Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Взаимодействие моноцитов крови с эндотелиальными клетками сосудов 11
1.1.1. Морфологические характеристики взаимодействующих клеток 11
1.1.2. Этапы мобилизации моноцитов из кровяного русла в очаг инфекции 13
1.1.3. Секреторная активность моноцитов крови человека 22
1.2. Влияние Streptococcus pyogenes и его компонентов на процессы мобилизации моноцитов в очаг воспаления 29
1.2.1. Факторы патогенности (вирулентности) гноеродного стрептококка 29
1.2.2. Влияние бактериальных компонентов на функции моноцитов крови 32
1.2.3. Влияние бактериальных компонентов на функции эндотелиальных клеток 34
1.3. Влияние компонентов гноеродного стрептококка на регуляцию взаимодействия
моноцитов крови с эндотелиальными клетками сосудов 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы 40
2.1. Культуры клеток 40
2.2. Выделение мононуклеарных лейкоцитов из периферической крови доноров
2.4. Характеристика супернатанта разрушенных 5. pyogenes 43
2.5. Оценка интенсивности апоптоза и некроза в исследуемых культурах 44
2.6. Оценка адгезионной активности моноцитов крови человека и клеток линии ТНР-1..
2.6.1. Оценка адгезионной активности клеток линии ТНР-1 к монослою эндотелиальных клеток 46
2.6.2. Оценка адгезионной активности моноцитов крови к монослою эндотелиальных клеток 47
2.6.3. Оценка адгезионной активности мононуклеарных лейкоцитов крови к пластику 48
2.7. Оценка миграционной активности моноцитов крови и клеток линии ТНР-1 48
2.7.1. Оценка миграционной активности клеток линии ТНР-1 50
2.7.2. Оценка миграционной активности моноцитов крови человека
2.8. Исследование уровней экспрессии адгезионных молекул 52
2.9. Количественная оценка цитокинов в супернатантах 52
2.10. Исследование уровней экспрессии фосфокиназ
2.11. Статистическая обработка результатов 54
ГЛАВА 3. Результаты 55
3.1. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на функции клеток линии ТНР-
3.1.1. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на адгезию клеток линии ТНР-1 к монослою эндотелиальных клеток 55
3.1.2. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на трансэндотелиальную миграцию клеток линии ТНР-1 58
3.1.3. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на миграционную активность клеток линии ТНР-1 59
3.1.4. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на уровень экспрессии адгезионных молекул на клетках линии ТНР-1 60
3.1.5. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на уровень экспрессии фосфо-NFKB в клетках линии ТНР-1 62
3.1.6. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на адгезию клеток линии ТНР-1 (интактных и преинкубированных с токсином коклюша) к эндотелиальным клеткам 63
3.1.7. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на трансэндотелиальную миграцию интактных и преинкубированных с токсином коклюша клеток линии ТНР-1 64
3.1.8. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на интенсивность миграции интактных и преинкубированных с токсином коклюша клеток линии ТНР-1 66
3.2. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на функции моноцитов периферической крови человека 67
3.2.1. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на адгезию моноцитов крови человека к монослою эндотелиальных клеток 67
3.2.2. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на адгезию мононуклеарных лейкоцитов крови человека к пластику 69
3.2.3. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на трансэндотелиальную миграцию моноцитов крови человека 71
3.2.4. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на миграцию моноцитов крови человека 72
3.2.5. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на миграцию интактных и преинкубированных с токсином коклюша моноцитов крови человека
4 3.2.6. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на уровень экспрессии адгезионных молекул на моноцитах крови человека 77
3.2.7. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на секрецию цитокинов мононуклеарными лейкоцитами 78
3.2.8. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на уровень экспрессии фосфокиназ моноцитами крови человека 79
3.3. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на функции эндотелиальных клеток 81
3.3.1. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на уровень экспрессии адгезионных молекул на поверхности эндотелиальных клеток 81
3.3.2. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на уровень экспрессии фосфо-NFKB в эндотелиальных клетках 83
3.4. Исследование токсического эффекта супернатанта разрушенных стрептококков на мононуклеарные лейкоциты крови человека и клетки перевиваемых линий ТНР-1 и EA.hy
926 84
ГЛАВА 4. Обсуждение 86
4.1. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на функции клеток линии ТНР-1 86
4.2. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на функции моноцитов крови человека 89
Заключение 94
Выводы 96
Список используемой литературы
- Влияние Streptococcus pyogenes и его компонентов на процессы мобилизации моноцитов в очаг воспаления
- Характеристика супернатанта разрушенных 5. pyogenes
- Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на трансэндотелиальную миграцию клеток линии ТНР-1
- Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на миграцию интактных и преинкубированных с токсином коклюша моноцитов крови человека
Влияние Streptococcus pyogenes и его компонентов на процессы мобилизации моноцитов в очаг воспаления
Моноциты относятся к системе мононуклеарных фагоцитов и происходят из промоноцитов костного мозга. В норме в крови взрослого человека количество моноцитов составляет 1-10% от общего числа лейкоцитов (Луговская С.А., 1997).
Моноциты - самые крупные из лейкоцитов, их размер колеблется от 14 до 20 мкм. Ядро занимает большую или равную с цитоплазмой часть клетки и имеет неправильную бобовидную или подковообразную форму. Хроматин ядер рыхлый, распределен равномерно, образуя ячейки разной величины и формы (Луговская С.А., 1997). При стандартной гематологической окраске по Романовскому-Гимзе ядро окрашивается в красновато-фиолетовый цвет — более светлый, чем у нейтрофилов и лимфоцитов. Цитоплазма моноцитов слабо базофильна, окрашивается в бледно-голубой цвет (по периферии более темный, чем около ядра) и часто содержит в большом количестве мелкие азурофильные гранулы (лизосомы). В цитопламзе макрофагов выявляются лизосомы, фаголизосомы, пиноцитозные везикулы, эндоплазматический ретикулум, хорошо развитый комплекс Гольджи, множество митохондрий и незначительное количество полисом. Мембрана моноцитов неровная, с множеством псевдоподий (van Furthetal., 1972).
Моноциты крови представляют собой подвижный пул относительно незрелых клеток, находящихся на пути из костного мозга в ткани. Внесосудистый пул моноцитов в 25 раз превышает циркулирующий (Луговская С.А., 1997). Время пребывания моноцитов в периферической крови - от 1,5 суток до 4 дней. После чего моноциты мигрируют в ткани и под влиянием микроокружения дифференцируются в макрофаги. В тканях, под влиянием цитокинов, гормонов или факторов экзогенного происхождения макрофаги могут значительно изменять свое функциональное состояние (Зенков и др., 2007). Возникновение очага воспаления в любой ткани приводит к активации тканевых макрофагов с изменением их фенотипа. Морфологические и метаболические характеристики макрофагов зависят от того, в каких органах они локализуются. При любой локализации макрофаги выполняют определенные физиологические функции. Дифференцировка моноцита в макрофаг сопровождается увеличением размеров, возрастанием числа неровностей на наружной мембране клетки, увеличением количества лизосом и митохондрий (van Furth et al., 1972). Повышается активность многих ферментов, теряется активность миелопероксидазы, формируются рецепторы к иммуноглобулинам (Луговская С.А., 1997, Тотолян и Фрейдлин, 2000). Продолжительность жизни макрофагов в тканях составляет более 30 дней.
Площадь поверхности кровеносных сосудов взрослого человека составляет 4000 м2, а общий вес эндотелиальных клеток 1,5-2 кг (Danese et al., 2007, Гомазков О.А., 2000). Эндотелий образует внутреннюю выстилку кровеносных, лимфатических сосудов и полостей сердца. Это непрерывный однослойный пласт клеток мезенхимного происхождения, связанных различными типами адгезионных структур (Johnson-Leger et al., 2000) и щелевыми соединениями (Шубич и др., 2005). Для клеток эндотелия характерна полярность.
Форма эндотелиальных клеток может быть различной. Хотя обычно это полигональные уплощенные клетки, в посткапиллярных венулах они имеют кубическую форму. Толщина эндотелиоцитов варьируется от 0,1 [їм в капиллярах и венах до 1 [їм в аорте (Aire! С.А., 2007). Эндотелиальное дерево не однородно по своей архитектуре. Эндотелиальные клетки различных сосудов существенно различаются по генной и биохимической специфичности, типам рецепторов, наборам белков-предшественников, ферментов, трансмиттеров (Гомазков О.А., 2000).
Форма ядер эндотелиоцитов овальная или лопастная, с многочисленными инвагинациями кариолеммы. В большинстве клеток ядро сравнительно светлое (преобладает эухроматин), содержит хорошо заметное крупное ядрышко. В цитоплазме сконцентрированы элементы гранулярной эндоплазматической сети, митохондрии со светлым матриксом и малым числом крист, первичные лизосомы. Некоторые эндотелиоциты содержат осмиофильные гетерогенные структуры - специфические тельца Weibel-Palade. В большинстве эндотелиоцитов встречаются прикрепленные микропиноцитозные везикулы, клатрин-окантованные везикулы, мультивезикулярные тельца, лизосомы, фенестры и поры, обеспечивающие транспорт веществ (Aird С.А., 2007). Для эндотелиоцитов характерна диплазматическая дифференцировка цитоплазмы. Она разделяется на эндоплазму, располагающуюся вокруг ядра и содержащую большую часть органелл и эктоплазму, относительно свободную от органелл (Быков В.Л., 1999). Цитоскелет эндотелиоцитов хорошо развит и представлен микротрубочками, микрофиламентами и виментиновыми промежуточными филаментами.
Выделяют апикальную, латеральную и базальную поверхности эндотелиоцитов. Базальная поверхность эндотелиоцитов прилежит к базальной мембране. На апикальной поверхности эндотелиальных клеток экспрессируются молекулы, участвующие в процессах роллинга и адгезии лейкоцитов.
Процесс мобилизации лейкоцитов в ткани состоит из этапов роллинга лейкоцитов по люминальной поверхности эндотелия, прочной адгезии к поверхности эндотелия и трансэндотелиальной миграции или диапедеза, миграции через базальную мембрану и хемотаксиса. Длительность всего процесса миграции лейкоцитов от этапа роллинга до этапа диапедеза in vivo составляет 15-45 минут, in vitro этот процесс занимает 2 минуты (Parish C.R., 2006).
Все стадии адгезии и трансмиграции зависят от активации эндотелиальных клеток и лейкоцитов, от усиления экспрессии на них адгезионных молекул. Для каждого этапа миграции клеток характерно участие определенных молекул адгезии и хемотаксических агентов.
Адгезия необходима для осуществления большинства функций моноцитов и макрофагов: миграции (хемотаксиса), мобилизации в ткани и продукции медиаторов воспаления, фагоцитоза, цитотоксичности, а также презентации антигена. Медиаторы воспаления активируют эндотелиальные клетки сосудов, на поверхности которых экспрессируются адгезионные молекулы. Активированные эндотелиальные клетки секретируют хемокины, которые привлекают циркулирующие лейкоциты и способствуют их адгезии к поверхности эндотелия с последующей миграцией.
Циркулирующие лейкоциты обычно вступают лишь в мимолетные контакты с эндотелиальными клетками: они как бы «скользят» (роллинг) по люминальной поверхности эндотелия стенки сосудов. Эти контакты опосредованы главным образом связыванием селектинов с соответствующими лигандами.
Селектины — трансмембранные белки, обладающие сродством к концевым остаткам маннозы и фукозы. В настоящее время к селектинам относят три гликопротеина: Р (от Platelet — тромбоцитарный), Е (от Endothelial — эндотелиальный) и L (от Lymphocyte — лимфоцитарный). В состав этих гликопротеинов входит 3 домена: наружный (лектиновый), промежуточный (подобный эпидермальному фактору роста), и несколько коротких консенсусных повторов, прилегающих к мембране (домены контроля комплемента). Число повторов варьируется у разных видов селектинов (Petri et al., 2008). Цитоплазматический участок селектинов связан с молекулами кальмодулина и актина (Fernandez-Borja et al., 2010). Для связывания селектинов с лигандами необходимо присутствие ионов Са2+ (Kerr, 1999).
Молекулы Р-селектина преформированы в секреторных гранулах эндотелиальных клеток (тельцах Weibel-Palade) и тромбоцитов (а-гранулах). После активации эндотелиальных клеток провоспалительными медиаторами (тромбин, лейкотриены, оксиданты, гистамин) молекулы Р-селектина экспрессируются на поверхности клетки и могут быть смыты с нее во внеклеточную среду. Кроме активации тромбоцитов, Р-селектин участвует в ранних этапах миграции лейкоцитов в очаг воспаления (Petri et al., 2008).
Характеристика супернатанта разрушенных 5. pyogenes
Для выделения мононуклеарных лейкоцитов использовали донорскую кровь, взятую из локтевой вены здоровых доноров обоих полов в возрасте от 18 до 50 лет (Отделение переливания крови, Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет им. акад. И.П. Павлова). В качестве антикоагулянта использовали препарат гепарина (20-25 ЕД на 1 мл крови). Разделение фракций гранулоцитов и мононуклеарных лейкоцитов проводили с помощью осаждения клеток на градиенте плотности фиколл-верографина («Биолот», Санкт-Петербург, РФ). Цельную кровь разводили в 2 раза в растворе Версена («Биолот», Санкт-Петербург, РФ), 10 мл разведенной крови наслаивали на 3,5 мл раствора фиколл-верографина и центрифугировали в горизонтальном роторе при 400g в течение 40 минут. Мононуклеарные лейкоциты (рис. 2.3) отбирали из интерфазного кольца, образовавшегося на границе смеси фиколл-верографин и разведенной крови, и отмывали 3 раза в растворе Хенкса («Биолот», Санкт-Петербург, РФ). Жизнеспособность клеток определяли с помощью окраски 0,2% раствором трипанового синего, количество клеток подсчитывали в камере Горяева. Доля моноцитов во взвеси мононуклеарных лейкоцитов составляла 10-20%. Мононуклеарные лейкоциты ресуспендировали в полной культуральной среде RPMI-1640 («Биолот», Санкт-Петербург, РФ) с добавками, без HAT или в среде RPMI-1640 с 2,5% содержанием сыворотки с добавками, без HAT В дальнейшем клеточную суспензию использовали для изучения взаимодействия моноцитов с эндотелиальными клетками линии ЕА.Ну 926.
Высушенный мазок помещали на 5 минут в неразведенный раствор эозината метиленового синего в метиловом спирте, после чего добавляли равное количество дистиллированной воды и окрашивали еще 10 минут. После окраски препарат ополаскивали дистиллированной водой и высушивали.
Высушенный и фиксированный (или окрашеный по Май-Грюнвальду) мазок помещали на 10 минут в свежеприготовленный раствор красителя (смесь азура II -эозина, разведенная в дистиллированной воде). После окраски мазок ополаскивали дистиллированной водой и высушивали.
Супернатант разрушенных стрептококков (СРС) был приготовлен из Streptococcus pyogenes серологической группы А (тип М22, штамм AL168) сотрудником отдела
_44 Молекулярной Микробиологии ФГБУ «НИИ Экспериментальной Медицины» СЗО РАМН д.м.н. Л.А. Буровой. Данный штамм был предоставлен Dr. Lindahl (Отдел лабораторной медицины Лундского Университета, Лунд, Швеция). В суточной культуре стрептококка количественными высевами контролировали концентрацию бактерий и доводили до стандартной 2,5 - 5,0 108 КОЕ/мл. Ультразвуковая дезинтеграция стрептококков проводилась в объеме 5 мл взвеси бактерий в забуференном физиологическом растворе при рН 7,0 трижды в течение 30 секунд при частоте 22 kHz и мощности 0,6-0,7 мА на дезинтеграторе (MSE, Великобритания). После центрифугирования при 14 000 об/мин супернатант подвергали стерилизации с использованием фильтров Filtropure S с размером пор 0,45 микрон («Sarstedt», Germany). В экспериментах использовали СРС в разведениях 1:25-1:2000. Все исследуемые концентрации были нетоксичны для клеток.
В работе использовали коммерческие препараты: рекомбинантного TNFa «Рефнолин» (специфическая активность 1ЕД - 0,06 нг) в концентрации 100 ЕД/мл, («Рефнолин», НПО «Фермент», «Sanitas», Литва) и форбол-12-миристат-13-ацетат (РМА) в концентрации 50 нг/мл ("Sigma" США).
Проводили посев эндотелиальных клеток линии EAhy 926 в 6-луночный планшет («Sarstedt», Австрия) из расчета 250 тыс клеток в лунку в 2 мл полной культуральной среды (ПКС) DMEM/F12 с добавками. Клетки инкубировали 24 часа во влажной атмосфере с 5% С02 при 37QC. После чего вносили СРС в разведении 1:25. Через 24 часа после 20 минутной экспозиции в растворе Версена («Биолот», Санкт-Петербург, РФ) содержимое каждой лунки собирали в микропробирки.
Для исследования интенсивности адгезии клеток линии ТНР-1 к монослою эндотелиальных клеток использовали метод, основанный на окраске внутриклеточного белка витальным флуоресцентным красителем carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) («Sigma», США). Предварительно эндотелиальные клетки культивировали в 96-луночном планшете до образования конфлюэнтного монослоя.
В некоторых случаях проводили 24-часовую преинкубацию в присутствии СРС и TNFa только клеток ТНР-1, только эндотелиальных клеток или клеток обеих линий.
После окончания преинкубации клетки линии ТНР-1 доводили до концентрации 10б клеток в 1 мл раствора Хенкса («Биолот», Санкт-Петербург) и окрашивали путем 10 минутной инкубации в растворе CFSE на PBS («Sigma», США) в концентрации 0,0005 мг/мл во влажной атмосфере при 37С с последующей отмывкой холодным раствором Хенкса («Биолот», Санкт-Петербург). Окрашенные клетки (в концентрации 150 тыс. в 100 мкл ПКС) вносили в лунки с эндотелиальными клетками. Одновременно вносили TNFa и СРС в исследуемых разведениях. Клетки инкубировали 1 час во влажной атмосфере с 5% СОг при 37С. После инкубации проводили трехкратную отмывку от неадгезировавших клеток раствором Хенкса («Биолот», Санкт-Петербург). После чего клетки лизировали при помощи лизирующего буфера (2М КОН на PBS). Интенсивность флюоресценции измеряли с помощью прибора Fluoroskan Ascent FL (Termoelectron Corporation, США) при длине волны 485 нм.
Для изучения механизмов адгезии клеток ТНР-1 к эндотелиальным клеткам в присутствии СРС проводили предварительную 16-часовую инкубацию клеток линии THP-1 с токсином коклюша («Sigma», США) в концентрации 25 нг/мл и 100 нг/мл. Для индукции экспрессии адгезионных молекул эндотелиальные клетки инкубировали в присутствии TNFa в концентрации 50 ЕД/мл в течение 24 часов. Далее эксперимент проводили согласно описанной методике (см. выше).
За 3 дня до опыта проводили посев эндотелиальных клеток EA.hy 926 в 12-луночный планшет («Nunc», Дания) из расчета 300 тыс. клеток в лунку в 2 мл полной культуральной среды DMEM/F12 с добавками. Клетки инкубировали во влажной атмосфере с 5% СОг при 37QC. В некоторых экспериментах после достижения конфлюэнтности монослоя за 4 часа до опыта в опытные лунки вносили СРС или TNFa. Через 4 часа проводили однократную отмывку эндотелиальных клеток раствором Хенкса («Виолот», Санкт-Петербург, РФ), после чего в лунки вносили суспензию мононуклеарных лейкоцитов из расчета 2 млн. клеток в 2 мл полной культуральной среды DMEM/F12 с добавками без HAT и исследуемые вещества и инкубировали в течение 1 часа.
После часовой инкубации при 37QC во влажной атмосфере с 5% СОг неадгезировавшие клетки удаляли двукратной отмывкой теплым раствором Хенкса («Биолот», Санкт-Петербург, РФ). Содержимое каждой лунки собирали путем 20 минутной экспозиции в растворе Версена («Биолот», Санкт-Петербург, РФ) и помещали в микропробирки. Клетки осаждали центрифугированием, надосадок удаляли, проводили однократную отмывку клеток в PBS, содержащим 0,1% NaN3 («Helicon», Москва, РФ).
Оценку количества адгезировавших моноцитов проводили с помощью проточного цитофлуориметра Epics Altra фирмы «Beckman Coulter» с использованием моноклональных антител против поверхностной молекулы CD14 («Beckman Coulter» США), меченых FITC. Проводили выделение мононуклеарных лейкоцитов в координатах прямого и бокового светорассеяния (рис. 2.5).
Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на трансэндотелиальную миграцию клеток линии ТНР-1
Распознавание консервативных структур бактерий с помощью PRR на поверхности эукариотических клеток запускает сигнальный каскад, приводящий к фосфорилированию транскрипционного фактора NF-KB И последующей активации клеток. Проводили исследование изменений уровня экспрессии фосфо-NFKB в клетках ТНР-1 в присутствии СРС методом проточной цитометрии с использованием мАт против фосфо-NFKB, меченых Alexa Fluor 488. В качестве стандартного индуктора использовали TNFa. Под влиянием TNFa уровень экспрессии фосфо-NFKB достоверно повышался (рис. 3.5, табл. 3.6).
Уровни экспрессии фосфо-NFKB клетками моноцитоподобной линии ТНР-1 Серым цветом показан контроль изотипических антител, зеленым - спонтанная экспрессия, красным - экспрессия в присутствии СРС 1:50.
Супернатант разрушенных S. pyogenes не оказывал влияния на экспрессию фосфо-NFKB в клетках линии ТНР-1 (табл. 3.6). Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на адгезию клеток линии ТНР-1 (интактных и преинкубированных с токсином коклюша) к эндотелиальным клеткам
Большинство эндогенных хемоаттрактантов и хемоаттрактанты бактериального происхождения взаимодействуют с клеткой через рецепторы, связанные с G-белками (G-protein-coupled receptors, GPCR) (Penela et аі., 2014, Bokoch M.G., 1995, Mantovani et al., 1997). Одним из ингибиторов сигнала от GPCR является токсин коклюша. Он катализирует ADP-рибозилирование а-субъединицы G-белка, в результате чего активация G-белка не происходит (Munoz and Afi, 1985; Fabbri et al., 1999). Изучали зависимость адгезионной активности, интенсивности миграции и трансмиграции клеток линии ТНР-1 в присутствии СРС после их 16-часовой преинкубации в присутствии токсина коклюша.
Интенсивность адгезии клеток ТНР-1, окрашенных CFSE, к монослою эндотелиальных клеток оценивали с помощью прибора Fluoroskan Ascent FL. Как было показано ранее, под влиянием СРС достоверно усиливается адгезия интактных клеток ТНР-1 к эндотелиальным клеткам по сравнению с их спонтанной адгезией (табл. 3.1, 3.7). После преинкубации клеток ТНР-1 с токсином коклюша их спонтанная адгезия к эндотелию была достоверно ниже, чем спонтанная адгезия к эндотелию интактных ТНР-1 (табл. 3.7).
В присутствии компонентов стрептококка адгезионная активность преинкубированных с токсином клеток линии ТНР-1 была достоверно ниже, чем адгезионная активность интактных клеток (табл. 3.7). Адгезия преинкубированных с токсином клеток ТНР-1 в присутствии СРС достоверно не отличалась от спонтанной адгезии этих клеток.
Трансэндотелиальная миграция клеток ТНР-1 (интактных и преикубированных с токсином коклюша). (а) спонтанная миграция интактных клеток, (б) миграция интактных клеток в присутствии супернатанта разрушенных S. pyogenes (1:50) в нижней камере; (в) спонтанная миграция преинкубированных с токсином клеток, (г) миграция преинкубированных с токсином клеток в присутствии супернатанта разрушенных S. pyogenes (1:50) в нижней камере. СРС оказывал стимулирующее влияние на трансэндотелиальную миграцию клеток моноцитоподобной линии ТНР-1. Это согласуется с полученными ранее данными в табл. 3.3. Спонтанная трансэндотелиальная миграция преинкубированных с токсином коклюша клеток ТНР-1 была достоверно ниже, чем спонтанная трансмиграция интактных клеток (табл. 3.8).
Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на интенсивность миграции интактных и преинкубированных с токсином коклюша клеток линии ТНР-1
Под влиянием компонентов стрептококка наблюдалось статистически значимое усиление направленной миграции интактных клеток линии ТНР-1 по сравнению со спонтанной миграцией этих клеток (табл. 3.9). Это согласуется с полученными ранее данными в п. 3.2.1.3 (табл. 3.4).
Обобщая полученные данные, можно заключить, что преинкубация клеток ТНР-1 с токсином коклюша приводила к снижению адгезионной активности этих клеток, а так же к снижению спонтанной и индуцированной продуктами разрушения S. pyogenes миграции и трансэндотелиальной миграции этих клеток.
Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на адгезию моноцитов крови человека к монослою эндотелиальных клеток
Начальным этапом процесса трансэндотелиальной миграции лейкоцитов в субэндотелиальное пространство является их адгезия к эндотелию сосудов. Для оценки влияния СРС на этот этап проводили серию экспериментов по адгезии моноцитов крови к монослою эндотелиальных клеток. Для этого проводили подсчет количества адгезировавших СБ14+-клеток в образцах методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител против CD14, меченных FITC (рис. 2.5, рис 3.8.). В качестве стандартного индуктора использовали провоспалительный цитокин TNFa. В наших экспериментах в присутствии TNFa адгезия моноцитов к эндотелиальным клеткам усиливалась в два раза по сравнению с контролем (табл. 3.10).
Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на миграцию интактных и преинкубированных с токсином коклюша моноцитов крови человека
В присутствии супернатанта разрушенных стрептококков происходило усиление адгезии моноцитов крови. При этом преинкубация эндотелиальных клеток с СРС не оказывала влияния на адгезию к ним моноцитов. В то же время СРС повышал адгезионную активность самих моноцитов. Это позволяет предположить, что наблюдаемое усиление адгезии клеток в присутствии СРС было связано с изменением свойств самих моноцитов, а не эндотелиальных клеток.
В наших экспериментах в присутствии СРС экспрессия адгезионных молекул на эндотелиальных клетках не изменялась, а на моноцитах - менялась разнонаправленно. Также СРС не оказывал влияния на экспрессию фосфо-NFKB моноцитами и эндотелиальными клетками. Следовательно, как и в случае клеток ТНР-1, мы не могли объяснить усиление адгезии моноцитов к эндотелию изменением экспрессии адгезионных молекул на клетках.
В данном исследовании СРС усиливал экспрессию фосфо-р38 на моноцитах. Из литературы известно, что киназа р38 МАРК опосредованно регулирует процессы адгезии и трансмиграции лейкоцитов. Активация р38 МАРК повышает Е-селектин-опосредованную адгезию лейкоцитов к клеткам, экспрессирующим Е-селектин и ICAM-1 (Stadtmann et al. 2012; Herter and Zarbock, 2013). Результаты наших экспериментов свидетельствуют в пользу того, что под влиянием СРС происходит активация моноцитов, и фосфорилирование р38 МАРК может вносить вклад в усиление адгезии моноцитов к эндотелиальным клеткам.
На миграцию моноцитов крови СРС оказывал разнонаправленное действие. При низких концентрациях СРС наблюдалось достоверное усиление миграции моноцитов по сравнению с контролем. При повышении концентрации СРС эффект менялся на противоположный. Это говорит в пользу того, что в составе супернатанта разрушенных стрептококков присутствует фактор, проявляющий хемоаттрактантные свойства. Согласно литературным данным, одно и то же вещество, в зависимости от концентрации, может оказывать разнонаправленное действие на миграцию лейкоцитов: в низких концентрациях может выступать в качестве хемоаттрактанта, а при высоких концентрациях - действовать как хеморепеллент (Huttenlocher and Poznansky 2008; Tharp etal. 2006; Penela etal., 2014).
В литературе есть данные об иерархии внутриклеточных сигналов в ответ на различные хемоаттрактанты (Heit etal. 2002). Так, например, сигналы от «целевых» (endarget) хемоаттрактантов (например, fMLP, С5а), которые локализуются в участках инфекции, доминируют над сигналами от «хемоаттрактантов-посредников» (например, IL-8, LTB4). Показано, что ответы на эти хемоаттрактанты различны: сигналы от «посредников» РІЗК/АЙ-зависимьі, в то время как «целевые» хемоаттрактанты индуцируют активацию р38 МАРК (Heit et al. 2002). В наших экспериментах в присутствии СРС повышался уровень фосфорилирования р38 МАРК в моноцитах. Активация этой киназы может также свидетельствовать в пользу того, что усиление миграции моноцитов главным образом обусловлено действием «целевого» хемоаттрактанта в составе СРС.
Токсин коклюша снижал индуцированную СРС миграцию моноцитов крови до спонтанного уровня. Чувствительность к токсину доказывает, что влияние СРС на миграцию моноцитов было опосредовано взаимодействием GPCR на моноцитах с хемоаттрактантом в составе СРС.
По интенсивности миграции моноцитов крови к СРС в разведении 1:50 доноры разделились на две группы. У 25% доноров наблюдали повышение миграции моноцитов к СРС, в то время как у 75% доноров миграция в тех же условиях снижалась.
Разнонаправленность изменений миграции моноцитов в присутствии СРС можно объяснить различиями чувствительности моноцитов разных доноров к компонентам в составе супернатанта.
Принимая во внимание, что под влиянием СРС происходит усиление адгезии моноцитов крови к эндотелиальным клеткам и усиление их миграционной активности, парадоксальным представляется выявленное в данной работе подавление трансэндотелиальной миграции моноцитов в присутствии компонентов стрептококка в нижней камере. Это можно объяснить тем, что в используемой модели взаимодействия моноцитов и эндотелиальных клеток, в присутствии СРС секретируются факторы, ингибирующие трансмиграцию моноцитов.
Молекула VCAM-1 участвует не только на этапе прочной адгезии лейкоцитов к эндотелиальным клеткам, но и на этапе трансэндотелиальной миграции (Lee etal. 2012). о Рі-интегриньї связываются с 1 и 4 Ig-подобными доменами молекулы VCAM-1. Однако в литературе есть данные, что 6 Ig-подобный домен VCAM-1 так же участвует в процессе трансмиграции. Показано, что связывание специфичных к 6 Ig-подобному домену антител (VCAM-1-D6) с соответствующим доменом на VCAM-1 эндотелиальных клеток блокирует трансэндотелиальную миграцию лейкоцитов. При этом VCAM-1-D6 не снижает адгезию лейкоцитов к эндотелию и не влияет на TNFa-стимулированную продукцию цитокинов и хемокинов эндотелиальными клетками (Lee et аі. 2012). Нельзя исключать, что какой-либо компонент СРС обладает подобной активностью в используемой нами модели.
В наших экспериментах СРС индуцировал секрецию провоспалительных цитокинов TNFa, IL-6 и IL-8 мононуклеарными лейкоцитами крови. Согласно литературным данным IL-8 усиливает адгезию моноцитов, вызывая конформационные изменения Рг-интегринов (Ма et аі., 2004; Yang et al. 2005). IL-6 индуцирует секрецию MCP-1 и IL-8 эндотелиальными клетками, тем самым оказывая косвенное влияние на миграцию лейкоцитов (Kaplanski et al. 2003). Кроме того, в литературе есть данные, о том что под влиянием IL-6 происходит активация Рі-интегринов, усиливается полимеризация актина и адгезия моноцитов к эндотелиальным клеткам (Clahsen and Schaper 2008). Нельзя исключать, что влияние СРС на функции моноцитов может быть также связано с влиянием провоспалительных цитокинов, секретируемых как самими моноцитами, так и присутствующими в системе лимфоцитами, хотя, как показано выше, механизмы влияния продуктов деградации S. pyogenes и провоспалительного цитокина TNFa на процессы адгезии и миграции мононуклеарных фагоцитов были различны.
Также следует учитывать, что присутствующие в системе лимфоциты могут оказывать влияние на активацию моноцитов и выявленные изменения их функций в присутствии супернанта разрушенных стрептококков. Из литературы известно, что суперантигенные экзотоксины стрептококков активируют лимфоциты крови человека (Taylor et al., 2011, Chatellier and Kotb, 2000), индуцируют их пролиферацию (Eriksson and Norgren, 1999; Sriskandan et al., 1996) и продукцию цитокинов IL-6, IL-10, IL-12 и IFN-y этими клетками (Klinman etal., 1996; Taylor etal., 2011).
Первоначально в качестве модели мононуклеарных фагоцитов нами были выбраны клетки перевиваемой моноцитоподобной линии ТНР-1, свойства которых подробно изучены и во многом близки к моноцитам крови человека (Cleveland etal. 1996; Kawakami et al. 2007; Goda et al. 2000; Yu et al. 2003). Эти клетки предоставляли ряд технических преимуществ при разработке использованных методических подходов. Однако мы отдавали себе отчет, что клетки ТНР-1, как и клетки других перевиваемых линий, несут черты злокачественно трансформированных клеток. Также нельзя исключать, что эффект СРС на функции моноцитов крови опосредован влиянием продуктов, секретируемых присутствующими в системе активированными лимфоцитами.
