Введение к работе
Актуальность проблемы:
До середины 1950-х гг. практически единственным широко применяемым методом очистки белков оставалось дробное осаждение сульфатом аммония. Однако к концу 1950-х гг. количество исследований, посвященных разработке новых методов очистки протеинов, значительно возросло. Были опубликованы данные по очистке белков на целлюлозных ионо-обменниках - КМ- и ДЭАЭ-целлюлозах, введены новые носители - сефадексы и сефарозы. К началу 1990-х годов был разработан целый ряд тонких методов очистки белков (аффинная хроматография, гидрофобная хроматография, металлохелатная и хроматография на триази-новых красителях, гель-фильтрация и др.). Эти методы очистки были основаны на различиях белковых характеристик: разности молекулярных масс, растворимости, температурной и рН-устойчивости, зарядов при различных значениях рН, адсорбции на гидроксилапатите, сродству к субстратам, ингибиторам, триазиновым красителям и др. Однако существенным ограничением многих из этих методов является невозможность их использования в условиях большого количества балластных примесей - клеток продуцента, их фрагментов, протеаз, содержащихся в культуральной жидкости. Это приводит к необходимости введения дополнительных этапов очистки. Еще одним ограничением для широкого применения ряда хрома-тографических методов является их высокая специфичность. В частности, использование аффинной хроматографии обеспечивает высокую чистоту фермента, ингибитор которого иммобилизован на носителе. Но, с другой стороны, поскольку химическое строение ингибиторов различно, то для отдельно взятого фермента нужно разрабатывать свою отдельную методику иммобилизации ингибиторов.
Универсальным принципом связывания белка является его адсорбция на сорбенте, основанная на силах Ван-дер-Ваальса. Однако, среди сил слабого взаимодействия, действующих в водном растворе, адсорбция является наиболее слабой. Поэтому разработать сорбент, использующий данный принцип, весьма сложно, и к моменту начала работы был разработан только один метод, использующий адсорбционное связывание - хроматография на гидроксилапатите. Однако применение гидроксилапатита ограничено тем, что этот сорбент требует сложного процесса подготовки и не подлежит регенерации. Кроме того, его использование возможно только на последней стадии очистки после удаления большинства балластных соединений.
Поэтому целью нашего исследования была разработка метода очистки белков, лишенного перечисленных выше ограничений, в достаточной степени универсального, масштаби-
руемого и позволяющего получить белки высокой степени чистоты уже на первых стадиях применения.
Основной задачей нашего исследования была иллюстрация работоспособности и универсальности метода на модельных белках, имеющих важное промышленное значение, но в настоящее время получаемых трудоемкими способами. В качестве одного их таких ферментов была выбрана пероксидаза хрена. Этот белок широко используется в биохимических и иммунологических исследованиях и представляет интерес как препарат для лечения лепры и карциномы. Однако выход его ограничивается 0,5-1 г из 100 кг корневищ хрена, и цена достигает нескольких тысяч долларов за 1 г.
Другим модельным ферментом был выбран лизостафин. Определяющим критерием выбора стала его способность к лизису клеточной стенки стафилококков. Он был выделен из культуральной жидкости Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus (Schindler, Schuchardt, 1964) и, как было показано, лизировал клетки стафилококковых штаммов, в том числе анти-биотикорезистентных. Лизис бактериальной клетки обусловлен тем, что лизостафин является глициназой и гидролизует пентаглициновые мостики, которые входят в состав клеточной стенки любого (в том числе - резистентного к антибиотикам) стафилококка. На этом основании данный фермент был отнесен к факторам межмикробного антагонизма, обеспечивающим подавление роста других видов стафилококков.
В настоящее время борьба с инфекциями, вызываемыми штаммами антибиотикорези-стентных бактерий является актуальной проблемой медицины. Бактерии рода Staphylococcus занимают в этом ряду одно из главных мест. Так, в США ежегодно фиксируется ~500 000 случаев заболеваний, вызываемых стафилококками, из которых около 100 000 случаев были вызваны антибиотикорезистентными штаммами. Таким образом, на сегодняшний день представляется важной задача поиска новых лекарственных средств, альтернативных антибиотикам, а также необходимость разработки новых эффективных подходов к лечению стафилококковых инфекций. В этом свете возможность применения лизостафина в клинической и ветеринарной практике выглядит перспективной, тем более что показания для лечения некоторых инфекций, вызываемых стафилококками, уже встречались в литературе. (Bramley, Foster, 1990).
Описанные методы выделения лизостафина не пригодны для наработки препаративных и промышленных количеств препарата, поскольку существующие методы включают, как правило, очистку в три-четыре этапа; выращивание штамма-продуцента осуществляется на дорогих или малодоступных питательных средах (Iversen, Grov, 1973); в целом процесс оказывается экономически высокозатратным.
Таким образом, в настоящее время не существует промышленного производства препаратов, содержащих фермент лизостафин, и работа в данном направлении является актуальной и перспективной для медицины, ветеринарии и биотехнологии. Поэтому заключительным этапом нашей работы явилось изучение очищенного с помощью разработанного нами метода лизостафина, позволяющее получить важную информацию о его физико-химических и биологических свойствах.
Цель исследования - Разработать адсорбционные хроматографические методы очистки белков на ионообменниках, использовать их для препаративной очистки лизостафина и пероксидазы хрена, изучить некоторые физико-химические и биологические свойства очищенного лизостафина.
Задачи исследования:
Разработать методы препаративной адсорбционной хроматографии белков на целлюлозных (КМ-ДЭАЭ-целлюлозах) и кремниевых (силохром С-80) ионообменниках.
Использовать эти методы для получения препаративных количеств лизостафина и пероксидазы хрена.
Подобрать оптимальные условия культивирования штамма S. simulans biovar staphylolyticus - продуцента лизостафина.
Разработать кинетико-термодинамический метод определения ионогенных групп, входящих в каталитический центр макромолекулы лизостафина.
Показать возможность использования полученного препарата лизостафина для лечения стафилококковых инфекций у домашних и сельскохозяйственных животных.
Научная новизна:
Впервые разработан метод адсорбционной хроматографии белков на ионообменниках, применение которого позволяет существенно сократить количество этапов очистки.
Впервые предложен кинетико-термодинамический метод для определения ионоген-ных групп активного центра ферментов, катализирующих гидролиз поверхностных структур клеточной стенки бактерий (лизостафин, лизоцим).
Практическая значимость и внедрение результатов:
Разработан новый способ получения лизостафина на основе адсорбционного метода очистки, защищенный патентом на изобретение РФ: №2342431.
Предложенный метод адсорбционной хроматографии на ионообменниках может использоваться для очистки препаративных количеств других белков.
Предложены эффективные схемы применения лизостафина для лечения стафилококковых инфекций домашних животных.
Положения, выносимые на защиту:
Метод адсорбционной хроматографии на ионообменниках позволяет получать препаративные количества высокоочищенных препаратов лизостафина и пероксидазы хрена.
Разработка условий культивирования штамма-продуцента лизостафина S. simulans позволяет обеспечить высокий выход целевого продукта.
Метод кинетико-термодинамического анализа позволяет определять ио но генные группы активного центра ферментов без использования рентгеноструктурного анализа.
Препарат лизостафина, полученный из культуральной жидкости S. simulans методом адсорбционной хроматографии на силохроме, эффективен против стафилококковых инфекций у животных.
Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных препаратов отдела молекулярной микробиологии ФБУН ГНЦ ПМБ.
Апробация работы. Результаты работы доложены на двух научно-практических школах-конференциях молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Оболенск, 2009 г. и 2010 г.
Публикации. Основное содержание работы отражено в 6 научных публикациях, включая 3 статьи в реферируемых научных журналах и 1 патент.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 30 работ отечественных и 95 работ зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 6 таблицами.
