Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 22
1.1 Инфекции в гинекологии, акушерстве и неонатологии 22
1.1.1 Современные проблемы инфекционного контроля в акушерско-гинекологической и неонатальной службе 22
1.1.2 Эволюционные аспекты изменчивости микроорганизмов 23
1.1.3 Инфекции в гинекологии и акушерстве: от нормы к патологии 25
1.1.4 Инфекции в неонатологии 35
1.2 Современная микробиологическая диагностика оппортунистических инфекций с применением инновационных технологий 42
1.2.1 Культуральная диагностика оппортунистических инфекций 42
1.2.2 Роль молекулярно-биологических методов в диагностике оппортунистических инфекций 44
1.2.3 Масс-спектрометрический анализ в микробиологии 50
1.2.3.1 Развитие масс-спектрометрии в идентификации микроорганизмов 50
1.2.3.2 MALDI–TOF–MS для идентификации грамотрицательных и грамположительных бактерий 59
1.2.3.3 MALDI–TOF–MS для идентификации трудноидентифицируемых бактерий 64
1.2.3.4 MALDI–TOF–MS для идентификации дрожжевых грибов 65
1.2.3.5 MALDI–TOF–MS для определения антибиотикорезистентности и типирования бактерий 68
1.2.4 Прямая индикация микроорганизмов в биологических жидкостях 70
1.2.4.1 Метод проточной уроцитофлюориметрии для диагностики бактериурии 70
1.2.4.2 MALDI–TOF–MS для прямой индикации микроорганизмов в моче и крови 72
1.2.5 Перспективы комплексного внедрения новых технологий в рутинную практику для решения задач «быстрой микробиологии» 75
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 77
2.1 Клинический материал и общий объем проведенных исследований 77
2.2 Бактериологические методы 81
2.3 Протеометрические методы 85
2.3.1 Видовая идентификация методом MALDI–TOF–MS анализа выделенных при посеве микроорганизмов 85
2.3.2 Прямая индикация микроорганизмов в клиническом материале методом MALDI–TOF–MS анализа 88
2.4 Молекулярно-биологические методы 89
2.4.1 Метод ПЦР в диагностике состояния микроценоза влагалища 89
2.4.2 Молекулярно-генетическое типирование микроорганизмов 91
2.5 Уроцитофлуориметрический метод анализа мочи 92
2.6 Статистическая обработка данных 93
ГЛАВА 3. Изучение диагностической возможности метода MALDI–TOF–MS анализа при идентификации и штаммовой дифференциации микроорганизмов 96
3.1 Оптимизация технологии проведения MALDI–TOF–MS анализа бактерий 96
3.1.1 Оптимизация технологии MALDI–TOF–MS анализа нейссерий и изучение возможности их штаммового типирования 96
3.1.2 Оптимизация технологии MALDI–TOF–MS анализа стафилококков и изучение возможности их штаммового типирования 102
3.1.3 Оптимизация технологии MALDI–TOF–MS анализа лактобацилл 108
3.2 Оптимизация технологии MALDI–TOF–MS анализа дрожжевых грибов...111
ГЛАВА 4. Оценка диагностической значимости MALDI–TOF–MS в сравнении
с традицонными бактериологическими и молекулярно-генетическими методами 118
4.1 Оценка достоверности видовой идентификации грамположительных бактерий 118
4.2 Оценка достоверности видовой идентификации грамотрицательных бактерий 130
4.3 Оценка достоверности видовой идентификации трудноидентифицируемых (в том числе строгих анаэробных) бактерий 139
4.4 Оценка достоверности видовой идентификации дрожжевых грибов 150
ГЛАВА 5. Разработка технологии прямого MALDI–TOF–MS анализа микроорганизмов в клиническом материале (моча, кровь) и оценка возможности ее применения при скрининге бактериурии и бактериемии 158
5.1 Разработка и усовершенствование технологии прямого масс-спектрометрического профилирования микроорганизмов в моче и оптимизация диагностики бактериурии 158
5.2 Разработка и усовершенствование технологии прямого масс -спектрометрического профилирования микроорганизмов в гемокультуре и оптимизация диагностики бактериемии 167
ГЛАВА 6. Изучение особенностей микроценозов у беременных и новорожднных в норме и патологии с использованием инновационных методов 174
6.1 Результаты изучения состояния микроценоза влагалища беременных женщин на основе комплексной микробиологической (культуральной, протеометрической и молекулярно-генетической) оценки 174
6.2 Результаты выявления различными микробиологическими методами особенностей микробной колонизации и этиологии ИВЗ у новорожднных,
находящихся на выхаживании в стационаре 187
ГЛАВА 7. Разработка диагностического алгоритма микробиологического обследования беременных и новорожднных с применением инновационных технологий 200
7.1 Разработка методологических подходов к созданию диагностических панелей для быстрой идентификации возбудителей внебольничных и внутрибольничных инфекций 200
7.2 Разработка оптимального алгоритма микробиологического обследования
беременных женщин 213
7.3 Определение наиболее эффективного метода микробиологического мониторинга в неонатальных стационарах 216
Обсуждение результатов 220
Выводы 242
Практические рекомендации 244
Приложения 245
Список литературы 254
- Современные проблемы инфекционного контроля в акушерско-гинекологической и неонатальной службе
- Видовая идентификация методом MALDI–TOF–MS анализа выделенных при посеве микроорганизмов
- Оптимизация технологии MALDI–TOF–MS анализа нейссерий и изучение возможности их штаммового типирования
- Разработка и усовершенствование технологии прямого масс -спектрометрического профилирования микроорганизмов в гемокультуре и оптимизация диагностики бактериемии
Введение к работе
Актуальность проблемы. Streptococcus pneumoniae является одним из основных возбудителей менингита, острого среднего отита, риносинусита, внебольничной пневмонии в различных возрастных группах населения. Особую опасность пневмококковая инфекция представляет для детей первых лет жизни, пожилых людей и лиц с хроническими патологиями. Известно, что частота пневмококковой колонизации достигает пика к 2-3 годам. Новорожденные дети получают от матери антитела к пневмококкам многих серотипов, дающие определенную степень защиты от инфицирования. По мере снижения уровня материнских антител заболеваемость пневмококковой инфекцией взрывоподобно повышается со 2-го полугодия жизни ребенка [Платонов, 2006, Сидоренко, 2010].
Ежегодно в мире от пневмонии, вызванной S. pneumoniae, умирает 1 млн. детей младше 5 лет. В развивающихся странах пневмококковые инфекции вызывают до 11 млн. летальных исходов в год [Feikin, 2002].
По экспертным оценкам в России ежегодно пневмококковой септицемией заболевает около 9000 детей, пневмококковой пневмонией – около 85000 детей, отитами пневмококковой этиологии - свыше 713000 детей в возрасте до 5 лет [Mayanskiy, 2013]. Согласно данным Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, заболеваемость пневмониями в 2012 г. среди детей от 0 до 17 лет составила 168718 случаев или 639,5 на 100000 населения, при этом до 34,5% пневмоний приходится на долю детей в возрасте до 2 лет, максимальный уровень заболеваемости отмечен в возрасте 6-11 мес. и 12-23 мес. Следует отметить, что регистрируются далеко не все случаи пневмоний из-за дефектов и трудностей этиологической диагностики.
Исходя из химического строения и антигенных свойств полисахаридной капсулы пневмококков выделяют 46 серогрупп и более 90 серотипов, число которых постоянно увеличивается. Полисахаридная капсула является главным фактором вирулентности микроорганизма. Во многих исследования было показано, что она во время инфекции способствует нарушению фагоцитоза пневмококков полиморфноядерными лейкоцитами [Bentley, 2006].
Важнейшими в медицинском отношении особенностями разных серо-
групп пневмококков являются их различная территориальная распространенность, а также степень вирулентности для отдельных возрастных и социально-этнических групп населения. Не все серотипы являются одинаково патогенными, и большинство пневмококковых инфекций связаны с ограниченным числом серотипов. Спектр превалирующих капсульных типов меняется в зависимости от возраста и географического региона, хотя общие серотипы постоянно обнаруживаются во всех странах мира [McIntosh, 2011]. В мировых масштабах на долю примерно 20 серотипов приходится более 80% случаев инвазивных пневмококковых инфекций во всех возрастных группах; 13 наиболее часто встречающихся серотипов ответственны не менее чем за 70-75% случаев инвазивной инфекции у детей.
Еще одна биологическая особенность пневмококков, имеющая важное медицинское значение - наличие корреляции между серогрупповой принадлежностью, устойчивостью к антибиотикам и патогенным потенциалом, т. е. способностью колонизировать носоглотку, вызывать локальную или инвазивную инфекцию.
Во всем мире вызывает тревогу ежегодно увеличивающийся объем назначаемых антибиотиков, и, как следствие - распространение отдельных серотипов, характеризующихся множественной лекарственной резистентностью. При этом предупреждение распространения устойчивости к антибиотикам среди штаммов пневмококков, выделяемых от больных или носителей, затруднено [Klugman, 1990, Syrjanen, 2001].
Поэтому специфическая профилактика, основанная на использовании вакцин, в состав которых входят наиболее актуальные серотипы пневмококка, способствует не только снижению заболеваемости, но и ограничению циркуляции устойчивых к антибиотикам пневмококков.
В современных условиях для профилактики инфекций, вызванных
S. pneumoniae, в мире применяют вакцины двух типов – полисахаридную вакцину (в состав входят 23 серотипа) и 3 конъюгированные вакцины (7–, 10– и 13–валентную конъюгированную вакцину (ПКВ7, ПКВ10 и ПКВ13) [McIntosh, 2011]. Конъюгированные вакцины различаются количеством серотипов пневмококка, белком-конъюгатом и количеством полисахарида для каждого конъюгата. Во многих странах, в том числе и в России, полисахаридная вакцина рекомендуется для вакцинации лиц старше 65 лет и для лиц от 2 до 64 лет с повышенным риском развития пневмококковых инфекций. Основным недостатком полисахаридной вакцины является ее низкая эффективность среди детей первых 2 лет, так как капсульный полисахарид является тимус-независимым антигеном, не формирует иммунологической памяти и практически не иммуногенен для детей первых лет жизни. Поэтому в настоящее время используют так называемые конъюгированные пневмококковые вакцины (ПКВ), в которых типоспецифический полисахарид соединен с белковым носителем (дифтерийным или столбнячным анатоксинами, протективными белками других патогенов) [Костюкова Н.Н., Бехало В.А., 2014]. C 1 января 2014 года предусмотрено включение вакцинации против пневмококка в Национальный календарь прививок Российской Федерации.
Исследования, проведенные во многих странах мира, показали, эпидемиологическую эффективность массового применения ПКВ7 вакцины для профилактики инвазивных пневмококковых инфекций у детей младше 5 лет. Одновременно с этим существенно снизился и уровень носительства
S. pneumoniae, что способствовало снижению заболеваемости пневмококковой инфекцией у не привитых детей и взрослых [Макинтош, Е.Д. 2009].
Вместе с тем, на фоне снижения заболеваемости инфекциями, вызываемыми «вакцинными» серотипами, отмечается возрастание роли «невакцинных» серотипов [Huang, 2009, Jefferies, 2010].
Таким образом, постоянное появление новых серогрупп пневмококков, замещение существующих серотипов в условиях широкомасштабной вакцинопрофилактики определяют актуальность постоянного надзора, позволяющего своевременно выявлять изменение состава серотипов и устойчивости к антибиотикам у пневмококков.
Цел работы - изучить серотипы и антибиотикорезистентность клинических и назофарингеальных штаммов S. pneumoniae, выделенных у детей в возрасте до 5 лет в различных регионах России, для усовершенствования подходов к эмпирической и этиотропной терапии пневмококковой инфекции и к оптимизации специфической профилактики пневмококковой инфекции.
Задачи исследования:
-
Создать коллекцию клинических и назофарингеальных штаммов пневмококков, циркулирующих в различных регионах России за период с 2004 по 2013гг., у детей в возрасте до 5 лет, для выявления распространенности серотипов и антибиотикорезистентности штаммов S. pneumoniae.
-
Провести серологическое и молекулярное типирование штаммов S. pneumoniae и выявить доминирующие изоляты, циркулирующие у детей в возрасте до 5 лет в различных регионах России.
-
Провести оценку чувствительности штаммов пневмококка с целью выявления потенциальной связи между серотипом и уровнем резистентности.
-
Оценить соответствие серотипов S. pneumoniae, входящих в состав зарегистрированных в РФ 7-, 10- и 13- валентных конъюгированных вакцин, с серотипами пневмококков, циркулирующих в различных регионах России у детей-носителей и у детей с инвазивными и неинвазивными формами пневмококковой инфекции.
Научная новизна.
В представленной работе впервые:
-
Определены ведущие серотипы пневмококка, циркулирующие у здоровых детей и детей с инвазивными и неинвазивными формами пневмококковых инфекций, в возрасте до 5 лет в 18 городах Российской Федерации и входящие в состав пневмококковых вакцин.
-
Установлено, что большинство вакцинных серотипов пневмококков, выделенных у детей в возрасте до 5 лет, были выявлены у штаммов, характеризующихся антибиотикоустойчивостью к пенициллину, эритромицину, клиндамицину, тетрациклину и ко-тримоксазолу (триметоприму/сульфаметоксазолу).
3. Выявлено соответствие серотипов изученных штаммов пневмококка с серотипами, входящими в состав 7-, 10-, 13- валентных конъюгированных пневмококковых вакцин, что обосновывает целесообразность вакцинопрофилактики пневмококковой инфекции.
Практическая значимость результатов
Результаты исследования позволили выявить распространение серотипов и чувствительность к антимикробным препаратам штаммов S. pneumoniae, циркулирующих у детей в возрасте до 5 лет на территории РФ, что позволяет сформировать рекомендации по оптимизации терапии и вакцинных препаратов для специфической профилактики пневмококковых инфекций.
Использование в работе методов серологического типирования групповыми диагностическими сыворотками и молекулярного типирования методом ПЦР, позволяет выявлять все серотипы, включенные в пневмококковые вакцины, а также, невакцинальные серотипы, встречающиеся на территории РФ.
Внедрение результатов работы в практику.
Результаты исследований были использованы как рекомендации при принятии Федерального закона о включении в национальный календарь профилактических прививок конъюгированных пневмококковых вакцин для иммунизации детей с 7 до 9 месяцев на территории Российской Федерации (Федеральный закон от 21.12. 2013г. №368 (О внесении изменений в ст.9 Федерального закона «Об иммунопрофилактике инфекционных болезней»).
Результаты исследований нашли отражение в методических рекомендациях: «Резистентность пневмотропных микроорганизмов в Хабаровском крае и алгоритм антимикробной терапии внебольничных пневмоний у детей» (Хабаровск, 2011), утвержденных Министерством здравоохранения Хабаровского края, ХФ ДНЦ ФПД СО РАМ НИИ ОМИД.
Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры микробиологии, клинической фармакологии, кафедры госпитальной педиатрии с курсом неонаталогии ФПК и ППС ГБОУ ВПО СГМА Минздрава России, лаборатории ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора и используются в программах циклов повышения квалификации врачей – бактериологов и семинарах для практических врачей, проводимых в НИИ антимикробной химиотерапии ГБОУ ВПО СГМА Минздрава России.
Схемы типирования пневмококков с использованием пуловых и групповых диагностических сывороток PNEUMOTEST-LATEX (StatensSerum Institut, Копенгаген, Дания) внедрены в практику работы микробиологической лаборатории НИИ антимикробной химиотерапии ГБОУ ВПО СГМА Минздрава России.
Связь работы с научными программами. Диссертация выполнена по плану НИР ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Минздрава России (№ гос. регистрации ВНТИЦ 01200951949).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. На территории РФ у детей-носителей и у детей с инвазивными и неинвазивными формами пневмококковых инфекций в возрасте до 5 лет, циркулируют «вакцинные» серотипы пневмококка, которые характеризуются известной высокой частотой распространенности штаммов резистентных к антибиотикам разных групп: пенициллину, эритромицину, клиндамицину, ко-тримоксазолу и тетрациклину.
2. Выявленная высокая степень корреляции серотипов S. pneumoniae, циркулирующих у детей, с серотипами, входящими в состав конъюгированных пневмококковых вакцин, позволяет рекомендовать их включение в календарь профилактических прививок Российской Федерации.
3. Пенициллины, макролиды и линкозамиды сохраняют высокую активность в отношении пневмококков и могут рассматриваться в качестве препаратов выбора для терапии пневмококковых инфекций различной локализации.
4. Использование комбинации методов серологического типирования групповыми диагностическими сыворотками и молекулярного типирования методом ПЦР позволяет выявлять все серотипы, включенные в 7-, 10- , 13- валентные конъюгированные вакцины, а также большинство, встречающихся на территории РФ невакцинальных серотипов.
Апробация работы. Результаты исследования представлены и обсуждены на заседаниях проблемной комиссии по иммунологии, иммуноморфологии и иммунопатофизиологии ГБОУ ВПО СГМА Минздрава России (Смоленск, 2011, 2013); XIX, XX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012, 2013); на XIII, XIV, XV Международном конгрессе по антимикробной терапии (Москва, 2011, 2012, 2013); на XXII Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2012); на VII национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2012); на межрегиональном саммите по проблеме пневмококковой инфекции (Киев, 2013); на совместном заседании сотрудников кафедр микробиологии, клинической фармакологии, инфекционных болезней с эпидемиологией, инфекционных болезней у детей, поликлинической педиатрии, факультетской терапии, ЦНИЛ, ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Смоленской области» и НИИАХ ГБОУ ВПО СГМА Минздрава России (Смоленск, 2012); 7 World Congress of the World Society for Pediatric Infectious Diseases (WSPID) (Melbourne, Australia, 2011); 52 Annual Meeting of the European Society for Paediatric Research (Great Britain, Newcastle, 2011); European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseaes (Berlin, Germany, 2013); апробация диссертации состоялась на совместном заседании сотрудников кафедр микробиологии, клинической фармакологии, биологии, инфекционных болезней с эпидемиологией, инфекционных болезней у детей, поликлинической педиатрии и НИИАХ ГБОУ ВПО СГМА Минздрава России (протокол № 19 от «27» сентября Смоленск, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, из них 2 - в рекомендованных ВАК журналах.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования (материалы и методы, результаты, обсуждение), выводы, практические рекомендации и список литературы. Работа иллюстрирована 12 рисунками и 15 таблицами. Список литературы состоит из 222 источников, из них 42 отечественных и 180 иностранных.
Современные проблемы инфекционного контроля в акушерско-гинекологической и неонатальной службе
Руководство, журнальные статьи, выступления на российских и международных конгрессах, патент, биопрепарат, диагностические тест-системы для научного и практического применения.
Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения.
Алгоритм обследования беременных женщин, усовершенствованный алгоритм микробиологического мониторинга в отделениях новорожднных используются в практической работе отдела микробиологии и клинической фармакологии ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России внедрены в работу научно-поликлинического и акушерско-гинекологических отделений, а также отдела неонатологии и педиатрии Центра. Материалы диссертации используются в лекционном материале при обучении на курсах повышения квалификации врачей, обучении клинических ординаторов и аспирантов, на семинарах и конференциях, проводимых в Центре и на сертификационных курсах повышения квалификации по специальности «Бактериология» НИИ антимикробной химиотерапии ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
«Руководство по лабораторной диагностике инфекций урогенитального тракта» (под ред. Домейка М. и др. / СПб.: Изд-во Н-Л, 2012г.) используется при диагностике инфекций урогенитального тракта в Российской Федерации.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: 15th International Pathogenic Neisseria Conference, North Queensland, Australia, 2006г. 12th IUSTI International Union against Sexually Transmitted infections World Congress, NewDelhi, India, 2011г. VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Рациональная фармакотерапия в Урологии 2012», Москва, Россия, февраль 2012г. Всероссийском конгрессе с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая практика в эпицентре женского здоровья», Москва, Россия, март 2012г. XVII научно-практической конференции «Интеграция в лабораторной медицине», Москва, Россия, март 2012г Всероссийском научно-практическом обществе эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, Россия, 2012г. 22rd European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, (ECCMID), London, United Kingdom, March-April 2012г. V научно-практической конференции «Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ», Москва, Россия, май 2012г ХIV Международном конгрессе межрегиональной ассоциации по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии (МАКМАХ/ESCMID), Москва, май 2012г. 18th Congress of the International Society for Human and Animal Mycology (ISHAM), Berlin, Germany, июнь 2012г. XIII Всероссийском научном форуме «Мать и Дитя», Москва, Россия, сентябрь 2012г. 13th Asia-Pacific Congress of Clinical Microbiology and Infection (APCCMI), Beijing, China, October 2012. Ученом совете ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия, ноябрь 2012г. V Научно-образовательном конгрессе «Анестезия и реанимация в акушерстве и неонатологии» (АРАН), Москва, Россия, ноябрь 2012г. II международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Казань, Россия, ноябрь 2012г. VII Международном конгрессе по репродуктивной медицине, Москва, Россия, январь 2013г 23rd ECCMID, Berlin, Germany, April 2013. XV международном конгрессе МАКМАХ/ESCMID, Москва, Россия, май 2013г. 28th International Congress of Chemotherapy and Infection (ICC 2013), Yokohama, Japan, June 2013. 24rd ECCMID, Barcelona, Spain, May 2014. XVI международном конгрессе МАКМАХ/ESCMID, Москва, Россия, май 2014г
Обсуждение диссертационной работы состоялось на межклинической конференции сотрудников Отдела микробиологии и клинической фармакологии, лаборатории молекулярно-генетических методов, клинико-диагностической лаборатории, Отдела неонатологии и педиатрии, поликлинического и акушерско-гинекологических отделений ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России 4 декабря 2013 года; заседании апробационной комиссии 16 декабря 2013 года и Ученом Совете ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России 14 января 2014 года.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 52 научные публикации, в том числе 29 работ в рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК РФ. Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, 7 глав, включающих обзор литературы, собственные исследования и их результаты, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы.
Работа изложена на 293 страницах машинописного текста, иллюстрирована 44 таблицами, 50 рисунками, 2 фотографиями и 7 приложениями. Указатель литературы состоит из 90 отечественных и 210 зарубежных источников.
Видовая идентификация методом MALDI–TOF–MS анализа выделенных при посеве микроорганизмов
С внедрением новых молекулярных технологий, появилась возможность исследовать микробное разнообразие в различных локусах организма. В последние годы исследователи применяют методы, основанные на анализе последовательности гена рибосомной РНК (16S рРНК), которые помогают исключить культивирование микроорганизмов и получать информацию непосредственно из образцов клинического материала. Филогенетический анализ полученных последовательностей обеспечивает классификацию микроорганизмов и является средством определения численно доминирующих видов в сообществах и изменениях в их составе [39, 186, 188].
При изучении вагинальных микробных сообществ более чем у 3000 здоровых женщин репродуктивного возраста в разных этнических группах, Zhou X. с соавторами [189] показали, что у 80% из них, во влагалищном отделяемом преобладают микроорганизмы рода Lactobacillus: L. iners, L. crispatus, L. jensenii или L. gasseri. В целом, L. iners был наиболее распространенным видом (66%) у женщин разных этнических групп. Остальная часть женщин (20%) имели низкое содержание лактобацилл на фоне высокого представительства анаэробных бактерий, таких как Atopobium, Clostridiales, Megasphaera, Dialister, Anaerococcus, Finegoldia, Peptostreptococcus и Eubacterium. Результаты этих исследований показывают, что существует ограниченное число различных видов вагинальных микробных сообществ у практически здоровых женщин [188].
Высокая стоимость метода секвенирования ограничивает количество выборок необходимых для анализа. Пионерами в решении этой проблемы стали Sogin M.L. с соавторами, которые использовали методы параллельного секвенирования ДНК и коротких гипервариабельных участков генов 16S рРНК, используя технологию пиросеквенирования [190]. В настоящее время Roche Applied Science производят и распространяют пиросеквенаторы, где более 1 млн. последовательностей ДНК могут быть прочитаны за один запуск прибора. Одномоментно, свыше 250 образцов анализируются методом параллельного секвенирования, единовременно исследуя 4000 последовательностей на один образец. Технология пиросеквенирования позволяет менее чем за 8 часов обеспечить информацией о наличии и видовой принадлежности микроорганизмов в биообразце [191, 192]. В результате изучения вагинальной микрофлоры 396 здоровых женщин Северной Америки, в равной мере представляющих четыре этнические группы (азиатская, белая, черная и испаноязычная) методом, основанном на пиросеквенировании генов 16S рРНК, выявлено 282 филотипа микроорганизмов, объединеных в пять групп, четыре из которых преобладали: L. iners, L. crispatus, L. gasseri или L. jensenii, а пятая была представлена в разных пропорциях строгими и факультативными анаэробами. Среди них бактерии рода Prevotella, Megasphaera, Sneathia, Atopobium, Dialister, Lachnospira, Anaerococcus, Peptoniphilus, Eggerthella, Finegoldia, Rhodobaca, Anaerotruncus, Corynebacterium, Ureaplasma, Mycoplasma, Aerococcus,
Parvimonas, Veillonella, Gemella, Mobiluncus, а также Streptococcus, Staphylococcus и G. vaginalis [191]. В исследование включены небеременные женщины репродуктивного возраста от 12 до 45 лет, с регулярным менструальным циклом и сексуальной активностью, не принимавшие антимикробные препараты в течение последних тридцати дней. В результате отмечены некоторые различия между этническими группами и типом микробных сообществ. Вагинальное бактериальное сообщество с преобладанием видов Lactobacillus (группы I, II, III и V) обнаружено у 80,2% и 89,7% азиатских и белых женщин, соответственно, но, только у 59,6% и 61,9% испаноязычных и черных женщин [191]. Из этих данных можно сделать заключение, что вагинальное бактериальное сообщество с доминированием Lactobacillus является общим, но существующие некоторые различия в видовых соотношениях требуют дальнейшего изучения [50, 192, 193].
Хотя, по сравнению с традиционными методами идентификации молекулярные методы, в особенности метод секвенирования генов рРНК достаточно надежны, значительно сокращают сроки обнаружения этиологического агента, но все же исследования продолжают оставаться дорогими, требуют специализированного оборудования, отдельных помещений для лаборатории и обученный персонал. Эти факторы в целом являются лимитом для рутинного применения молекулярных методов диагностики, делают их непрактичными в большинстве некрупных лабораторий и больниц [25, 194, 195].
Принимая во внимание скорость развития инфекционного процесса, в особенности у новорожднных детей, становится очевидным значимость использования методов экспресс-диагностики, спектр которых существенно расширен в настоящее время [194]. В частности, при раннем выявлении инфекций большое значение придается серологической диагностике, прежде всего, в выявлении вирусных инфекций, в то время как их использование не всегда бывает достаточным для обнаружения бактериальных микроорганизмов [27, 195 - 199].
На сегодняшний день в России нет стандартизованных, оцененных путем проведения клинических испытаний, коммерчески доступных тест-систем, пригодных для комплексного обнаружения нуклеиновых кислот микроорганизмов в образцах крови, как у взрослых, так и у новорожденных детей [27].
Оптимизация технологии MALDI–TOF–MS анализа нейссерий и изучение возможности их штаммового типирования
Важным моментом в развитии «быстрой микробиологии» является возможность метода MALDI–TOF–MS анализа проводить индикацию бактерий непосредственно в клиническом материале, что может оказаться неоценимым инструментом, например, в диагностике ИМП при которых имеется микробная колонизация мочи (бактериурия) [88, 275].
Для выявления бактериурии, наряду с микроскопией осадка мочи, применяют различные методы быстрой диагностики, так называемые скрининг-тесты: тест восстановления трифенилтетразолия хлорида (ТТХ-тест); тест на определение эстеразы лейкоцитов; dipstick test и др. Следует отметить, что чувствительность скрининг-тестов для диагностики бактериурии невысокая, поэтому их необходимо подтверждать культуральным исследованием. Посев мочи, на сегодняшний день считается «золотым стандартом», так как является наиболее информативным способом диагностики бактериурии. Этот метод является количественным, позволяет определить степень бактериурии, этиологического агента, однако на его выполнение требуется от 24 до 72 часов. При этом около 70% посевов мочи являются, как правило, отрицательными, а расходы на ненужные исследования достаточно высоки [94, 276, 277].
С начала XXI столетия в бактериологических лабораториях Европы и России для диагностики бактериурии стали использовать принципиально новый метод быстрого выявления и идентификации бактерий в моче – технологию полупроводникового диодного лазера, позволяющую идентифицировать и подсчитывать флюоресцентно-меченные частицы в жидких средах – проточную уроцитофлюориметрию [278, 279].
На этом принципе работает автоматический анализатор осадка мочи UF 500i (1000i) (Sysmex corp., Япония), определящий такие показатели, как: эритроциты, лейкоциты, эпителиальные клетки, цилиндры, кристаллы, бактерии с ориентировочным разделением на грамотрицательные, грамположительные бактерии и грибы [279]. Автоматические анализаторы UF-500i (1000i) в настоящее время широко используются для скрининга бактериурии и быстрого выявления отрицательных образцов, информация о которых может быть незамедлительно сообщена клиницистам. Положительные образцы, выявленные при скрининге, отправляются на посев для подсчета колоний и дальнейшей идентификации микроорганизмов [278 - 281].
Использование анализаторов способных в кратчайшие сроки распознать бактериурию, неуклонно растет, и такие устройства, как UF-500i (1000i) сейчас являются необходимым ресурсом лабораторий в крупных лечебно-диагностических центрах. Специфичность этих устройств, как правило, невысока, однако пробы с отсутствием бактерий и лейкоцитов могут быть исключены из дальнейшего анализа, что позволит значительно сэкономить ресурсы лаборатории [280, 281].
Ранее проведенные исследования показали неоднозначные результаты применения проточных уроцитофлюориметров UF-500i (1000i) для диагностики бактериурии. К примеру, по результатам применения UF-1000i на 181 образце мочи Н.А. Маянский с соавторами [279] показали целесообразность включения в процесс скрининга бактериурии данной методики, тогда как исследования Maarten A.C. Broeren [279] на 1577 образцах, не гарантируют правильность результатов UF-1000i при использовании его в качестве скринингового анализатора. Jie Wang с соавторами [281] при проведении скрининга 313 образцов мочи на UF-1000i показали достаточно высокую чувствительность (97%) и специфичность (79%) метода. Прогностическая ценность отрицательного результата составила 99%, а точность 85%. Прогностическая ценность отрицательного результата оставалась высокой даже в случаях сложных образцов. Разноречивость полученных данных требует более тщательного изучения роли и места данного метода в диагностике ИМП. 1.2.4.2. MALDI–TOF–MS для прямой индикации микроорганизмов в моче и крови
Проанализировав данные литературы по использованию метода MALDI– TOF–MS для прямой идентификации микроорганизмов в биологических жидкостях, мы видим, что пока отсутствуют единые методики и стандарты его использования, а полученные различными исследователями результаты не всегда сопоставимы. Наибольшая точность отмечена при наличии в пробе мочи монокультуры грамотрицательных бактерий и стафилококков в высоком титре (более 105КОЕ/мл) [277, 282 - 285].
Серьезной проблемой при получении положительных результатов методом MALDIOF-MS анализа непосредственно в клинических образцах является титр бактерий. Полученные отличия, по данным литературы, возможно, связаны с применением разных методик пробоподготовки мочи. Например, используются различные объемы и режимы центрифугирования [277, 282, 284]. Дальнейшее усовершенствование методологии, вероятно, повысит чувствительность анализа. Тем не менее, образцы мочи с количеством бактерий в титре 105КОЕ/мл почти всегда являются клинически значимыми, тогда как образцы с меньшим количеством бактерий могут быть незначимыми, так как могут являться результатом контаминации пробы, и в некоторых случаях (при титре 104КОЕ/мл и ниже) целый ряд анализов будут отмечены, как отрицательные [280, 281].
В связи с этим необходимы более тщательные исследования значений бактериурии с помощью традиционных методов на различных группах пациентов (новорожднных, беременных женщинах, в группах с хроническими ИМП). Особенно важны новые критерии оценки диагностической значимости бактериурии у пациентов разного возраста, пола, с наличием и отсутствием клинических проявлений болезней мочевыводящей системы, а также рекомендации по интерпретации результатов бактериологического анализа проб мочи, полученных различными способами.
В диагностике инфекций кровотока культуральный метод также остается пока "золотым стандартом", который, к сожалению, обладает невысокой чувствительностью, что может быть, в первую очередь, связано с оказанным влиянием на жизнеспособность микроорганизмов начальной антимикробной терапии, назначаемой врачами при первых же клинических подозрениях на развитие сепсиса [285].
Разработка и усовершенствование технологии прямого масс -спектрометрического профилирования микроорганизмов в гемокультуре и оптимизация диагностики бактериемии
На основании проведенного исследования нами было сделано следующее заключение: – Идентификация суточной культуры микроорганизмов рода Staphylococcus методом MALDI–TOF–MS анализа в 95,8% случаев получена с высокой степенью достоверности (score 2,0) и в 99,0% случаев совпадает с результатами идентификации биохимическими способами. – Методом MALDI–TOF–MS анализа получена неоднозначная идентификация микроорганизмов рода Streptococcus, при которой -гемолитические стрептококки в 90,0% случаев определяются как S. pneumoniae. Для подтверждения их видовой принадлежности необходимо использовать дополнительные биохимические и иммунологические тесты. Результаты тестирования методом MALDI–TOF–MS анализа -гемолитических видов – S. agalactiae и S. pyogenes получены с высокой степенью достоверности в 96,2% случаев и совпадают с биохимической и иммунологической идентификацией на 99,0%. – Определение микроорганизмов рода Enterococcus методом MALDI–TOF– MS анализа показало высокую достоверность результатов (в 97,5% случаев score 2,0) и высокую степень совпадений (99,0%) биохимической и масс-спектрометрической идентификации. – Идентификация методом MALDI–TOF–MS энтеробактерий в 98,4% случаев получена с высокими значениями score (2,0 и выше) и в 99,0% случаев совпадает с результатами биохимического тестирования. – Большинство штаммов НГОБ идентифицируются методом MALDI–TOF– MS с высоким значением score (93,6%). В 53,6% случаев результаты масс спектрометрической идентификации совпадали с биохимическим тестированием. Невысокий процент совпадений обусловлен отсутствием в базе данных VITEK2Compact некоторых видов, а также близкородственностью как генетического, так и белкового профилей данной группы микроорганизмов. – Ввиду отсутствия альтернативы быстрого определения разнообразных видов лактобацилл, коринебактерий, актиномицетов, строгих анаэробных и 157
редко встречающихся аэробных и факультативно-анаэробных бактерий метод MALDI–TOF–MS анализа может успешно использоваться для их видовой идентификации.
Преимуществами методики MALDI–TOF–MS анализа явилась высокая чувствительность (достаточно одной колонии на чашке Петри), быстрая и простая пробоподготовка (5-10 мин/образец с экстракцией и 1-3 мин/образец без экстракции), высокая скорость измерения (1 мин/образец), а также сравнительно низкая стоимость используемых реактивов и материалов, в особенности при использовании прямого нанесения колонии на мишень без предварительной экстракции.
MALDI–TOF–MS можно характеризовать как лучший современный метод видовой идентификации микроорганизмов (стафилококков, энтеробактерий, энтерококков, -гемолитических стрептококков, нейссерий, дрожжевых грибов, лактобацилл). В данном исследовании в подавляющем большинстве случаев результаты методом MALDI–TOF–MS совпадали с другими способами идентификации (биохимическим, молекулярно-генетическим и др.).
Метод MALDI–TOF–MS анализа значительно превосходит ранее использованные способы микробиологического тестирования с точки зрения скорости, стоимости и качества идентификации вышеуказанных групп микроорганизмов, что согласуется с данными зарубежных исследователей [24, 29, 31].
Разработка технологии прямого MALDI–TOF–MS анализа микроорганизмов в клиническом материале (моча, кровь) и оценка возможности ее применения при скрининге бактериурии и бактериемии 5.1 Разработка и усовершенствование технологии прямого масс-спектрометрического профилирования микроорганизмов в моче и оптимизация диагностики бактериурии
Для оптимизации диагностики бактериурии нами отработана технология прямой масс-спектрометрической индикации микроорганизмов в осадке мочи. При этом изучена возможность видовой идентификации микроорганизмов при различных степенях бактериурии.
Учитывая отсутствие на момент начала исследования стандартных протоколов пробоподготовки осадка мочи к MALDI–TOF–MS анализу, разработана собственная оригинальная методика пробоподготовки, включающая обработку образца и режимы центрифугирования.
Предварительно методика апробирована на опытных (модельных) образцах. Для этого в контейнер с 100 мл мочи здорового человека, у которого по предварительным результатам микроскопии осадка мочи отсутствовали бактерии, инокулировали 1 мл суспензии физиологического раствора, содержащего взвесь E. coli и получали разные концентрации бактерий в пробе мочи – 10х7, 10х6, 10х5, 10х4 КОЕ/мл. Один образец мочи без инокуляции бактерий использовали в качестве отрицательного контроля.
Пробоподготовку образца к масс-спектрометрическому исследованию проводили по следующему протоколу: – из контейнера отбирали 1,5-2 мл мочи, помещали в пластиковую центрифужную пробирку и центрифугировали на скорости 15000 об/мин в течение 20 минут для получения осадка; – к осадку добавляли 1 мл дистилированной воды и центрифугировали 10 минут, а вновь образовавшийся осадок ресуспендировали в 1 мл 80% этанола и центрифугировали ещ 10 минут; 159 – осадок растворяли в растворе, состоящем из 15 мкл деионизованной воды и 35 мкл муравьиной кислоты, добавляли 50 мкл ацетонитрила и полученный образец центрифугировали 2 минуты; – один микролитр надосадочной жидкости (супернатант) размещали на 3 ячейки стальной мишени и высушивали на воздухе при комнатной температуре, затем покрывали 1 мкл матрицы (см. «Материалы и методы»).
Далее проводили масс-спетрометрический анализ согласно обычному протоколу. Для каждого спектра собраны и проанализированы 600 лазерных выстрелов (100х6 лазерных выстрелов с разных позиций target spot). Для анализа полученных масс-спектров использовали программное обеспечение MALDI Biotyper 3.0 (Bruker Daltonics, Германия).
