72C – 2 мин., охлаждение до 4C с последующим хранением при 10C . Для гена pgm применялись следующие условия: 1 цикл: 95C – 15 мин., затем 35 циклов: 94C – 30 сек., 60C – 45 сек (с каждым циклом уменьшение температуры на 0,5C), 72C – 45 сек., 10 циклов: 94C – 30 сек., 50C – 45 сек., 72C – 45 сек., 1 цикл: 72C – 2 мин., охлаждение до 4C с последующим хранением при 10C.
Для амплификации фрагментов генов «домашнего хозяйства» S. pneu-moniae применяли следующие условия: 1 цикл: 95C – 15 мин., затем 35 циклов: 94C – 30 сек., 58C – 45сек., 72C – 1 мин., 1 цикл: 72C – 2 мин., охлаждение до 4C с последующим хранением при 10C. Контроль наработки фрагментов осуществляли в 2% агарозном геле, 5 мкл образца смешивали с 6 кратным буфером для загрузки и вносили в агарозный гель (0,5 мкг/мл ЭБР). Электрофорез проводили при 50 А, 100 В на 1 см2 в течение 30 минут (камера SE-2, Helicon, Россия; источник питания Powerpac Basic Power Supply, BioRad, США). Продукты амплификации визуализировали на трансиллюминаторе ECX-20L (Vilber Lourmat, Германия).
Определение нуклеотидной последовательности фрагментов проводили на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) с использованием набора реагентов для секвенирования BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США), согласно рекомендациям производителя. Исследования проводились на базе ЗАО «ПИННИ» («Постгеном ные и нанотехнологические инновации», CJSC «PYNNY» Инновационного центра медицинских нанобиотехнологий ГУ НИИ физико-химической медицины МЗ РФ, г. Москва). Результаты секвенирования, полученные в формате хроматограммы, обрабатывали в программе CromasLite, секвенированные последовательности со поставляли с международной on-line базой MLST (http://pubmlst.org). Выравнива ние последовательностей проводилось с помощью сервиса BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=bl ast2seq&LINK_LOC=align2seq). Построение филогенетической дендограммы осуществляли методом присоединённых соседей (Neigbor joining –NJ) с исполь зованием программного обеспечения MEGA 5.0 [171].
Анализ антибиотикочувствительности штаммов N. meningitidis
Вакцины являются основным инструментом для профилактики бактериальных менингитов и борьбы с ними [182]. Большинство вакцин против основных возбудителей ГБМ сконструированы на основе капсулярных полисахаридов. Однако бактериальные полисахаридные антигены относятся к разряду Т-независимых антигенов, которые слабо работают у детей до 2-х лет. Для усиления иммуногенности Т-независимых антигенов их конъюгируют с Т-независимыми носителями, в роли которых может выступать столбнячный или дифтерийный анатоксин [36]. Для профилактики инфекций, вызванных S. pneumoniae, существуют по-лисахаридные конъюгированные вакцины, которые были внедрены в практику во многих промышленно развитых странах, что обусловило резкое снижение заболеваемости пневмококковым менингитом у детей грудного и раннего возраста, а также у взрослых за счет индуцирования коллективного иммунитета [46, 102]. В настоящее время разработаны 7-валентная вакцина «Превенар 7» (Вайет, США), включающая полисахариды серотипов 4, 6B, 9V 14, 18C, 19F, 23F; 10-валентная вакцина «Синфлорикс» (ГлаксоСмитКляйн, Бельгия), включающая полисахариды серотипов 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V 14, 18C, 19F , 23F) и 13-валентная пневмококковая конъюгированные вакцина «Превенар 13» (Вайет, США), включающая полисахариды серотипов 1, 3, 4, 5,6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F , 23F. [67, 97]. Существует так же 23-валентная полисахаридная вакцина «Пневмо 23» (Санофи Пастер, Франция). Однако данная вакцина не обладает эффективностью у детей моложе двух лет, то есть в группе, подверженной наибольшему риску заболеваемости менингитом, вызванным S. pneumoniae [102, 182] . Применяется эта вакцина для защиты детей старше 2-х лет, входящих в зону риска [36].
Вакцины против N. meningitidis, в состав которых входят капсульные полисахариды используются с начала 1970-х годов. В их число входит двухвалентная (против серогрупп A и C), трехвалентная (A, C, Y), и четырехвалентная вакцины (A, C, W135 и Y) [180, 182]. На территории Российской Федерации зарегистрированы следующие конъюгированные менингококковые вакцины, которые могут использоваться с 3-х месяцев: «Менинго А+С» (Санофи Пастер, Франция), «Менцевакс ACWY» (ГлаксоСмитКляйн, Бельгия). Имеются трудности в разработке вакцины на основе полисахарида против серогруппы В, так как гомополи-мер полисахаридной капсулы идентичен гомополимеру нервных клеток человека, что может вызвать различные аутоиммунные реакции [188]. Однако 29 мая 2013 года в Италии (Милан) была представлена мультикомпанентная вакцина для борьбы с менингококком группы B «Bexsero» (Новартис). Данная вакцина содержит 4 антигена – фактор Н связывающий белок (fHbp), нейссерия адгезин А (Na-dA), нейссерия гепарин связывающий антиген (NHBA), порин (PorA) серосубтип Р1.4. Данная вакцина может применяться у детей с 2-х месяцев, однако, она еще не зарегистрирована не в одной из стран СНГ, не в Российской Федерации[125] .
Для детей раннего возраста уже существуют полисахаридная белковая конъюгированная Hib-вакцина [181]. В большинстве промышленно развитых стран эта вакцина позволила резко снизить заболеваемость Hib-менингитом и, в сущности, элиминировать данное заболевание как проблему общественного здравоохранения посредством прямого воздействия и формирования коллективного иммунитета [180, 181]. В последнее время многие развивающиеся страны уже внедрили или планируют внедрить Hib-вакцины путем введения ее в календарь прививок [182]. На территории Российской Федерации зарегистрированы следующие Hib конъюгированные вакцины: «Акт-Хиб» (Санофи Пастер, Франция) включает полисахарид конъюгированный со столбнячным анатоксином и «Хибе-рикс» (ГлаксоСмитКляйн, Бельгия) [36].
Своевременно проводимые массовые кампании вакцинации с использованием полисахаридных конъюгированных вакцин, могут успешно прерывать распространение эпидемий менингитов, так как конъюгированные вакцины, как правило, формируют более напряженный иммунитет, более длительную иммунную защиту, защиту у детей моложе 2 лет и могут разорвать цепь носительства и передачи инфекции, обеспечивая выработку коллективного иммунитета [120].
Мультилокусное сиквенс-типирование штаммов N.meningitidis
Азиатского региона и Ближнего Востока [180,181]. Циркуляция этой серогруппы так же может свидетельствовать о наличие врожденного дефицита терминальных компонентов комплимента или резко пониженную резистентность к менингококковой инфекции у детей [44]. Таким образом, встречаемость этой «редкой» серогруппы менингококка для Европейского региона, можно объяснить как отклонениями в иммунологическом статусе пациентов, так и повышенной миграций людей из стран, в которых данная серогруппа является лидирующей.
Исследования образцов, в которых был детектирован ген lytA, с использованием метода мПЦР, позволило определить серологический пейзаж распределения S.pneumoniae. Наблюдалось следующее распределение по серотипам: серогруппа 6 (6A/B/C) – 30,3% (n=23), 14 - 13,3% (n=10), 23F - 9,3% (n=7), 19F - 5,4%(n=4), 1 - 2,7% (n=2) , 4 - 2,7% (n=2) и по 1,3%(n=1) приходилось на следующий каждый серотип: 2, 3 , 7 A/F, 8, 9V/A, 11 A/D, 17F, 15B/C, 18(18 A/B/C), 26% (n=20) были нетипируемые (NT). Таким образом, лидирующим серотипом среди S.pneumoniae в нашем исследовании была серогруппа 6. Данные распределения серотипов S.pneumoniae в станах СНГ отличается от распределения сероти-пов выделенных из СМЖ детей больных ГБМ в России. Так, в Москве, на Среднем Урале, в Свердловской области лидирующими серотипами являются: 3, 1, 19F, 19А , 7F, 11A/D, серогруппа 6, 15A/B, 4, 18С [5, 6, 10, 19]. В то же время, среди серотипов S.pneumoniae,выделенных со слизистой носоглотки здоровых детей в возрасте от 6 месяцев до 5 лет на Украине, доминировали серотипы 19F, 6A/В, 14 и 23F [16]. Следовательно, необходимы дальнейшие исследования не только штаммов вызывающих пневмококковый гнойный менингит, но и «неинва-зивных» штаммов, который могут быть источниками инвазивных заболеваний.
Из образцов СМЖ было выделено 33 клинических штамма, которые были исследованы с помощью бактериологического метода, биохимических методов и метода полимеразной цепной реакции в реальном времени. Было установлено, что 13 штаммов принадлежали к S.pneumoniae, 9 штаммов были определены как N.meningitidis, 11 штаммов - H.influenzae. С использованием серологиче ского метода, метода ПЦР РВ и метода мультиплексной ПЦР были определены серотипы выделенных этих штаммов. Серологический пейзаж выделенных штам мов был следующий: S.pneumoniae: 6A – 23% (n=3), 19F – 16% (n=2), 18F - 7,5% (n=1), 4 - 7,5% (n=1), 20 - 7,5% (n=1), 7,5% (n=1), 14 – 7,5% (n=1), 7B - 7,5% (n=1), 23F - 7,5% (n=1). N.meningitidis: B - 67% (n=6), W135 – 22% (n=2), C 11% (n=1), H. influenzae b – 100% (n=11). Сопоставление полученных данных при видовом определении штаммов методом ПЦР в реальном времени с бактериоло гическим и биохимическим методом, показало 100% совпадений. Также 100% совпадений наблюдалось при определении серогрупп N.meningitidis и серотипов H.infuenzae серологическим методом и методом ПЦР РВ. При сопоставлении данных полученных при серотипировании S.pneumoniae серологическим мето дом и методом мПЦР выяснилось, что из-за высокой гомологии генов кодиру ющих синтез капсулы, на данный момент остаются неразличимы на отдельные серотипы следующие серогруппы: 6A/B, 7А/F, 9V/A, 18A/B/C. Таким образом, для штаммов этих серогрупп методом мультиплексной ПЦР возможно опреде лить только групповую принадлежность, а определение отдельного серотипа воз можно с использованием серологического метода, к которым относится метод набухания капсулы. Однако интерпретация результатов данного метода, явля ется субъективной и требует высокой квалификации исследователя, кроме того, поликлональные антисыворотки имеют высокую стоимость, не могут длительно храниться, и не всегда доступны для лабораторий. Таким образом, целесооб разно использовать для определения серотипов и серогрупп штаммов S.pneumoniae метод мПЦР в лаборатории, при отсутствии специфических ан тисывороток и в качестве экспресс-метода.
Данные, полученные при исследовании СМЖ методом ПЦР РВ и бактериологическим методом, показали следующее: бактериологическим методом определили 11 штаммов H. influenzae, 9 штаммов N.meningitidis 13 штаммов S. pneumoniae, тогда как методом ПЦР РВ было выявлено 43 образца H.influenzae, 148 - N. meningitidis, 76 образцов - S.pneumoniae. Таким образом, использование молекулярных методов для детекции возбудителей ГБМ и определения их серо 88 типов/серогрупп, необходимо проводить параллельно с бактериологическими и серологическими методами. При использовании молекулярных методов определения основных патогенов вызывающих ГБМ в СМЖ уменьшается время определения, по сравнению с бактериологическими методами, что порой является необходимым при принятии решения о начале лечения пациента. Так же, использование методов ПЦР РВ, мПЦР позволяет определить более точную картину, циркуляции ведущих возбудителей, распределения циркулирующих серотипов, что является необходимым для эпидемиологического контроля и принятия решения о введении вакцин против возбудителей гнойных бактериальных менингитов в основной календарь прививок.
Анализ антибиотикорезистентности штаммов S.pneumoniae показал, что среди исследуемых штаммов 30,7% (n=4) имели резистентность к пенициллину, у 30,7% исследуемых штаммов была умеренная чувствительность к ванкомицину, 69,2% (n=9) исследуемых штаммов были устойчивы к сульфаметоксазо-лу/триметропиму. Антибиотикорезистентность к пенициллину у штаммов S.pneumoniae связана с наличием изменений в генах кодирующими пенициллин связывающие белки (ПСБ). Наиболее выраженное снижение чувствительности клинических штаммов к бета-лактамам ассоциируется с мутационными изменениями в генах pbp1a, pbp2x и pbp2b, кодирующих соответственно белки PBP1a, PBP2x и PBP2b [69,170]. Несмотря на то, что в каждом из этих генов может быть множество мутаций, многие исследователи, связывают резистентность к пенициллину пневмококков с изменениями в консервативной аминокислотной последовательности серин-треонин-метионин-лизин (Serhr-Met-Lys) в гене pbp1, се-рин-серин-аспарагин (Ser-Ser-Asn) в гене pbp2b, лизин-серин-глицин (Lys-Ser-Gly) в гене pbp2x [50, 69, 92, 170]. В нашем исследовании были использованы прайме-ры и зонды, которые были разработаны к консервативным участкам генов pbp1a, pbp2x и pbp2b [69].
