Введение к работе
Актуальность работы. Streptococcus pyogenes - патогенный для человека микроорганизм, вызывающий различные формы гнойно-септической инфекции, тонзиллит, рожистое воспаление, скарлатину, синдром токсического шока и др. (Белькова Ю.А., 2005; Kumar R. et.al 2009; Scaber J., 2010). После перенесенных инфекций, вызванных S. pyogenes, возможно развитие таких осложнений, как сепсис, пневмония (Martic J. et.al., 2010; Mehta S. et.al., 2006; Zakikhany K. et.al., 2011), ревматизм и гломерулонефрит, способных привести к летальному исходу или инвалидизации пациентов (Белов Б.С. 2003; Наумова В.И. и др., 1996; Paula J.S. et.al, 2008).
Все штаммы S. pyogenes разделяют на М-серотипы или е/тш-генотипы, в зависимости от антигенной специфичности белка М или нуклеотидной последовательности 5'-конца кодирующего его гена етт соответственно (Facklam R.F. et.al., 2002). Определенные М-серотипы (или е/тш-генотипы) S. pyogenes нередко ассоциируются с развитием того или иного осложнения, в зависимости от характера которого штаммы S. pyogenes условно подразделяют на ревматогенные и нефритогенные. Так, развитие ревматизма часто связано с инфицированием человека штаммами серотипов М5, Мб и Ml8, а развитие гломерулонефрита - штаммами серотипов Ml, М2, М4, М12, М25, М42, М49, М56, М57 и М60 (Facklam R.F. et.al, 2002).
Геномы штаммов S. pyogenes содержат большое количество мобильных генетических элементов, различия в составе и последовательностях которых в значительной мере обуславливают генетическое разнообразие вида. Так, суммарный размер ДНК умеренных бактериофагов может достигать 12% от общего размера генома S. pyogenes (Ferretti J.J. et.al, 2001; Beres S.B. et.al, 2002). Мобильные генетические элементы, в частности, профаги и транспозоны, могут содержать гены вирулентности и гены устойчивости к антимикробным препаратам (Brenciani A. et.al, 2004; Clermont D. et.al, 1997, Giovanetti E. et.al, 2005). Приобретение таких мобильных генетических элементов штаммами-возбудителями может привести к изменению их фенотипических свойств и, как следствие, к осложнению течения заболевания и/или снижению эффективности антибиотикотерапии. В последние годы наблюдается увеличение числа штаммов S. pyogenes, в том числе, штаммов генотипов emml и етт12, устойчивых к действию практически всех групп антибиотиков, за исключением бета-лактамных (Ardanuy С. et.al, 2010; Del Grosso М. et.al, 2011). Поэтому, важными задачами современной микробиологии являются изучение механизмов возникновения и быстрого распространения антибиотикоустойчивых штаммов S. pyogenes в микробной популяции и изучение роли горизонтального переноса мобильных генетических элементов в изменчивости S. pyogenes.
Таким образом, актуальным является изучение геномного полиморфизма S. pyogenes, в частности, опосредованного мобильными генетическими элементами.
Цель исследования.
Изучить генетическое разнообразие штаммов Streptococcus pyogenes, выделенных в различных географических регионах. Задачи работы:
1. Изучение геномного полиморфизма S. pyogenes, обусловленного
умеренными бактериофагами, и его влияния на фенотипические свойства S.
pyogenes;
Изучение рестрикционного полиморфизма геномной ДНК штаммов S. pyogenes методом PFGE;
Сравнительный анализ штаммов S. pyogenes методом RAPD;
4. Выявление мобильных генетических элементов у штаммов S. pyogenes.
Научная новизна.
впервые выявлено выраженное генетическое разнообразие штаммов S. pyogenes генотипов emml и етт12, выделенных в Санкт-Петербурге (Россия) и в Пекине (КНР), обусловленное умеренными бактериофагами;
показано, что среди штаммов S. pyogenes генотипов emml и emml2 наиболее распространенными являются гены бактериофагов speA, speH, speC, ssa, кодирующие токсины, и гены Ш4 и Ш7, кодирующие интегразы бактериофагов;
предложен комплексный подход к анализу генетической неоднородности штаммов S. pyogenes на основании сравнения профилей фаговых генов, паттернов RAPD и PFGE;
показана возможность применения стандартизованного метода RAPD для обнаружения мобильных генетических элементов S. pyogenes;
у штаммов S. pyogenes выявлен ранее не обнаруженный транспозон, содержащий ген устойчивости к тетрациклину tetM, и установлена его геномная локализация;
доказано, что наличие профага NZ131.2 в геноме S. pyogenes NZ131 влияет на культуральные свойства штамма.
Научно-теоретическая и практическая значимость исследования.
Полученные в диссертационной работе данные расширяют представления о генетическом разнообразии штаммов S. pyogenes, циркулирующих в разных географических регионах, таких как Санкт-Петербург и Пекин, и могут быть использованы для дальнейших исследований с целью оценки эпидемиологической ситуации по стрептококковой заболеваемости и для прогнозирования ее развития в Санкт-Петербурге. Показана возможность применения метода RAPD в целях изучения генетической неоднородности и обнаружения мобильных генетических элементов штаммов S. pyogenes. Разработанный комплексный подход к исследованию геномного полиморфизма может быть использован для дальнейших исследований штаммов S. pyogenes с целью их эффективной дифференциации. Данные по транспозону, впервые обнаруженному у S. pyogenes и содержащему ген устойчивости к тетрациклину, могут послужить основой для дальнейших исследований, направленных на оценку эффективности и целесообразности применения данного антибиотика
при лечении стрептококковой инфекции. Нуклеотидные последовательности ДНК, определенные в настоящей работе, депонированы в базу данных GenBank под номерами JN799842, JN799843, JN799844 и JQ001862, и могут быть использованы для дальнейших научных исследований.
Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 10 научных работах (из них 4 статьи и 6 тезисов). По материалам диссертации был сделан постерный доклад на международном симпозиуме по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям (Греция, 2008 г.). Материалы работы докладывались на заседаниях отдела молекулярной микробиологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН (2009, 2010 гг.) и на семинаре лаборатории микробиологии и иммунологии Пекинского детского госпиталя (2010 г.).
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 133 страницах машинописного текста, включающего в себя введение, 4 главы обзора литературы, описание материалов и методов исследования, 5 глав собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, список литературы и приложения. Работа проиллюстрирована 18 таблицами и 30 рисунками, указатель литературы содержит 158 источников, в том числе 10 отечественных и 148 иностранных.
