Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 22
1.1 Инфекции в гинекологии, акушерстве и неонатологии 22
1.1.1 Современные проблемы инфекционного контроля в акушерско-гинекологической и неонатальной службе 22
1.1.2 Эволюционные аспекты изменчивости микроорганизмов 23
1.1.3 Инфекции в гинекологии и акушерстве: от нормы к патологии 25
1.1.4 Инфекции в неонатологии 35
1.2 Современная микробиологическая диагностика оппортунистических
инфекций с применением инновационных технологий 42
1.2.1 Культуральная диагностика оппортунистических инфекций 42
1.2.2 Роль молекулярно-биологических методов в диагностике оппортунистических инфекций 44
1.2.3 Масс-спектрометрический анализ в микробиологии 50
1.2.3.1 Развитие масс-спектрометрии в идентификации микроорганизмов 50
1.2.3.2 MALDI–TOF–MS для идентификации грамотрицательных и грамположительных бактерий 59
1.2.3.3 MALDI–TOF–MS для идентификации трудноидентифицируемых бактерий 64
1.2.3.4 MALDI–TOF–MS для идентификации дрожжевых грибов 65
1.2.3.5 MALDI–TOF–MS для определения антибиотикорезистентности и типирования бактерий 68
1.2.4 Прямая индикация микроорганизмов в биологических жидкостях 70
1.2.4.1 Метод проточной уроцитофлюориметрии для диагностики бактериурии 70
1.2.4.2 MALDI–TOF–MS для прямой индикации микроорганизмов в моче и крови 72
1.2.5 Перспективы комплексного внедрения новых технологий в рутиннуюz рактику для решения задач «быстрой микробиологии» 75
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 77
2.1 Клинический материал и общий объем проведенных исследований 77
2.2 Бактериологические методы 81
2.3 Протеометрические методы 85
2.3.1 Видовая идентификация методом MALDI–TOF–MS анализа выделенных при посеве микроорганизмов 85
2.3.2 Прямая индикация микроорганизмов в клиническом материале методом MALDI–TOF–MS анализа 88
2.4 Молекулярно-биологические методы 89
2.4.1 Метод ПЦР в диагностике состояния микроценоза влагалища 89
2.4.2 Молекулярно-генетическое типирование микроорганизмов 91
2.5 Уроцитофлуориметрический метод анализа мочи 92
2.6 Статистическая обработка данных 93
ГЛАВА 3. Изучение диагностической возможности метода MALDI–TOF–MS анализа при идентификации и штаммовой дифференциации микроорганизмов 96
3.1 Оптимизация технологии проведения MALDI–TOF–MS анализа
бактерий 96
3.1.1 Оптимизация технологии MALDI–TOF–MS анализа нейссерий и изучение возможности их штаммового типирования 96
3.1.2 Оптимизация технологии MALDI–TOF–MS анализа стафилококков и изучение возможности их штаммового типирования 102
3.1.3 Оптимизация технологии MALDI–TOF–MS анализа лактобацилл 108
3.2 Оптимизация технологии MALDI–TOF–MS анализа дрожжевых грибов...111
ГЛАВА 4. Оценка диагностической значимости MALDI–TOF–MS в сравнении
с традицонными бактериологическими и молекулярно-генетическими
методами 118
4.1 Оценка достоверности видовой идентификации грамположительных бактерий 118
4.2 Оценка достоверности видовой идентификации грамотрицательных бактерий 130
4.3 Оценка достоверности видовой идентификации трудноидентифицируемых (в том числе строгих анаэробных) бактерий 139
4.4 Оценка достоверности видовой идентификации дрожжевых грибов 150
ГЛАВА 5. Разработка технологии прямого MALDI–TOF–MS анализа микроорганизмов в клиническом материале (моча, кровь) и оценка возможности ее применения при скрининге бактериурии и бактериемии 158
5.1 Разработка и усовершенствование технологии прямого масс-спектрометрического профилирования микроорганизмов в моче и оптимизация диагностики бактериурии 158
5.2 Разработка и усовершенствование технологии прямого масс -спектрометрического профилирования микроорганизмов в гемокультуре и оптимизация диагностики бактериемии 167
ГЛАВА 6. Изучение особенностей микроценозов у беременных и новорожднных в норме и патологии с использованием инновационных методов 174
6.1 Результаты изучения состояния микроценоза влагалища беременных женщин на основе комплексной микробиологической (культуральной, протеометрической и молекулярно-генетической) оценки 174
6.2 Результаты выявления различными микробиологическими методами особенностей микробной колонизации и этиологии ИВЗ у новорожднных,
находящихся на выхаживании в стационаре 187
ГЛАВА 7. Разработка диагностического алгоритма микробиологического обследования беременных и новорожднных с применением инновационных технологий 200
7.1 Разработка методологических подходов к созданию диагностических панелей для быстрой идентификации возбудителей внебольничных и внутрибольничных инфекций 200
7.2 Разработка оптимального алгоритма микробиологического обследования беременных женщин 213
7.3 Определение наиболее эффективного метода микробиологического мониторинга в неонатальных стационарах 216
Обсуждение результатов 220
Выводы 242
Практические рекомендации 244
Приложения 245
Список литературы
- Эволюционные аспекты изменчивости микроорганизмов
- Видовая идентификация методом MALDI–TOF–MS анализа выделенных при посеве микроорганизмов
- Оптимизация технологии MALDI–TOF–MS анализа нейссерий и изучение возможности их штаммового типирования
- Разработка и усовершенствование технологии прямого масс -спектрометрического профилирования микроорганизмов в гемокультуре и оптимизация диагностики бактериемии
Введение к работе
Актуальность темы
Одной из актуальных проблем на сегодняшний день остаются стрептококковые инфекции, в частности, инфекции, вызванные стрептококком группы А. Различие полисахаридных антигенов позволяет разделить большинство стрептококков на 20 серогрупп (классификация по Лэнсфилд), отмечаемых заглавными латинскими буквами (А, В, С, Е, F…). В пределах серогруппы по типоспецифическому антигену можно выделить серотипы. В качестве типоспецифического антигена выступает М - белок. К настоящему времени у стрептококков группы А выявлено более 200 серотипов М-белка. [Брико Н. И., 2003; 2006]. В качестве типоспецифического белка выступает также и Т-белок. На основании Т- белка выделяют 20 серотипов стрептококка группы А (классификация по Ф. Гриффитс). М – белок является одним из основных факторов патогенности, препятствующий фагоцитозу. Антитела к белку М имеют типоспецифический характер. Известно, что ревматизм чаще всего возникает после инфицирования стрептококком М-типов 1,3, 5, 6, 18, а гломеруллонефрит после инфицирования стрептококком М – типов 17, 19, 24, 49, 1. По данным ВОЗ, в мире, тяжелыми заболеваниями, вызванными стрептококком группы А страдает 18,1 млн. человек, из них 15,6 млн. – ревматическими заболеваниями сердца [Лобзин Ю.В. и др., 2005; Брико Н.И. 2009; Покровский В.И. и др., 2010]. Ежегодно регистрируется 1,8 млн. новых случаев СГА- инфекции (умирает свыше 500 тыс. человек), свыше 111 млн. случаев стрептодермии и 616 млн. случаев фарингитов [Феклистов Л.В. и др., 2006; Крюкова С.В и др., 2007; Гаращенко Т.И. и др., 2007; Ершова М.И. и др., 2007; Зубкова М.Н., 2008; Канкасова М.Н. и др., 2009; Щербакова М.Ю., 2009]. Инфекции, вызванные СГА, и так называемые постстрептококковые осложнения, опосредованные аутоиммунными механизмами поражений тканей организма (ревматическая лихорадка, постинфекционный гломерулонефрит, реактивный артрит, васкулиты) являются одной из главных причин нетрудоспособности населения. Наибольшее беспокойство вызывают генерализованные формы инфекции, которые поражают лица молодого возраста без каких либо фоновых заболеваний и, в 50-80% случаев заканчивающихся летально [Брико Н.И. и др., 2004; Близнюк А. М., 2010]. В связи с этим первостепенное значение имеет своевременная диагностика и эффективное лечение стрептококковой инфекции. Своевременная адекватная антибактериальная терапия способствует не только полной элиминации стрептококка А из организма больного, но и предупреждению постстрептококковых осложнений.
Эффективная антимикробная терапия основывается на учете достоверных региональных и локальных данных о резистентности возбудителя заболевания к наиболее часто используемым антимикробным препаратам. Разработка национальных стандартов (протоколов) терапии требует учета уровня, фенотипов и механизмов резистентности. В последние несколько десятилетий во многих странах, в том числе, и в России, отмечается появление и распространение штаммов БГСА, резистентных к макролидам, линкозамидам, фторхинолонам, тетрациклину, хлорамфениколу [Брико Н.И. и др., 2006, Козлов Р.С. и др. 2007]. В то же время, принимая во внимание наличие лишь разрозненных данных по структуре резистентности стрептококка А к антимикробным препаратам, свидетельствующие о значительном варьировании в различных регионах России, скорее всего связанного с неодинаковым потреблением антимикробных препаратов разных классов, целесообразным является проведение тщательного мониторинга антибиотикорезистентности СГА в России, с целью дальнейшей оптимизации и рационализации антибиотикотерапии стрептококковых инфекций.
Цель исследования
Изучить уровень, фенотипы и механизмы резистентности к антимикробным препаратам S. pyogenes и разработать на этой основе алгоритмы выбора антибактериальных препаратов для лечения стрептококковых инфекций различной локализации.
Задачи исследования
-
Сформировать коллекцию клинических штаммов S. pyogenes, выделенных от больных со стрептококковой инфекцией различной локализации в стационарах различных регионов России.
-
Оценить in vitro активность используемых и перспективных антибактериальных препаратов в отношении выделенных клинических штаммов S. pyogenes.
-
Определить уровень и особенности антибиотикорезистентности клинических штаммов S. pyogenes, выделенных от больных со стрептококковой А инфекцией различной локализации в стационарах различных регионов России.
-
Разработать рекомендации по рационализации эмпирического и этиотропного выбора антибиотиков для лечения стрептококковых А инфекций различной локализации с учетом региональных особенностей антибиотикорезистентности.
Впервые в рамках масштабного микробиологического проекта, охватывающего все регионы России, проведено исследование по изучению уровня, особенностей фенотипов и механизмов резистентности к антибиотикам клинических штаммов S. pyogenes, выделенных от пациентов с инфекциями различной локализации и оценена их динамика за период 1999 – 2009 гг.
С помощью ПЦР проведена детекция генов резистентности у штаммов S. pyogenes, проявляющих фенотипическую устойчивость к макролидным антибиотикам. Выявлено, что устойчивость штаммов СГА к макролидам была обусловлена наличием erm(A), субкласс erm (TR), mef – генами. Ведущим механизмом устойчивости S. pyogenes к макролидам, выделенных в различных округах России был эффлюкс – механизм, связанный с mef А – геном.
Проведено сиквенс типирование макролидрезистентных штаммов СГА и впервые установлено, что в России циркулирует 4 клональных комплекса.
Полученные данные по резистентности штаммов СГА к антибиотикам положены в основу при разработке научно-обоснованных рекомендаций по выбору препаратов для антибактериальной терапии стрептококковых инфекций различных локализаций, вызванных СГА.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Фенотипы резистентности к различным классам антимикробных препаратов существенно различаются не только в различных регионах России, но и в городах одного федерального округа.
-
Устойчивость к макролидам штаммов СГА, выделенных в стационарах различных регионов России связана с erm (A), субкласс erm (TR) и mef (A) генами. Ведущим механизмом резистентности к макролидам штаммов СГА является эффлюкс механизм, связанный с mef геном.
-
При выборе антимикробных препаратов для рутинного тестирования в лабораториях клинической микробиологии выделенных штаммов необходимо исходить из региональных данных об уровнях и фенотипах резистентности циркулирующих штаммов СГА
-
Протоколы эмпирической и этиотропной терапии инфекций вызванных S. pyogenes на основании фармакодинамических, фармакокинетических особенностей антимикробных препаратов должны включать в качестве препаратов выбора – лактамные антибиотики (феноксиметилпенициллин, бензилпенициллин, ингибиторозащищенные пенициллины, цефалоспорины), в качестве альтернативной группы препаратов – макролиды, линкосамиды и респираторные фторхинолоны.
-
На основе изученных региональных тенденций резистентности стрептококка группы А, с учетом фармакодинамических и фармакокинетических данных изученных антимикробных препаратов, разработаны практические рекомендации по эмпирической и этиотропной терапии инфекций, вызванных стрептококком группы А.
-
Сформированная коллекция клинических штаммов S. pyogenes необходима для оценки перспективности использования новых классов и групп антимикробных препаратов в Российской Федерации
-
Полученные нами фармакодинамические данные по активности различных классов и групп антимикробных препаратов позволяют прогнозировать резистентность S. pyogenes, вызывающего различные формы инфекции, c целью предупреждения и распространения резистентных штаммов СГА.
Внедрение в практику
Результаты исследования, выводы, практические рекомендации диссертации внедрены в учебный процесс кафедры микробиологии, клинической фармакологии, ЛОР – болезней, инфекционных заболеваний ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» и используются при проведении семинаров студентам, интернам, ординаторам, аспирантам. Практические рекомендации включены в учебное пособие для врачей в системе последипломного образования, в Национальные рекомендации по лечению инфекций кожи и мягких тканей (2009 г.), а также в протоколы терапии стрептококковых инфекций в педиатрии Союза педиатров России и МАКМАХ.
Полученные автором результаты были представлены и обсуждены на заседаниях проблемной комиссии по иммунологии, иммуноморфологии и иммунопатофизиологии ГБОУ ВПО СГМА Минздрава России (Смоленск, 2011, 2013); І, Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012, 2013); на ІІІ, ІV, V, Международном конгрессе по антимикробной терапии (Москва,2011,2012, 2013); на ІІ Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2012); на VІІ Национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2012); на межрегиональном саммите по проблеме пневмококковой инфекции (Киев, 2013); на совместном заседании сотрудников кафедр микробиологии, клинической фармакологии, инфекционных болезней с эпидемиологией, инфекционных болезней у детей, поликлинической терапии, факультетской терапии, ЦНИЛ, ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Смоленской области» и НИИАХ ГБОУ ВПО СГМА Минздрава России (Смоленск, 2012); 7 World Congress of the World Society for Pediatric Infectious Diseases WSPID (Melbourne, Australia, 2011); 52 Annual Meeting of the European Society for Pediatric Research (Great Britain, Newcastle, 2011); European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (Berlin, Germany, 2013); апробация диссертации состоялась на совместном заседании сотрудников кафедр микробиологии, клинической фармакологии, биологии, инфекционных болезней с эпидемиологией, инфекционных болезней у детей, поликлинической педиатрии и НИИАХ ГБОУ ВПО СГМА Минздрава России (протокол № 19 от «27» сентября Смоленск, 2013).
По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 2 работы в рекомендованном ВАК рецензируемом журнале.
Диссертационная работа изложена на 114 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, (3 главы), выводов, практических рекомендаций, приложения, указателя литературы, включающего 38 отечественных и 122 зарубежных источников. Текст иллюстрирован 6 таблицами и 19 рисунками.
Эволюционные аспекты изменчивости микроорганизмов
За последние годы в России демографическая политика и сфера охраны здоровья граждан стали основными приоритетными направлениями государства. Активно начатый в 2006 году национальный проект «Здоровье» и поддержавшие его в 2011 году региональные программы модернизации здравоохранения, на реализацию которых выделено более 12 млрд. рублей, позволили существенно обновить инфраструктуру отрасли, переоснастить амбулаторные и стационарные лечебно-профилактические учреждения, инициировать информатизацию здравоохранения. Программы «Родовый сертификат», «Неонатальный и аудиологический скрининг», «Пренатальная диагностика» позволили значительно улучшить состояние здоровья беременных женщин, матерей и новорожденных. Весь этот комплекс мер уже привл к существенным позитивным изменениям – на 36% снизилась материнская смертность и на 33% младенческая [1, 2].
Одной из ведущих причин смертности и первой причиной е преждевременности являются инфекции – это реальная угроза населению в любой точке мира, препятствие на пути социального и экономического развития, когда все усилия и затраты направленные на модернизацию здравоохранение, могут оказаться тщетными [6].
По последним данным ВОЗ ежегодно болеют инфекционными болезнями 2 млрд. человек, 17 млн. из которых, умирают. В мире ежедневно 50 тысяч смертей связаны с инфекцией.
За последние 70 лет зарегистрировано более 350 новых нозологических форм инфекционных болезней или их возбудителей, 75% из них зоонозного происхождения [6, 38]. В 1980 году описано около двух тысяч видов бактерий, в то время как только за последние годы, выявлено более 500 новых видов патогенов, имеющих значение в развитии инфекционных заболеваний человека. Яркий этому пример, выделение в 1985 году бактерии Helicobacter pylori и определение ее роли в развитии язвы и рака желудка, или описание Tropheryma whipplei в 1992 году как возбудителя воспалительного заболевания кишечника – болезни Уиппла [31]. В настоящее время многие хорошо известные болезни стали проявляться в новом обличии и приобретать большую актуальность и значимость. Одной из основных причин этого является эволюция микроорганизмов и их стремление противостоять воздействиям внешних (природных, антропогенных) и внутренних факторов [6].
Пристальное внимание врачей к инфекционно-воспалительным заболеваниям в акушерстве, гинекологии и неонатологии и борьба с ними стали неотъемлемой составляющей прогресса. Подтверждается роль оппортунистических инфекций гениталий в развитии таких серьезных осложнений, как тяжелые дисфункции репродуктивной системы. Стало ясно, что многие инфекционные заболевания сегодня редко вызываются истинно патогенными возбудителями, и большинство инфекций связаны с микробами, которые в обычных условиях не приносят вреда здоровью, благодаря защитному действию иммунной системы [14, 15, 18, 39]. Встречаемость и причастность к возникновению заболеваний различных условно-патогенных микроорганизмов все больше увеличивается, что, безусловно, существенно осложняет этиологическую диагностику и проведение своевременного и адекватного лечения пациентов. Выявление возбудителей специфических и, в особенности, неспецифических инфекций в акушерстве-гинекологии и перинатологии сегодня более трудна, чем, кажется на первый взгляд [14 - 16].
Микроорганизмы хорошо приспосабливаются к меняющимся внешним условиям, благодаря чему возникают новые инфекции, а там, где не проводится профилактическая и исследовательская деятельность в сфере борьбы с инфекционными заболеваниями, побежденные болезни возвращаются. Примером этого может служить туберкулез и сифилис [40, 41]. Наблюдаемый по всему миру феномен «появления и возрождения» инфекций привлекает к себе внимание с середины 1970-х годов. При этом важным является не только возникновение новых нозологий, но и сопутствующий этому процесс роста заболеваемости уже известными болезнями, возбудители которых реализуют способность к внутриклеточному паразитированию, антибиотикорезистентности, образованию биопленок [6, 42].
Классический постулат Коха и Пастера «Один микроб – одно заболевание», со временем приобрел новую трактовку. Современные методы микробиологической диагностики позволяют врачам наблюдать разнообразие микроорганизмов, их влияние на заболевание человека и процесс излечения [6]. Благодаря развитию бактериологической и молекулярно-генетической диагностики стало известно, что, например, возбудителями туберкулеза являются девять видов Mycobacterium, а некоторые из них, такие как Mycobacterium bovis, требуют отличной от классической, специфической антибактериальной терапии [25]. Гипотеза об этиологической роли только Gardnerella vaginalis в развитии бактериального вагиноза у женщин опровергнута доказательствами об участии ассоциации нескольких видов облигатно-анаэробных бактерий в развитии данного состояния [39, 43 - 47].
За миллионы лет своего существования, в ходе непрерывного генетического эволюционного процесса, микроорганизмы довели до совершенства свои адаптационные механизмы к воздействию антимикробных средств, нехватке питательных веществ и сопротивлению иммунных систем. Усиление за последнее время изменчивости в возникновении, распространении и проявлениях инфекционных заболеваний указывает на то, что взаимоотношения между человеком и микроорганизмом имеют глобальные масштабы и это связано с интенсивной современной деятельностью человека. Бесконтрольное применение антимикробных препаратов, урбанизация, процессы внутренней и внешней миграции, растущее число беженцев, сексуальные революции и наркомания, торговля и интенсивное производство пищевых продуктов – все это влияет на эволюцию микроорганизмов и распространение инфекционных заболеваний [6, 40].
Видовая идентификация методом MALDI–TOF–MS анализа выделенных при посеве микроорганизмов
Исследование микроценоза влагалища проводили методом количественной ПЦР с использованием комплексной тест-системы «Фемофлор-16» (ООО «НПО ДНК-Технология») в детектирующем амплификаторе ДТ-96 согласно инструкции производителя (ООО «НПО ДНК-Технология»).
Отделяемое влагалища собирали с заднего свода в транспортные среды с изотоническим водно-солевым раствором и консервантом. ДНК выделяли с использованием комплекта реагентов «Проба-ГС» производства ООО «НПО ДНК-Технология» (Россия).
Набор реагентов тест-системы «Фемофлор-16» включает: смесь для ПЦР-амплификации, специфичную для всех бактерий (общая бактериальная масса), специфичные праймеры для нормофлоры (Lactobacillus spp.) и специфичные праймеры для ряда УПМ: Enterobacteriaceae, Streptococcus spp., Staphylococcus spp., G. vaginalis, Prevotella bivia / Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Sneathia spp. / Leptotrihia spp. / Fusobacterium spp., Megasphaera spp. / Veilonella spp. / Dialister spp., Lachnobacterium spp. / Clostridium spp., Mobiluncus spp. / Corynebacterium spp., Peptostreptococcus spp., A. vaginae, M. hominis, Ureaplasma (urealyticum +parvum), Candida spp.
Контроль качества: использовали входящий в набор внутренний контрольный образец (оценка эффективности протекания ПЦР) и смесь для амплификации геномной ДНК человека, предназначенную для контроля взятия клинического материала.
Для оценки видового состава лактобацилл кроме определения их количества провели индикацию в исходном материале семи видов Lactobacillus (crispatus, iners, jensenii, gasseri, johnsonii, vaginalis, acidophilus) методом количественной ПЦР с использованием специально подобранных праймеров (OOO «НПО ДНК-Технология», Москва).
Этапы проведения исследования методом количественной ПЦР с использованием тест-системы «Фемофлор-16» состояли в следующем: 1. Пробирки с первичным материалом (отделяемое влагалища) центрифугировали при 13000 об/мин. в течение 10 мин.
2. Удаляли надосадочную жидкость, оставляя 100 мкл образца, добавляли 300 мкл лизирующего раствора и 100 мкл отрицательного контрольного образца, встряхивали на вортексе в течение 3-5 секунд и термостатировали 15 минут при 65 С.
3. Осаждали конденсат центрифугированием при 13000 об/мин – 30 с., добавляли 400 мкл реагента для преципитации, встряхивали пробирки на вортексе в течение 3-5 с. и центрифугировали при 13000 об/мин в течение 15 минут.
4. Удаляли надосадочную жидкость, добавляли к осадку 500 мкл промывочного раствора №1 и центрифугировали при 13000 об/мин в течение 5 минут.
5. Удаляли надосадочную жидкость и добавляли к осадку 300 мкл промывочного раствора №2 и центрифугировали пробирки при 13000 об/мин в течение 5 минут.
6. Удаляли надосадочную жидкость, высушивали осадок при 65С в течение 5 минут и добавляли к осадку 400 мкл буфера для растворения, встряхивали на вортексе в течение 3-5 с. и осаждали центрифугированием в течение 3-5 с.
7. Прогревали при 65С в течение 10 минут, встряхивали на вортексе в течение 3-5 с., и центрифугировали при 13000 об/мин в течение 30 с.
В качестве отрицательного контроля в отдельную пластиковую пробирку объмом 1,5 мл вносили 50 мкл стерильного физиологического раствора.
К готовому препарату добавляли раствор Taq-полимеразы по 1 капле минерального масла и проводили ПЦР. Детекцию и учет результатов осуществляли на детектирующем амплификаторе ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология») в соответствии с инструкцией к прибору. Интерпретацию результатов реакции осуществляли автоматически с помощью программного обеспечения, поставляемого с детектирующим амплификатором ДТ-96. 2.4.2. Молекулярно-генетическое типирование микроорганизмов
Секвенирование 16S (или 18S) рРНК применяли как референсный метод в случаях спорных результатов идентификации другими способами. Всего идентифицировано 606 различных микроорганизмов.
Проведено молекулярно-генетическое типирование госпитальных
штаммов CoNS методом амплификации генов «домашнего хозяйства» с последующим геномным секвенированием. Расширенная генетическая характеристика 70 клинических изолятов CoNS включала: определение гена mecA для подтверждения устойчивости к метициллину (оксациллину); типирование 41 штамма S. haemolyticus и 28 штаммов S. epidermidis на основании существующих схем мультилокусного секвенирования (MLST).
Для выделения геномной ДНК использовали набор «ДНК-экспресс» (ООО НПФ Литех, Россия) в соответствии с прилагаемыми инструкциями (ТУ-9398-450-17253567-03). Пробы ДНК хранили при температуре -20C. С помощью олигонуклеотидных праймеров, перечисленных в таблице 1, амплифицированы фрагменты гена mecA.
Оптимизация технологии MALDI–TOF–MS анализа нейссерий и изучение возможности их штаммового типирования
За период исследования различными микробиологическими методами проведено 19974 анализа клинического материала, полученного от пациентов акушерско-гинекологического и неонатального профилей. В результате выделено и тестировано методом MALDI–TOF–MS анализа 27152 изолята УПМ. В 24552 случаях (91,0%) получена идентификация с высокой степенью достоверности на уровне вида (score 2,0); с низкой степенью (score 1,7-1,9), определяющей родовую принадлежность – 1639 культур (6,0%) и в 3,0% случаев, т.е. 961 микроорганизм не был идентифицирован (score 1,7). После исключения повторных идентификаций в анализ включены 18585 изолятов (10269 – грамположительных (в т.ч. трудноидентифицируемых лактобацилл, коринебактерий, строгих анаэробов и др.), 5747 – грамотрицательных бактерий и 2569 – дрожжевых грибов.
Параллельно проведена сравнительная оценка видовой идентификации 2005 изолятов УПМ по биохимическим показателям (VITEK2Compact). Все случаи несовпадений проверяли дополнительными диагностическими тестами классической микробиологии и/или секвенированием генов 16S (или 18S) рРНК.
За период исследования проанализировано 3304 изолята стафилококков выделенных из различных локусов пациентов акушерско-гинекологического и неонатального профилей. Определено широкое разнообразие этой группы микроорганизмов в обследуемой популяции, которое представлено 16 различными видами: S. aureus (n=455) и 15 видов CoNS (рис. 19). Чаще всего среди них встречались S. epidermidis – 40,6%; S. haemolyticus – 27,8%; S. aureus – 13,8% и S. hominis 12,1%, остальные виды составляли менее 2,0%.
Методом MALDI–TOF–MS анализа с высокой степенью достоверности до вида (score 2,0) идентифицированы 95,6% изолятов чистых суточных культур стафилококков; до рода (score 1,7-1,9) определено 4,2% и в 0,2% случаев score составил менее 1,7 (таб. 9). Полученные результаты говорят о высокой чувствительности метода по отношению к группе стафилококков.
Исключив идентификацию видов, где число наблюдений составило менее 10, выяснено, что лучше всего среди стафилококков методом MALDI–TOF–MS анализа идентифицируется S. aureus, из 455 наблюдений 100% штаммов идентифицированы с высокой степенью достоверности (score 2,0 и более), что является особенно важным с клинической точки зрения, учитывая патогенность данного вида (таб. 9). Предварительно для первичной дифференциации S.aureus от CoNS использовали классический тест – реакцию коагуляции плазмы: все стафилококки, дающие положительную реакцию, идентифицированы методом MALDI–TOF–MS как S. aureus.
Из таблицы видно, что в 95,6% случаев все виды стафилококков идентифицированы с score 2,0 исключения составили S. cohnii, среди которых 60,0% изолятов идентифицированы со score менее 2,0, а 12,0% – S. warneri.
Параллельно с помощью автоматического бактериологического
анализатора VITEK2Compact (BioMerieux, Франция) по биохимическим показателям и методом MALDI–TOF–MS анализа на масс-спектрометре AutoflexIII (Bruker Daltonics, Германия) с програмным обеспечением MALDI Biotyper версии 3.0 идентифицированы 117 изолятов стафилококков (таб. 10).
Методом MALDI–TOF–MS анализа в 99,0% случаев идентификация получена с высокой степенью достоверности принадлежности к виду (score более 2,0). Уровень достоверности результатов идентификации всех изолятов стафилококка, тестированных с помощью VITEK2Compact, также был высоким – более 80%.
Из таблицы видно, что в 115 случаях (98,3%) отмечено совпадение идентификации. В отношении видов S. aureus, S. hominis, S. haemolyticus, S. epidermidis, S. lugdunensis и S. cohnii получено полное совпадение.
Изоляты S. pasteuri, идентифицированные методом MALDI–TOF–MS анализа с высоким score, по биохимическим показателям (VITEK2Compact) определялись как S. warneri, с пометкой, что при желтой пигментации штамм может быть отнесен к виду S. pasteuri. Среди трех штаммов, идентифицированных на масс-спектрометре как S. warneri, в одном случае с помощью VITEK2Compact был определен S. vitilinus с вероятностью 97%.
Секвенированием генов 16S рРНК подтверждена видовая принадлежность идентифицированных методом MALDI–TOF–MS анализа 80 штаммов различных видов CoNS из них: 41 – S. haemolyticus; 28 – S. epidermidis; 4 – S.
При видовой идентификации стафилококков (суточные культуры) 95,6% изолятов идентифицируются с высокой степенью достоверности (score 2,0 и более). Невысокую степень достоверности имеет идентификация S. cohnii.
При параллельной идентификации стафилококков методом MALDI–TOF– MS анализа и по биохимическим показателям с помощью анализатора VITEK2Compact в 98,3% случаев отмечено совпадение результатов идентификации с высокой степенью достоверности. Расхождения имеются при идентификации видов S. warneri, S. vitilinus и S. pasteuri, которые подтверждены секвенированием генов 16S рРНК в пользу метода MALDI–TOF–MS анализа.
MALDI–TOF–MS анализ оказался надежным инструментом для быстрой видовой идентификации рода Staphylococcus и может быть рекомендован к использованию в рутинной практике как самостоятельный метод.
Стрептококки За период исследования проанализированы результаты видовой идентификации методом MALDI–TOF–MS анализа 1787 изолятов стрептококков, выделенных из различных локусов пациентов акушерско-гинекологического и неонатального профилей. Определено широкое разнообразие этой группы микроорганизмов, которые оказались представлены 24 видами (рис. 20). Наиболее часто встречались S. agalactiae – 33,2%, S. pneumoniae – 28,1% и S. salivarius – 15,4%.
Разработка и усовершенствование технологии прямого масс -спектрометрического профилирования микроорганизмов в гемокультуре и оптимизация диагностики бактериемии
При анализе клинико-анамнестических данных обследованных беременных во II – III триместрах беременности в общей группе (n=212) 114 женщин были с физиологическим течением беременности (I группа) и 98 – c беременностью, осложненной угрозой выкидыша (II группа).
На основании интегральной оценки результатов микроскопии и культурального исследования состояние микроценоза оценено как Н у 79 (69,3%) женщин I группы и 30 (30,6%) во II группе. Инфекции влагалища у беременных I группы диагностированы в соотношениях: КВ – 16 (14,0%), АВ – 5 (4,4%), БВ – 7 (6,1%) и БНГ, М и ЦВ суммарно 12 (10,5%).
Во II группе беременных женщин инфекции влагалища выявлены у 63 (64,3%) беременных. Учитывая состояние микробиоты в данной группе КВ отмечен у 22 (22,4%), БВ – у 18 (18,7%), АВ – у 15 (15,3%). Состояние БНГ, М и ЦВ во II группе беременных диагностированы у 8 (8,2%) женщин.
Сравнение микробиоты влагалища у женщин с физиологически протекающей беременностью и у беременных с угрозой выкидыша показало, что в I группе Н диагностировали в 2,3 раз чаще (69,3 и 30,6%, соответственно), а нарушение микроценоза в 2,3 раза реже (30,7 и 69,4%, соответственно), чем во II группе. Во II группе все варианты инфекционной патологии влагалища встречались значительно чаще: АВ в 3,5 раз, БВ – в 3 раза и КВ – в 1,6 раз.
Таким образом, в результате обследования 212 беременных женщин с использованием культуральной диагностики с видовой идентификацией MALDI–TOF–MS и метода ПЦР выявлено 794 штамма лактобацилл 21 вида: L.crispatus, L. jensenii, L. iners, L. gasseri, L. vaginalis, L. fermentum, L. salivarius, L. mucosae, L. oris, L. ultunensis, L. delbrueckii, L. plantarum, L. rhamnosus, L.casei, L. paracasei, L. johnsonii, L. zeae, L. reuteri, L. kitasatonis, L. viridescens, L. acidophilus. У женщин c «абсолютным Н» доминировал вид L. crispatus (87,3±7,8%). У подавляющего большинства женщин с БВ (84,0%; ДИ 95,0%:59,9–95,8) методом ПЦР в высоком титре выявлен вид L. iners. Следует отметить, что вид L. acidophilus составил лишь 0,3% в пуле молочно-кислых бактерий вагинальной микробиоты беременных женщин российской популяции.
Сравнение результатов оценки микроценоза влагалища беременных различными методами (микроскопия, посев с видовой идентификацией MALDI– TOF–MS и количественная ПЦР) выявило преимущества и недостатки каждого из них, что помогло улучшить качество диагностики оппортунистических инфекций влагалища. Расхождения в результатах можно объяснить заниженными пороговыми значениями оценки некоторых возбудителей оппортунистических инфекций влагалища в тест-системе «Фемофлор-16» (грибы, генитальные микоплазмы), а также отсутствием ряда УПМ (S. aureus, S. agalactiae, E. coli, E. faecalis, грибов С. non-albicans) в составе набора.
Мы считаем, что оптимальным методом лабораторной диагностики оппортунистических инфекций влагалища бактериальной и грибковой этиологии (АВ и КВ) в настоящее время является комплексное микробиологическое исследование (микроскопия мазков, окрашенных по Граму и культуральное исследование с видовой идентификацией УПМ методом MALDI–TOF–MS анализа), в то время как оценка дисбиотических нарушений микроценоза влагалища (БВ) – микроскопией мазков, окрашенных по Граму и количественной ПЦР. Молекулярно-генетическая диагностика оппортунистических инфекций влагалища должна включать индикацию в 187 отделяемом влагалища E. faecalis, E. coli, S. agalactiae, S. aureus, как наиболее частых возбудителей АВ.
Результаты выявления различными микробиологическими методами особенностей микробной колонизации и этиологии ИВЗ у новорожднных, находящихся на выхаживании в стационаре
В период с января 2011 по декабрь 2012 года, с целью изучения особенностей колонизации слизистых оболочек УПМ и этиологии ИВЗ у новорожднных, а также для оценки различных методов микробиологической диагностики, проведено комплексное обследование 928 новорожднных, находящихся на выхаживании в отделениях Центра (405 в ОРИТ и 523 в ОПН). Для оперативной профилактики формирования эпидемических вариантов возбудителей изучена динамика циркуляции госпитальных штаммов в различных отделениях.
Одной из основных задач исследования было определить эпидемиологические особенности циркулирующей микрофлоры в неонатальных отделениях первого (ОРИТ) и второго (ОПН) этапов выхаживания конкретного родовпомогательного учреждения и усовершенствовать систему инфекционного контроля стационара путем оптимизации микробиологического мониторинга в неонатальных отделениях Центра и создания алгоритмов обследования пациентов.
В основе проводимого нами микробиологического мониторинга лежало изучение видовой принадлежности УПМ, колонизирующих слизистые ЖКТ новорожднных, а также изучение динамики циркуляции госпитальных штаммов УПМ в стационаре с целью оперативной профилактики формирования эпидемических вариантов возбудителей. На основании результатов микробиологического мониторинга, проводимого посредством культурального исследования с последующей видовой идентификацией микроорганизмов методом MALDI–TOF–MS анализа, определены основные госпитальные патогены циркулирующие в отделениях.
