Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 8
1.1.Общая характеристика болезни 8
1.2. Общая характеристика возбудителя болезни 9
1.3. Эпидемиология листериоза 13
1.4. Некоторые особенности эпизоотологии листериоза 23
1.5. Диагностика листериоза 28
1.6. Фагоиндикация бактерий и фаготипирование 30
1.7. Генетические методы идентификации 36
II. Собственные исследования 43
2.1. Материалы и методы 43
2.2. Результаты собственных исследований 45
2.2.1. Распространение листериозной инфекции на территории Ульяновской области за 1985-2002 гг 45
2.2.2. Анализ эпизоотологических показателей листериозной инфекции по Ульяновской области 47
2.2.3. Разработка ускоренной схемы бактериологического исследования по индикации листерий 54
2.2.4. Разработка схемы индикации листерий методом РНФ с помощью смеси фагов L 2А и L 4А 59
2.2.5. Определение чувствительности ПЦР - анализа на культуре L.monocytogenes, в клиническом материале, объектах окружающей среды для изучения ареала распространения листерий 63
2.2.6. Результаты ПЦР - анализа в населенных пунктах Ульяновской области 75
2.2.7. Сравнение различных методов исследования по индикации листерий 79
2.3. Обсуждение 92
Выводы 106
Практические предложения 107
Список использованных литературных
Источников 108
Приложения 125
- Общая характеристика возбудителя болезни
- Фагоиндикация бактерий и фаготипирование
- Анализ эпизоотологических показателей листериозной инфекции по Ульяновской области
- Результаты ПЦР - анализа в населенных пунктах Ульяновской области
Введение к работе
Актуальность работы
Листерии широко распространены в окружающей среде. Они выделяются из почвенных и водных экосистем, из объектов внешней среды, циркулируют в организме диких, домашних, сельскохозяйственных животных и вызывают развитие листериоза у них и человека (Бакулов, Васильев, 1995). В связи с этим закономерно то пристальное внимание, которое в последнее десятилетие привлечено к листериозной инфекции. Вместе с тем до настоящего времени в России не ясны ни истинный уровень заболеваемости листе-риозом, ни ее структура и динамика (Тартаковский, 2002). Это объясняется, с одной стороны, отсутствием ряда нормативных документов в ветеринарной и медицинской службе по индикации микроорганизма и контролем за листе-риозом, с другой - несовершенством существующих методов индикации и их обилием, не прошедшим аттестацию и рекомендацию для применения.
Цель исследования. Разработка и сравнительная оценка методов выявления листерии по показателям их индикации в объектах внешней среды, пищевых продуктах.
Задачи исследования:
Выявить ареалы распространения листерии в Ульяновской области .
Определить и использовать оптимальные методы индикации листерии для изучения распространения данного микроорганизма, включающие бактериологические методы, реакцию нарастания фага, полимеразную цепную реакцию.
3. Определить эффективность предложенной тест-системы «Листер»
по сравнению с другими методами исследования на выявление возбудителя
листериозной инфекции, что позволит рекомендовать ее в качестве метода
индикации листерии и диагностического метода на листериоз.
5 Научная новизна
Впервые проведен анализ распространения на территории Ульяновской области листериозной инфекции и выявлены ареалы нахождения листерий за последние 20 лет.
Апробирована схема бактериологического исследования материала, позволяющая в короткие сроки с минимальными затратами получить данные по контаминации листериями объектов окружающей среды, пищевых продуктов.
Рекомендовано для целей индикации листерий использовать смесь фагов L 2А и L 4А.
Доказана высокая сохранность гена гемолизина листерий, что является основанием для вывода о целесообразности его использования в качестве гена-мишени для скринингового исследования материалов из окружающей среды на наличие листерий. Получены данные, свидетельствующие о высокой эффективности ПЦР для индикации листерий по сравнению с бактериологическими методами исследования, РНФ, что позволяет рекомендовать ее и в качестве диагностического метода исследования.
Практическая значимость работы
Разработана тест-система «Листер» и подготовлены НТД - ТУ 9388-034-00008064-99 на указанную тест-систему «для выявления и идентификации Listeria monocytogenes методом полимеразной цепной реакции» и наставление по применению указанной тест-системы, утверждённые Департаментом ветеринарии МСХ РФ 7 июля 1999 года. Чувствительность тест-системы составила 10 бактериальных клеток в 1 мл и предназначена для выявления фрагмента ДНК Listeria monocytogenes в пищевых продуктах, объектах внешней среды, патологическом материале от сельскохозяйственных животных, не иммунизированных живыми противолистериозными вакцинами, а также от диких животных, грызунов, птиц, клещей.
Создан кадастр по листериозу Ульяновской области, на основании
которого проведён анализ распространения листериоза и даны практические рекомендации Ульяновскому областному управлению ветеринарии и Ульяновскому государственному центру санитарно - эпидемиологического надзора по профилактике данной инфекции.
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:
Установление ареала листерий на территории Ульяновской области.
Оптимальная схема бактериологической индикации листерий.
Использование РНФ со смешанными группами фагов для индикации листерий.
4.Сохранность гена гемолизина листерий, что явилось основанием использования гена гемолизина Listeria monocytogenes в качестве мишени для скринингового исследования материала на наличие фрагмента ДНК листерий.
5. Эффективность ПЦР по сравнению с бактериологическими методами исследования и РНФ.
Апробация работы
Основные положения работы доложены и обсуждены на научных конференциях профессорско-преподавательского состава УГСХА за 1995-2003 год; межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 80-летию Омского НИИПИ (Омск, 2001); Всероссийской научной конференции ВГНКИ (Москва, 2001); в двух комиссионных испытаниях проведённых по заданию Департамента ветеринарии МСХ РФ и утверждены директором ВНИИЗЖ в декабре 1998 года и апреле 1999 года, а также в комиссионных испытаниях в УГСХА, утверждённые ректором в 2002 г.
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии, в соответствии с плановыми темами
7 научно-исследовательской работы кафедры: «Разработка методов индикации малоизученных пищевых зооантропонозов» и «Создание кадастров природ-но-очаговых, зооантропонозных инфекций на территории Ульяновской области».
Публикации
По теме диссертации опубликовано 8 публикаций.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы (204 источников, в том числе 68 отечественных). Работа иллюстрирована 17 таблицами, 15 рисунками и дополнена приложениями.
Общая характеристика возбудителя болезни
Листериоз — зооантропонозная болезнь животных и человека, характеризующаяся поражением нервной системы, септическими явлениями, абортами и маститами. Пристальное изучение листериоза и его возбудителя началось после публикации в 1926 году Е. Murray, R. Webb, М. Swann работы о вспышке новой инфекционной болезни морских свинок и кроликов в питомнике Кембриджского университета и сообщении J. Рігіе в 1927 году (Ю. Африка) об инфекционной болезни степных грызунов - «Tiger river disease» (болезни реки Тигр). Однако ещё в 1891 году М. Наует во Франции и в 1893 L. Henlie в Германии наблюдали грамположительные палочки в срезах тканей пациентов погибших от болезни, которая ретроспективно была определена как листериозная инфекция. В 1892 году Lucent описал септическую болезнь кроликов, выделив бактериальную культуру, идентичную листериозной палочке. В 1911 году шведский ученый G. Hulphers выделил из гнойного узелка печени павшего кролика маленькую грамположительную палочку, похожую по описанию на листериоз-ную. В 1917 году австралийский врач Е. Atkinson сообщил о небольшой эпидемии менингита, вызванной грамположительной бациллой дифтероидного типа. Однако зачастую это всё была описательная информация. Первая хорошо сохранившаяся лабораторная культура листерий выделена J. Dumont, L. Cotoni в 1921 году из спинномозговой жидкости солдата, больного менингитом. Она через 20 лет хранения в Пастеровском институте была идентифицирована J. Paterson. Каждый из исследователей самостоятельно давал обнаруженной бактерии родовое и видовое название. И только после работ Е. Murray, R. Webb, М. Swann (1926), когда была установлена идентичность выделенной ими бактериальной культуры, было дано официально признанное название рода Listerella и вида monocytogenes. В 1940 году родовое название изменили на Listeria. Установлено, что листериоз поражает людей, многие виды домашних и диких животных, а также птиц. Есть сообщения о выделении листерий у рыб, раков, лягушек, некоторых видов клещей, блох, вшей, личинок оводов (Бакулов, 1967). L.monocytogenes - это неспорообразующие, короткие палочки, правильной формы, диаметром 0,4-0,5 мкм и длинной 0,5-2,0 мкм с закруглёнными концами. Иногда встречаются клетки с слегка изогнутыми концами. Расположены в мазках либо по одиночке, либо в коротких цепочках, возможно в виде частокола или же римской буквы V. При микроскопии листерий в мазках можно увидеть их групповое расположение, параллельное, вдоль длинной оси. В мазках из инфицированного патологического материала или из жидкой среды встречаются листерий кокковой формы диаметром 0,4-0,5 мкм и длиной 0,4-0,6 мкм. Они могут быть ошибочно приняты за стрептококки. В более зрелых или необработанных культурах могут встречаться формы в виде волокон длинной до 6-20 мкм. Окраска по Граму положительная. Но в старых культурах теряют способность к сохранению окраски по Граму. Не кислотоустойчивы, споры не образуют. C.Smith, J.Metzger (1962) сообщили о наличии мукополисахаридной капсулы у листерий, однако другие исследователи, в частности, H.Seeliger (1968) не подтвердили этого факта. Листериозная палочка во время культивирования при комнатной температуре всегда подвижна. При температуре +37С жгутики, как правило, не образуются и листерий оказываются неподвижны. Листериозная культура данного вида является аэробной и факультативно анаэробной. Температурный диапазон роста от +1 до +44С. Однако культура остаётся жизнеспособной и при более высоких температурах (до 70-71 С). Температурный оптимум 25-37С. Листерий способны расти и размножаться в диапазоне рН от 6 до 9, но сохраняют свою жизнеспособность при величине рН 5-11. Оптимальные условия роста при рН 7,0-7,4 суточный рост листерий проявляется в виде росинчатых колоний. В аэробных условиях, на питательном агаре при оптимальном температурном диапазоне, 24-48-часовые листериозные колонии имеют диаметр 0,5-1,5 мм, круглые, полупрозрачные в виде капли, выпуклые с ясно очерченной поверхностью и сплошной гранью. При обычном освещении колонии обладают серо-голубоватым цветом. Размер 3-7-дневных колоний достигает диаметра 3-5,5 мм с непрозрачным центром и неправильной формы. В полужидкой среде 0,25%-ного агара суточный рост идёт вдоль укола. В МПБ рост идёт медленно, но через 28-48 часов появляется нежное, опалесцирующее помутнение. Через 7 дней на дне пробирки образуется осадок, который при встряхивании образует поднимающуюся вверх косичку. Бактерии обладают гемолитической активностью. Слабая или едва уловимая - гемолитическая активность может быть усилена использованием САМР-теста. Листериозная культура в большинстве случаев является каталазоположительной и оксидазоотрица-тельной, но необходимо учитывать, что если питательные среды содержат низкие концентрации мясного или дрожжевого экстракта, то возможна отрицательная каталазная реакция. Активность каталазы подавляется и на средах, содержащих высокую (более 10%) концентрацию глюкозы. Реакция с метилротом и Фогес-Проскауера положительная. Листерии не разжижают желатин, не гид-ролизуют казеин и малонат. Индол не продуцируют, на обычных питательных средах не образуют сероводород. Метаболизм Сахаров сопровождается образованием кислоты, но не газа. Листерии могут расти в сложных средах, содержащих до 20% NaCl. При 16% содержания поваренной соли (рН - 6,0) остаются жизнеспособными в течение года. Необходимо отметить, что хотя вышеперечисленные свойства листерии достаточно типичны, но возможны изменения, связанные с определёнными питательными средами и выделения новых штаммов листерии. Нельзя забывать и о других видах листерии, характеристика которых приведена в таблице 1.
Фагоиндикация бактерий и фаготипирование
Если роль бактериофага, как средства терапии и профилактики некоторых инфекционных заболеваний, в настоящее время невелика, то в лабораторной диагностики ряда инфекции этот биологический объект не только не утратил своего значения, а, наоборот, начал привлекать к себе всё более пристальное внимание исследователей. С каждым годом повышается значимость бактериофагов как высоко специфического диагностического средства, позволяющего надёжно дифференцировать возбудителей бактериальных видов, а порой проводить более детальную дифференциацию отдельных типов и вариантов внутри данного вида. Возможность фагоиндикации вытекает из специфичности действия фагов, которая может быть настолько выражена, что позволяет дифференцировать не только отдельные виды, но и серологически неотличимые штаммы в пределах одного вида. Известно, что ведущее место в динамике заболеваемости животных и человека принадлежит ранней и точной диагностике болезни, основным звеном которого является индикация и идентификация возбудителя. Поэтому всё большее число исследователей предпочитают обращаться к фаго-диагностике, как единственно специфичному и доступному способу, способному дифференциации близкородственных штаммов. Фагодиагностика, фагоин-дикация основана на специфической способности фагов взаимодействовать с определёнными видами (идентификация) или типами (фаготипирование) бактерий, в результате чего происходит их лизис. Феномен лизиса является основой для использования фага в целях индикации и диагностики. Метод фагодиагно-стики широко используется в лабораторной практике для индикации и идентификации различных видов микроорганизмов. Одним из первых в ветеринарной практике фагоидиагностика была предложена К.И.Цветковым (1941) при паратифозном аборте у кобыл. П.В. Лихачев в 1948 году провёл испытание фага при диагностике паратифа свиней. Дальнейшие работы в этой области исследований подтвердили значимость выбранного направления. Н.И. Николаенко, И.К. Тутов (1970) отмечают перспективность использования бактериофага, лизи-рующего Salmonella abortus ovis и позволяющего сократить сроки диагностики до 4-6 часов. В широкой практике ветеринарных лабораторий для целей диагностики рекомендуются сибиреязвенные бактериофаги К - ВИЭВ и g — MBA для идентификации сибиреязвенных бактерий (Павлова, 1971).
Впервые фаготипирование с помощью так называемых Vi- фагов предложили в 1938 году J. Craigie, С. Yan для культур возбудителя брюшного тифа. В 1947 г. J. Craigie, A. Felix была отработана методика типирования брюшнотифозных бактерий, с помощью которой можно было определять 53 типа брюшнотифозных культур. Фаготипирование, как метод идентификации, разработан в отношении широкого спектра возбудителей: брюшнотифозных и паратифозных А и Б бактерий, палочек Бреслау (Craigie, Yen, 1938; Гордина, 1954; Гуто-рова, 1958). Разработаны схемы типирования дизентерийных бактерий Зонне (III), известны попытки типирования плазмокоагулирующего стафилококка, энтерококка, дифтерийных бактерий. Ряд диагностических фагов: типовые паратифозные А и В, Vi-брюшнотифозные, типовые дизентерийные фаги к Sh.Sonne, колифаги, стафилококковые и другие, применяются для внутривидовой дифференциации бактерий (Кац-Чернохвостова, 1947; Крылова, 1961, 1963; Наурызгалиев, 1978). Оригинальную схему для фаготапирования S.thyphimurium разработали Л.Г.Чиракадзе, Т.Г.Чинашвили (1974). Литическую реакцию изучали у 2708 штаммов S.thyphimurium как эталонных и музейных, так и выделенных из разных источников при помощи 16 типовых фагов.
М.Д.Крыловой (1963, 1970, 1974) одной из первых удалось с помощью прямого метода подразделить культуры Е.сой серотипа 0111 за 4 фаготи па. Изучая лизогению 104 штаммов дифтерийных бактерий, она установила наличие лизогенного состояния у 103. В 1974 году ею разработаны рекомендации к построению схем фаготипирования, в основу которых положен принцип, обозначать фаготипы не цифрами, а заглавными буквами латинского алфавита: А, В, С, D и т.д. Это даёт возможность регистрировать в названии фаготипа слабые и сильные реакции: фаги, обусловливающие сильные реакции, указываются в виде заглавных букв; фаги, дающие слабые реакции - в виде строчных букв. Например, штамм, лизирующийся фагом А, В, С и D - сливным лизисом, а фагами F и G - в виде единичных бляшек, получает название фаготип ABCDfg. Ценность метода фаготипирования состоит в том, что бактерия и фаг - являются узкоспецифичными маркерами, и определение фаготипа маркирует штамм сразу по нескольким меткам в строго определённом сочетании.
В ветеринарной практике одними из первых применили фаготипирование Т.А.Давиденко, А.М.Зарицкий (1972), Н.М.Никитюк (1970), И.И.Архангельский, Б.А.Степанов (1966), А.И.Ивашура (1967), Б.А.Байрак (1970), Л.И.Петрушина (1967). В своих исследованиях они указывают на эффективность фаготипирования сальмонелл, которые выделяются от различных видов животных, из мяса и других субстратов; фаготипирования стафилококков, выделяемых из молока при маститах у коров, для выяснения связей между этими заболеваниями и пищевыми токсикоинфекциями у людей. И.П. Ревенко (1970) установил, что метод фаготипирования позволяет отличать культуры эризипелотриксов, выделяемых из различных источников и может быть использован в эпизоотологической практике для выяснения связей между отдельными случаями заболевания рожей различных животных и человека. Об успешном применении дизентерийного бактериофага при массовых исследованиях сообщила В.Н. Кузнецова (1956), которая идентифицировала 576 культур из 630. Для ускоренной диагностики брюшного тифа З.С. Островская, Б.Н. Папкова (1951) предложили VI-бактериофаг, с помощью которого в течение 48 часов можно идентифицировать брюшнотифозные гемокультуры. В.В.Аврех (1954) предлагал использовать фаги специфические по отношению к различных видам сальмонелл, считая данный метод более надёжным, чем реакция с монорецеп-торными сыворотками. Для быстрой диагностики В.А. Килессо (1960) применяла сальмонеллёзный О-фаг с широким спектром действия, лизирующий 40 различных серотипов сальмонелл, а также некоторые штаммы шигелл. Л. И. Адельсоном, Л.Д.Гуторовой, Г.Г.Клочкаревой (1957) были получены фаги, активные по отношению к энтеропатогенным кишечным палочкам серотипов 026:
Анализ эпизоотологических показателей листериозной инфекции по Ульяновской области
На интенсивно осваиваемых территориях их количество резко сократилось. Теперь в таких местах преобладаю антропоургические очаги, образовавшиеся в результате хозяйственной деятельности людей. В этих очагах в природную цепь циркуляции возбудителя включились домашние животные. Выделяют и диффузные природные очаги. В этих случаях возбудители циркулируют среди животных многих видов, на значительной территории характерным примером в данном случае служит листериоз.
Наконец, установлено, что природные очаги могут перемещаться при миграциях животных, которые являются основными распространителями и резервуарами возбудителя соответствующей болезни. Перемещения очагов листериоза имеют сезонный характер. В холодное время года дикие грызуны-листерионосители мигрируют из природных станций к животноводческим объектам, к кормохранилищам. Именно в этот период в природную цепь циркуляции возбудителя чаще включаются домашние животные, в первую очередь мелкий рогатый скот.
Из 35 населённых пунктов Ульяновской области, входящих в ареал нахождения листерий, в одном населённом пункте (Моисеевка) листериоз на протяжении изучаемых 18 лет встречается 6 раз, в другом (Слобода Выходцева) - 4 раза. В двух пунктах (Мордово Озеро и Новая Малыкла) - по 3 раза. В семи - (Старое Погорелово, Ховрино, Русские Горенки, Филиповка, Аллагулово, Степная Васильевка, Александровка) - по 2 раза. В остальных 24 пунктах за 18 лет листериоз регистрировался по одному разу. Однако в некоторых из этих хозяйств, например в хозяйстве «Теленское», за год было зарегистрировано 2 случая листериоза крупного рогатого скота. И таких очагов, где в течение года регистрация листериоза прошла неоднократно насчитывается до 9 населенных пунктов.
Все эти показатели подтверждают вывод о том, что на территории Ульяновской области листериоз не случайная инфекция, а закономерная, имеющая природно-очаговый характер.
Анализ распространения листерий по Ульяновской области показывает, что в основном листериоз распространён в двух степных районах левобережья — Мелекесском и Новомалыклинском, а также в центральной части правобережья - Карсунском, Вешкаймском, Ульяновском, Сенгилеевском, Майнском административных районах, которые непосредственно граничат друг с другом. Территории этих двух зон (районов) можно оценивать как территории эпизоотически неблагополучные по листериозу. Как следствие этих данных, на указанных зонах необходимо проводить профилактические мероприятия по предупреждению распространения листериоза.
Весьма важен и такой показатель как сезонность листериоза. Болезнь чаще всего регистрируют с января по май, что также связывают с активизацией механизма передачи. В это время происходит миграция грызунов-листерионосителей к хранилищам кормов.
Чтобы определить сезонность той или иной инфекционной болезни, ориентируются не только на число заболевших животных, но и на количество выявленных эпизоотических очагов (неблагополучных пунктов). Анализируя эти данные по месяцам, можно установить период максимального распространения болезни, проследить динамику подъема и спада заболеваемости.
По нашим данным (рис.4), наибольшее количество случаев листериоза в Ульяновской области приходится на период марта-апреля. Из 63 случаев листериоза показатели сезонности по месяцам распределяются следующим образом: январь-7, февраль-6, март-15, апрель-8, май-7, июнь-2, июль-3, август-2, сентябрь - ни одного случая листериоза, октябрь-3, ноябрь-6, декабрь-4. Данная закономерность практически соответствует общепринятой тенденции сезонности листериоза. Однако она связана скорее не с миграцией грызунов, как отмечал И.А. Бакулов, а с типом кормления животных и биологическими особенностями листерий. Данный микроорганизм может размножаться и накапливаться при низких температурах и в среде с низким показателем рН. Поэтому, те корма, которые хранятся на холоду или по мере хранения внутри них понижается кислотность (оба этих фактора препятствуют размножению большинства патогенной микрофлоры) являются прекрасным объектом и местом для размножения и накапливания большого количества листерий. Максимум скармливания этих кормов приходится на конец зимы начало весны. Когда в данных кормах происходит максимум накопления листерий. Летне-осенний отрицательный сезон по количеству случаев листериоза объясняется не отсутствием грызунов, а отсутствием зимнего корма и смены рациона кормления. С начала понижения температуры и создания благоприятных условий для размножения листерий, при отсутствии конкурирующей микрофлоры начинаются появляться случаи листериоза. Достаточно традиционно выглядит видовой состав сельскохозяйственных животных, поражённый листериозом на территории Ульяновской области (рис.5). В первую очередь, это мелкий рогатый скот 39 случаев из 63, что составляет 62% от всего поражённого поголовья, КРС соответственно 16 случаев это 25% и свиньи 8 случаев -13%. Данные цифры подтверждают общую тенденцию для указанной инфекции — в первую очередь поражается мелкий рогатый скот потом уже крупный рогатый скот, свиньи, если это не особый случай, наименее чувствительные к листериозу из сельскохозяйственные животные. Выше приведенный анализ по распространению листериоза на территории Ульяновской области позволяет сделать заключение, что данная инфекция, являющаяся природно-очаговой инфекцией в обозримом будущем не исчезнет с указанного региона. Всё это обосновывает необходимость налаживания и разрабатывания методов индикации и мониторинга появления листерий в той или иной местности, слежения за указанной инфекцией, предотвращения её распространения и угрозы заболевания людей и животных.
Результаты ПЦР - анализа в населенных пунктах Ульяновской области
Многие из этих сред содержали другие ингибиторы, включая различные неорганические соли, например, хлористый литий, ацетат галлия и трехокись хрома и бихромат калия. Для снижения роста S.faecalis M.Despirres (1971) предложил селективный бульон, содержащий Змкг/мл полимиксина В и 0,02 мкг/мл метиленового голубого кроме 40 мкг/мл налидиксиновой кислоты. Эта среда была эффективной для выделения L.monocytogenes из фекальных проб, взятых от матерей заражённых плодов или заражённых детей. Акридин или акрифлавин и другие краски (включая индиго-кармин, метиленовый голубой, пиронин, тионин) часто вводились в селективные среды для L.monocytogenes. После обогащения высоко контаминированных проб в бульоне, содержащем 3 токсические металлические соли, тионин, налидиксиновую кислоту и амфотерицин. B.Mavrothalassitis (1977) предложил перенос культуры дифференцирующий агар, содержащий пиронин и дополнительно краску феназин, галлоцианин.
Как упоминал Н. Welshimer (1981) имеют место существенные вариации в чистоте красящих соединений, используемых в сравнительных исследованиях. В каждом случае следует титровать отдельные партии реагентов, чтобы определить эффективные селективные концентрации, не задерживающие рост L.monocytogenes. Другие неоднородные ингибиторные соединения включают тиогликолат (Kampelmacher, 1969) и тиоцианат (Bockemuhl, 1971). Тиогликолат также был введён в "обогатительно-транспортную" среду (Bockemuhl et al, 1974). Одним из самых замечательных инградиентов, предложенных для селективной питательной среды был прополис, материал, используемый пчёлами для выстилания стенок сот (Cronstol,1977). Эта питательная среда содержала также налидиксиновую кислоту, полимиксин В, этакридин и индигокармин и обладала повышенной селективностью для L.monocytogenes в смешанных культурах по сравнению со средами без прополиса. Более поздние составы сред представляли комбинации антибиотиков (налидиксиновая кислота, полимиксин В) и акрифлавин в качестве ингибиторных агентов. После наблюдения Larson и сотр.(1985), касающихся резистентности штаммов L. monocytogenes к моксалоктаму in vitro, W.Lee.et.al. вводили этот антибиотик широкого спектра (20 мкг/мл) в модифицированный агар Мак Брайда-Жирарда. Они специализировались на выделении [..monocytogenes из проб говядины и др. видов мяса, в которых большую проблему представляет обильный рост как грамотрицательных, так и грамположительных бактерий. Они обнаружили, что увеличение в 10 раз концентрации хлористого лития по сравнению с оригинальными формулами (т.е. до 5 мг/л) и замена глицинангидрида (10мг/мл) на глицин проводила к меньшей ингибиции штаммов L.monocytogenes. Интересно, что о значении глицинангидрида впервые упомянули R. Beams ещё 1959г. до публикации своего сообщения в следующем году. R.Bearns et.al. рекомендовали фенилэтаноловую агаровую основу содержащую 10 мг/мл глицинангидрида, 0,5 мг/мл LiCl, а для контаминированных материалов (фекалии, посва, материалы вскрытия и т.п.) 200 мкг/мл циклогсимида («Актидион»). Jay (1987) сообщил о новой питательной среде, названной CPN агаром, обладающей ещё большей селективной способностью. Питательная среда содержит налидиксиновую кислоту, фенилэтанол и І циклогнксанидин в качестве ингибиторов и TR1S для получения конечного рН 8,2. Колонии L.monocytogenes в чистых или смешанных культурах были крупнее (2мм вместо 1мм) на CPN, чем на агарах Мак и Брайда . J.Lovett (1987) тоже обнаружил отличную селективность, используя модифицированную среду Мак Брайда и Жирарда, содержащую цилогексимит, глицинангидрид, 0,5 мг LiCl /мл (первая концентрация), но без крови.
В наших исследованиях мы, опираясь на опыт вышеуказанных авторов, использовали доступные, дешёвые компоненты для среды накопления и элективной среды. Полученные нами результаты с использованием специальных, сред, куда был включены полимиксин, хлористый литий и глицин, позволили нам в экспериментальных исследованиях получить от 68 до 92% положительных результатов. Введение в указанные среды хлористого лития и глицина ингибировало рост энтеробактерий и бактерий семейства Pseudomones, полимиксин подавлял рост энтерококков. К сожалению, в следующей серии опытов по выделению листерий из пищевых продуктов этот показатель не превышал 60%.
Разработано множество схем, увеличивающих степень выделения листерий и ускоряющих этот процесс. Большинство исследователей соглашается, что самым чувствительным методом выделения L. monocytogenes из проб, сильно контаминированных конкурентными микроорганизмами, остается некоторая вариация метода холодного обогащения, первоначально предложенного M.Gray и сотр. (1948). Он основан на том, что L.monocytogenes, не только выживают, но и растут при 4С. Рекомендовано периодическое субкультивирование полуселективных и селективных культур в обогащенном бульоне при 4С до нескольких месяцев. Считалось, что это единственный культуральный метод успешного получения изолята в случаях, когда микроорганизмы вначале были обнаружены под микроскопом. Следует напомнить, что действительные механизмы эффективности холодного обогащения остаются гипотетическими. Вероятно, они включают комбинацию роста клеток L. monocytogenes, гибель конкурентов и пониженное или понижающее влияние неизвестных «ингибиторов», присутствующих в сложных пробах, таких как зараженная ткань, фекалии или пробы из окружающей среды. Несмотря на свою чувствительность очевидно, что холодное обогащение в общем непрактично для всех исследований, кроме исследований продолжительного характера. M.P.Doyle, J.L.Schoeni (1986, 1987) сравнили холодное обогащение, метод Ловетта (1987) и свой собственный укороченный селективный метод обогащения для увеличения эффективности выделения L. monocytogenes из феций и тканей экспериментально зараженных животных и из сыров. Их селективный метод обогащения включает 24-часовой период роста в триптозном бульоне, содержащем овечью кровь, полимиксин В, акрифлавин и налидиксиновую кислоту. Важно, что образцы выращивали в атмосфере с пониженным содержанием кислорода. Оба исследования показали недостаточную эффективность современных культуральных методов. При исследовании мягкого сыра [..monocytogenes выделились не с первого раза примерно у 21% проб.
