Введение к работе
Актуальность исследования. Гранулоцитарный анаплазмоз человека (ГАЧ) и моноцитарный эрлихиоз человека (МЭЧ) – это острые трансмиссивные инфекционные заболевания, переносимые клещами. Возбудители данных инфекций Anaplasma phagocytophilum (для ГАЧ), Ehrlichia chaffeensis и Ehrlichia muris (для МЭЧ) в течение последних 15-20 лет обнаружены в разных видах иксодовых клещей во многих странах Европы и Азии, в России, Корее, Китае, Японии, США и Африке (Коренберг, 1999; Сидельников, 2003; Aguero-Rosenfeld, 1996; Alekseev, 2001; Anderson, 1991; Arnez, 2001; Bakken, 1996; Bjoersdorff, 2002; Brouqui, 1999; Buller, 1999; Cao, 2000, 2003; Dawson, 1991; Dumler, 1991; Inokuma, 2004; Karlsson, 2001; Kim, 2003; Liz, 2000; Ogden, 1998; Parola, 2001; Petrovec, 2002; Raoult, 1996; Rar, 2005; Wen, 1995; Tylewska-Wierzbanowska, 2001).
В России эти заболевания выявлены относительно недавно (Ravyn, 1999; Рудаков, 2001, 2002; Сидельников, 2003), изучены недостаточно и до сих пор не зарегистрированы как нозологические формы. Диагностика ГАЧ и МЭЧ проводится лишь в некоторых субъектах РФ. В то же время там, где осуществляется комплексная лабораторная диагностика заболеваний, переносимых клещами, эти инфекции выявляются достаточно часто (Афанасьева, 2006, 2007; Оберт, 2009; Рудаков, 2006; Tkachev, 2008; Фоменко, 2007; Щучинова, 2009).
На территории Иркутской области сложились все биоценотические предпосылки для существования очагов ГАЧ и МЭЧ. Известно, что эти заболевания могут протекать под маской «лихорадок неясной этиологии». В Иркутской городской инфекционной больнице ежегодно доля таких сезонных лихорадок, возникших у больных после присасывания клещей, достигает 15%. В связи с этим, актуальным является проведение поисковых исследований по изучению распространения очагов МЭЧ и ГАЧ на территории Иркутской области, установлению спектра переносчиков и резервуарных хозяев возбудителей этих заболеваний и выявлению их роли в региональной инфекционной патологии.
В научной литературе большое внимание уделяется генетической вариабельности эрлихий и анаплазм. С помощью молекулярно-генетических методов были обнаружены новые генетические варианты эрлихий, филогенетически сходные с E. chaffeensis (Cao, 2006; Inokuma, 2004; Wen, 2002). В Японии и на территории Евразии были обнаружены ранее неизвестные бактерии «Candidatus Neoehrlichia mikurensis», образующие отдельный филогенетический кластер в семействе Anaplasmataceae и играющие роль в патологии человека (Kawahara, 2004). К этому кластеру относятся также бактерии, выявленные в клещах и грызунах, данные о патогенности которых для теплокровных на сегодняшний день отсутствуют (Шпынов, 2004; Pan, 2003; Schouls, 1999; Shpynov, 2006). В связи с этим необходимо проведение исследований по установлению потенциальной опасности заражения людей новыми бактериями семейства Anaplasmataceae на территории Иркутской области.
Чрезвычайно важным является то, что очаги разных клещевых инфекций накладываются друг на друга. Возможность одновременного присутствия в организме клеща нескольких патогенов может приводить к возникновению микстформ заболевания. Вместе с тем, на сегодняшний день нет четких представлений о степени сочетанности природных очагов клещевых инфекций на территории Иркутской области, спектре возбудителей, разнообразии сочетаний патогенов при коинфицировании ими переносчика. Методы детекции одновременно нескольких патогенов в одной особи переносчика практически отсутствуют.
Цель работы. Установить широту распространения и генетическое разнообразие представителей семейства Anaplasmataceae в природных очагах Иркутской области, разработать предложения по совершенствованию системы микробиологического мониторинга за возбудителями трансмиссивных клещевых инфекций в сочетанных природных очагах.
Задачи исследования:
1. Оценить зараженность иксодовых клещей и мелких млекопитающих, собранных на территории различных районов Иркутской области, E. muris и A. phagocytophilum, а также недавно обнаруженными бактериями семейства Anaplasmataceae.
2. Провести ретроспективное тестирование образцов крови, полученных от людей с лихорадкой неясной этиологии или укусом клеща в анамнезе на наличие IgM и IgG к возбудителям МЭЧ и ГАЧ.
3. Изучить генетическое разнообразие эрлихий и анаплазм, инфицирующих популяции иксодовых клещей и мелких млекопитающих на территории Иркутской области.
4. С помощью комплекса методов провести исследование переносчиков и резервуарных хозяев одновременно на несколько патогенов и выявить возможные сочетания возбудителей в микстинфицированных клещах.
5. Разработать предложения по совершенствованию системы микробиологического мониторинга за возбудителями трансмиссивных клещевых инфекций в сочетанных природных очагах Иркутской области.
Научная новизна. Установлено широкое распространение на территории Иркутской области очагов МЭЧ и ГАЧ с циркуляцией в них E. muris и A. phagocytophilum. Выявлена циркуляция нового представителя семейства Anaplasmataceae – «Candidatus Neoehrlichia mikurensis». Показано, что очаги МЭЧ и ГАЧ приурочены ко всем типам ландшафта – от горно-таежных до степных.
Получена новая информация об инфицированности разных видов иксодовых клещей возбудителями МЭЧ и ГАЧ и о степени их участия в циркуляции бактерий семейства Anaplasmataceae в природных очагах Иркутской области.
Впервые установлены потенциальные резервуарные хозяева E. muris и A. phagocytophilum на территории Иркутской области, к которым могут быть отнесены: M. oeconomus, M. rutilus, M. gregalis и Sorex spp.
Ретроспективное исследование сывороток крови людей с укусом клеща в анамнезе позволило выявить случаи инфицирования возбудителями МЭЧ и ГАЧ, а также возможность микстинфицирования эрлихиями и анаплазмами в сочетании с боррелиями и/или вирусом КЭ.
Определены различия по генетической вариабельности представителей семейства Anaplasmataceae, циркулирующих на территории Иркутской области. Установлено, что нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК и groESL оперона у образцов E. muris, выявленных в таежных клещах, строго консервативны, а у A. phagocytophilum – высоковариабельны. На основании анализа последовательности гена 16S рРНК выявлено четыре варианта A. phagocytophilum, объединенные на основе анализа groESL оперона в две генетические группы.
Получены новые данные о спектре возбудителей клещевых инфекций и их возможных сочетаниях при микстинфицировании иксодовых клещей. Доказана возможность инфицирования переносчиков двумя и более видами возбудителей одновременно, что свидетельствует о высокой степени сочетанности очагов разных клещевых инфекций в Иркутской области.
Разработаны предложения по совершенствованию микробиологического мониторинга за циркуляцией возбудителей клещевых инфекций в сочетанных природных очагах за счет внедрения современных молекулярно-генетических методов.
Практическая значимость. Обосновано введение в систему эпизоотолого-эпидемиологического надзора микробиологического мониторинга за всем спектром клещевых патогенов, обнаруженных на территории Иркутской области. Апробирована мультиплексная ПЦР в режиме реального времени для одновременной детекции в переносчиках четырех возбудителей (вирус клещевого энцефалита, боррелии, анаплазмы, эрлихии). Определена ее диагностическая и экономическая ценность для микробиологического мониторинга за возбудителями клещевых инфекций.
Данные, полученные в ходе микробиологического мониторинга, могут быть использованы при составлении прогноза развития эпидемиологической ситуации в отношении клещевых инфекций на территории Иркутской области и для разработки эффективных предупредительных мероприятий в сочетанных природных очагах.
В международную электронную базу данных GenBank депонировано 35 нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК и groESL оперона A. phagocytophilum, 5 нуклеотидных последовательностей E. muris и 8 нуклеотидных последовательностей «Candidatus Neoehrlichia mikurensis».
Апробация работы. Основные результаты исследований по теме диссертации были представлены: на Всероссийской конференции «Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита» (Москва, 2007), международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы зоонозных инфекций» (Улан-Батар, 2008), Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых инфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008), международной научной конференции “Zoonotic infectious diseases and tourism” (Ulaanbaatar, 2009), научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора и профилактики особо опасных и природно-очаговых болезней» (Иркутск, 2009), Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные проблемы природной очаговости болезней» (Омск, 2009), Пленуме научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития Российской Федерации (Москва, 2009), X International Jena Symposium on Tick-borne Diseases (Иена, Германия, 2009), II Национальной конференции с международным участием «Нейроинфекции. Современные аспекты клещевых инфекций» (Екатеринбург, 2010), региональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии» (Иркутск, 2010), IX Республиканском съезде эпидемиологов, гигиенистов, санитарных врачей и инфекционистов Узбекистана (Ташкент, 2010), XI International Jena Symposium on Tick-borne Diseases, (Иена, Германия, 2011), итоговой научно-практической конференции с международным участием «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири» (Красноярск, 2011), Всероссийской конференции с международным участием «Современные аспекты природной очаговости болезней» (Омск, 2011), Х съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации» (Москва, 2012), международной научной конференции «Клещевой энцефалит и другие инфекции, переносимые клещами» (Листвянка-Иркутск, 2012), XII International Jena Symposium on Tick-borne Diseases (Weimar, Германия, 2013), Российской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы клещевого энцефалита» (Москва, 2013).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. На территории Иркутской области широко распространены очаги моноцитарного эрлихиоза и гранулоцитарного анаплазмоза человека с циркуляцией в них E. muris, A. phagocytophilum и «Candidatus Neoehrlichia mikurensis».
2. Основным видом переносчика бактерий семейства Anaplasmataceae на территории Иркутской области является клещ I. рersulcatus, а клещи H. concinna и D. nuttalli играют дополнительную роль. Потенциальными резервуарными хозяевами эрлихий и анаплазм на территории Иркутской области являются мелкие млекопитающие M. oeconomus, M. gregalis, M. rutilus и Sorex spp.
3. Представители семейства Anaplasmataceae, циркулирующие а природных очагах Иркутской области, значительно различаются по степени генетической вариабельности. Нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК и groESL оперона у E. muris и «Candidatus Neoehrlichia mikurensis» строго консервативны, а у A. phagocytophilum – высоко вариабельны.
4. Совершенствование микробиологического мониторинга за циркуляцией возбудителей клещевых инфекций в сочетанных природных очагах возможно за счет комплексного подхода к исследованию и использования современных молекулярно-генетических методов.
Публикации результатов. По теме диссертации опубликовано 24 научных работы, в том числе: 10 работ в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ и 1 методическое пособие.
Личный вклад автора. Автором проведена информационная проработка темы исследования, выполнен сбор, анализ и обобщение материалов, сделаны выводы. Доли личного участия автора составляют: в получении и накоплении научной информации – 70%, в обобщении, анализе, интерпретации материалов – 100%.
Структура и объем диссертационной работы.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 140 страницах, иллюстрирована 7 рисунками и 13 таблицами. Библиографический указатель содержит 211 источников, из которых 92 работы отечественных и 119 зарубежных авторов.
