Содержание к диссертации
Введение
Глава I Антигенная структура штаммов сшегнойной палочки 6
1.1. Антигены клетки синегнойной палочки 7
1.2, Внеклеточные продукты синегнойной палочки, обладающие антигенными свойствами 14
1.2.1. Экзотоксин А , , 14
1.2.2, Внеклеточная слизь 18
Глава 2 . Гуморальный иммунный ответ, формирующийся при синегнойной инфекции 27
Глава 3. Иммуноферментный анализ и его использование в диагностике инфекционных заболеваний 34
Глава 4. Материалы и методы 44
4.1. Тест-штаммы синегнойной палочки 44
4.2. Серотипирование клинических штаммов синегнойной палочки 44
4.3. Объемная реакция бактериальной агглютинации 44
4.4. Бактериологическая диагностика острых и хронических нагноительных заболеваний легких
4.5. Питательная среда и метод культивирования штаммов синегнойной палочки 47
4.6. Получение частично очищенных препаратов слизи синепюйной палочки 48
4.7. Выделение очищенных антигенных компонентов слизи 49
4.8. Получение иммунных кроличьих сывороток к частично очищенным препаратам слизи сине-гнойной палочки 49
4.9. Адсорбция антислизевой сыворотки группо-специфическим антигеном 50
4.10. Адсорбция кроличьих антислизевых сывороток бактериальными клетками синегнойной палочки 51
4.11. Постановка реакции преципитации и проведение иммуно электрофореза 52
4.12. Исследуемые сыворотки людей 52
4.13. Приготовление конъюгатов пероксидазы с антителами против иммуноглобулинов кролика и человека 53
4.13.1. Очистка пероксидазы хрена 53
4.13.2. Получение чистых антител к igG (н + L) кролика 55
4.13.3. Связывание антител с ферментом 56
4.14. Методика выполнения иммуноферментного анализа 57
4.15. Методы химического анализа 59
4.16. Статистическая обработка полученных результатов 6
Глава 5 . Серологическое изучение антигенных комонентов слизи синегнойной палочки 62
5.1. Агглютинация штаммов синегнойной палочки антислизевыми сыворотками 62
5.2. Использование ишунодиффуз ионных методов для изучения антигенных компонентов слизи синегнойной палочки ?8
Глава 6 . Выбор оптимальных параметров для выполнения имшоферментного метода на основе компонентов слизи с целы) оірвделения антител к си негнойной палшки 103
6.1. Выбор оптимальной концентрации препарата слизи и условий его сорбции на твердофазном носителе -105
6.2. Подбор времени инкубации антисыворотки, полученной к антигену слизи, с гомологичным антигеном и антислизевой сыворотки с конъ-югатом анти-igG кролика -^0
6.3. Подбор оптимального разведения конъюгата анти-igG кролика меченого пероксидазой
хрена
Глава 7. Определение антител к p.aeruginosa в сыворотках животных с синегнойной инфекцией 117
- Антигены клетки синегнойной палочки
- Тест-штаммы синегнойной палочки
- Агглютинация штаммов синегнойной палочки антислизевыми сыворотками
- Выбор оптимальной концентрации препарата слизи и условий его сорбции на твердофазном носителе
Введение к работе
В последнее десятилетие возросла роль синегноинои палочки в инфекционной патологии человека (И.И.Колкер с соавтор., 1976; М.И.Кузин с соавтор., 1982). В ряде случаев этот микроорганизм является не только главным этиологическим фактором инфекционного процесса, но нередко осложняет также и заболевания стафилококковой этиологии (О.И.Котова с соавтор., 1983).
Эффективность лечения больных с гнойно-септическими заболеваниями обусловленными синегноинои палочкой, во многом зависит от своевременной диагностики возбудителя инфекционного процесса. До сих пор бактериологический метод выделения возбудителя является овновой лабораторной диагностики инфекционных заболеваний, вызываемых синегноинои палочкой. Бактериологическая диагностика синегноинои инфекции связана с определенными трудностями, поскольку выделение чистых культур синегноинои палочки и их последующая идентификация осуществляются в несколько этапов и, как правило, синегнойная палочка выделяется в ассоциации с другими микроорганизмами (стафилококк, протей, стрептококк, клебсиелла и т.д.), что безусловно затрудняет установление этиологического фактора. Использование селективной среды для выделения синегноинои палочки возможно только при условии достаточно большого количества бактериальных клеток. Установлено, что при длительной антибиотикотера-пии наблюдается возникновение Л-форм этого микроорганизма с последующей реверсией их в атипичные (беспигментные) формы, в связи с чем бактериологическая диагностика синегноинои инфекции может быть затруднена (З.Н.Кочемасова, 1976; White et al. 1978). Кроме того, утрата пигмента у штаммов синегноинои па-
- 2 ~
лочки может наблюдаться при ее росте в некоторых ассоциациях, особенно в ассоциации с протеем, что нередко является причиной диагностических ошибок (А.А.Арутчева, 1983).
Бее изложенное выше свидетельствует о необходимости использования помимо традиционных бактериологических способов выделения возбудителя и других методов его специфической диагностики. Применение точных и чувствительных серологических методов может способствовать не только уточнению роли данного микроорганизма в инфекционном процессе, но и установлению этиологии инфекционного осложнения в случаях, когда возбудитель не удается выделить.
Появление и развитие высокочувствительных методов серологической диагностики (радиоиммунологический метод, иммунофер-ментный метод) значительно расширило возможности исследователей в плане диагностики инфекционных заболеваний. Однако возможность применения любого из методов серодиагностики во многом определяется серологическими свойствами используемого антигена, что зависит от степени изученности антигенной структуры возбудителя. Синегнойная палочка, как известно, характеризуется сложным антигенным строением. Слизь синегнойной палочки (капсулоподобное вещество) является одним из наиболее характерных признаков этого вида микроорганизмов ( Наупее, 1951; К.И.Савицкая, 1979). В препаратах слизи содержится несколько антигенных компонентов (Н.А.Палкина, с соавтор., 1978; Pier et ai. , 1978). Остается, тем не менее неизвестным, в какой мере различия в антигенном составе компонентов слизи коррелируют с отличиями штаммов синегнойной палочки по их О-антигенам. Мы встретили в литературе лишь несколько сообщений о наличии как групповых, так и штаммоспецифических анти-
- з ~
генов слизи p.aeruginosa , серологическая специфичность которых не совпадает с серологической специфичностью 0-анти-гена С Nadaud et al. , 1977; Maresz-Babczyzyn,
Sokalska . 1977; И.Г.Зайднер с соавтор., 1981). До настоящего времени не описано ни одной схемы серологического группирования штаммов синегноинои палочки по антигенам слизи и поэтому не представляется возможным оценить насколько приемлемы компоненты слизи этого микроорганизма при использовании их в серологических реакциях, предназначенных для диагностики синегноинои инфекции.
В связи с этим целью представленной работы являлась разработка иммуноферментного метода на основе антигенных компонентов слизи синегноинои палочки в диагностике инфекций, обусловленных P.aeruginosa.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
I). Провести сравнительное изучение состава антигенных компонентов слизи из штаммов синегноинои палочки разных 0-се-рогрупп с целью поиска как общих, так и групповых антигенов.
2). Выявить наличие возможных серологических перекрестов между препаратами слизи синегноинои палочки и антигенами гете-рологичных микроорганизмов.
3). Осуществить выбор оптимальных параметров для выполнения непрямого варианта иммуноферментного метода на основе антигенных компонентов слизи, предназначенного для выявления антител с синегноинои палочке.
4). Апробировать разработанный метод серодиагностики сине-гнойной инфекции на сыворотках больных с заболеваниями, обусловленными синегноинои палочкой и другими микроорганизмами.
В результате проведенных исследований установлено, что препараты слизи штаммов синегнойной палочки содержат до четырех антигенных коглпонентов, один из которых является серологически общим антигеном слизи для штаммов P.aeruginosa разных О-серогрупп. Установленный факт позволяет рассматривать препараты слизи синегнойной палочки в качестве возможного антигена для использования их при диагностике синегнойной инфекции без учета 0-серотипов P.aeruginosa , число которых в настоящее время насчитывается около двадцати. Кроме того, для штаммов синегнойной палочки выявлены группоспецифические антигенные компоненты слизи, серологическая специфичность которых не коррелировала с принадлежностью штаммов к 0-серогруп-пам. С помощью ряда последовательных этапов очистки (осаждением этиловым спиртом, фракционированием на колонке с анионо-обменником) получены очищенные препараты общего и группоспе-цифического антигенов слизи, предпринято изучение их серологических свойств и химической природы. Установлена довольно высокая серологическая видоспецифичность препарата слизи синегнойной палочки и на его основе впервые разработан иммуно-ферментный метод определения специфических антител к слизи p.aeruginosa . Разработка иммуноферментного метода на основе антигенных компонентов слизи включала получение высокоактивных и стабильных при хранении конъюгатов пероксидазы с антителами против иммуноглобулинов человека и кролика, а также выбор оптимальных условий постановки реакции (подбор соотношений компонентов, условий сорбции на твердой*фазе и т.д.). Разработанный метод серодиагностики позволил выявлять наличие синегнойной инфекции у больных с нагноительными заболеваниями легких даже при отсутствии данных бактериологического анализа
- 5 :r
и может быть рекомендован в практжу лабораторных исследований в клиническом стационаре.
Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Антигены клетки синегнойной палочки
0-антиген представляет собой сложный макромолекулярный комплекс липополисахарида с белками и липидами клеточной стенки ( Berry , 1977). Липополисахарид, таким образом, является структурным компонентом О-соматического антигена и обусловливает его О-групповую специфичность ( Adam et al. ,1971; Chester et al., 1973; Lanyi, Adam , 1973). Липополисахарид грамотрицательных бактерий обычно построен по схеме: липид А-базальная структура-О-специфические боковые цепи. Липополисахарид синегнойной палочки сходен по структуре и свойствам с липополисахаридами других грамотрицательных микроорганизмов, однако имеет ряд характерных особенностей. Известно, что в состав липида А синегнойной палочки входит додекановая, 2-гид-роксидекановая и 3-гидроксидекановая кислоты ( Wilkinson, Galbrath , 1975).
Базальная область липополисахарида, представляющая собой его полисахаридную часть, структурно подразделяется на внешнюю часть ядра и внутреннюю область. Б ядерной части полисаха-ридной области липополисахарида синегнойной палочки обнаружены 3-диокси-манно-октолузоновая кислота (прежнее название 2-кето-З-дезоксиоктоновая кислота или ВДО), глюкоза, рамноза, галактозамин, ортофосфаты, пирофосфат, этаноламин, а из геп-тоз - L-амино-Д-маннозогептоза. В препаратах липополисахарида найдены жирные кислоты: лауриновая, миристиновая, пальмити - 8 новая, стеариновая, линолевая ( Sensakovic , Bartell, 1974; Horton , Rodemeyer , 1976). Установлено, что в них не содержатся такие сахара как галактоза и манноза ( Michaels , Eagon , 1969; Sensakovic , Bartell 1974).
Химический состав липополисахарида синегнойной палочки изучен довольно полно, однако его структура до конца не установлена. Было проведено хемотипирование типовых штаммов сине-гнойной палочки, основанное на качественном различии в составе углеводов липополисахарида. К одному и тому же хемотипу были отнесены штаммы синегнойной палочки нескольких 0-сероти-пов. Так, например, штаммы серотипов Зав, Заa , 3ad с, 3af
Схемы Lanyi Принадлежат К хемОТИПу У ( Adam et al.,1971), а штаммы серотипов 07 и 08 схемы Habs относятся к хемотипу УШ ( Chester et al, 1973). По-видимому, 0-антигены разных серологических специфичноетей могут иметь идентичный химический состав и вследствие этого данные химического состава не могут быть положены в основу хемотипирования штаммов синегнойной палочки. Для этого необходимо иметь представление о структуре боковых цепей липополисахарида, обеспечивающих специфичность 0-антигена. В настоящее время структура О-специфических полисахаридных цепей липополисахарида находится в стадии интенсивного изучения (B.A.Dmitriev et alJ982; Knirel et al. , 1982).
Большинство схем серологического типирования штаммов си негнойной палочки основано на типировании их с помощью 0-термо стабильного антигена ( Habs , 1957; Verder,Evans , 1961; Wokatsch , 1964; Lanyi , 1966/1967; Homma, 1974. - 9 В 1976 г. подкомитет по Pseudomonaceae и родственным им организмам, существующий при Международном комитете по систематике бактерий и Международная ассоциация микробиологических обществ утвердили набор стандартных антигенных штаммов ( international Antigenic Typing Scheme ) , который включает 16 се-ротипов и в его основу положены 12 0-серотипов схемы Habs. Группирование штаммов синегнойной палочки по их антигенным свойствам в нашей стране впервые осуществил А.В.Черномор-дик (I960), изучивший 160 штаммов синегнойной палочки в реакции перекрестной агглютинации с соответствующими сыворотками. Им было выявлено 10 различных серологических типов и отмечена для значительная роль термолабильных факторов внутривидовой дифференциации штаммов синегнойной палочки. Н.С.Акатова и Н.Е.Смирнова (1976,1977) провели подробное серологическое изучение культур синегнойной палочки, приняв за основу серотипирования схему, предложенную Habs . Авторы использовали для этих целей набор из 20 агглютинирующих сывороток, приготовленных к штаммам Kohler (серотипы от 01 ДО Oil), Kleinmaier (тип 012) и. Wokatsch (типы 013, 014, 015, 016, 017, 023, 024II и 025). С помощью полученного набора сывороток или былопротипировано более 90$ культур синегнойной палочки. В настоящее время в нашей стране налажен промышленный выпуск агглютинирующих сывороток для типирования культур синегнойной палочки. (В.Я.Чаплинский с соавтор.,1982). Lanyi et al. (1972.1973) исследовали антигенные взаимосвязи между штаммами, P.aeruginosa и другими видами семейства Enterobacteriaceae и выявили значительные перекрестные серологические реакции с бактриями родов сальмонелла, цитробак-тера, эшерихия, шигелла, протея. Ранее widermann, Fiamm - 10 (1961) наблюдали агглютинацию колоний синегнойной палочки под действием сыворотки к штамму кишечной палочки серотипа 026: КБО : Бб . Очищенные препараты липополисахарида, в частности, полученные из различных видов бактерий рода Pseudomonas » об ладают высокой серологической специфичностью и не обнаруживают наличия каких-либо общих компонентов (Э.А.Коваленко с соавтор., 1979). Как установлено Sasaku et al. (1975); Abe et al. (1975); Homma et al. (1976) липополисахарид является составным КОМПОНеНТОМ белКОВОГО ЭНДОТОКСИНа ( original endotoxin protein - ОЕр ), выделенного из фильтрата автолизирован-ной культуры синегнойной палочки. Липополисахарид, выделенный из ОЕР и липополисахарид, полученный из интактныхк клеток, идентичны по химическому составу и биологическим свойствам ( Homma et al. , 1976). Эти данные служат прямым доказательством того, что эндотоксин представляет собой комплекс белка и липополисахарида.
Тест-штаммы синегнойной палочки
Для серотипирования культур синегнойной палочки использовали метод агглютинации на стекле с применением для этих целей типовых 0-сывороток, разведенных 1:20. После 1-2 минутного контакта сывороток с живой тест-культурой P.aeruginosa отмечали результат реакции. В качестве положительной реакции учитывали агглютинацию на +++ или ++++. Объемная реакция бактериальной агглютинации
Объемную реакцию бактериальной агглютинации ставили в аг 45 глютинационных пробирках. Для этого готовили последовательные разведения кроличьих сывороток, полученных к антигенам слизи P.aeruginosa (начиная с разведения 1:10 до 1:10 240 в 0,15 М фосфатном буферном растворе (ФБР) рН 7,2). В пробирки каждого ряда разливали по 0,5 мл сыворотки в соответствующем разведении. Культуры синегнойной палочки предварительно выращивали в течение 18-24 часов на скошенном в пробирках триптическом соевом агаре ("Difco" , США), после чего готовили 2 млрд.взвесь микробных клеток по оптическому стандарту мутности в 0,15 М ФБР с добавлением одной капли формалина. Через 30 минут в пробирки каждого ряда вносили по 1-2 капли микробной суспензии. Контролем служили пробирки с буфером и внесенной в них суспензией бактериальных клеток, а также пробирки с сывороткой и буфером. Все пробирки тщательно встряхивали и оставляли при комнатной температуре до следующего дня. Учет результатов проводили визуально с помощью вогнутого зеркала. За титр сыворотки принимали наивысшее разведение, обеспечивающее четкую положительную реакцию (+++) при отрицательной реакции в контрольных пробирках.
Бактериологическая диагностика острых и хронических нагноительных заболеваний легких.Для бактериологических исследований у всех больных забирали мазки из зева и носа, содержимое плевральной полости (пункциональное или из дренажной трубки) и бронхиальный секрет, взятый при бронхоскопиях. Исследуемый материал засевали в пробирки с 1,5% мясо-пептонным бульоном (МШЗ) с целью обогащения.
Для определения видового состава микроорганизмов бульонную культуру или исследуемый материал высевали на плотные питательные среды: на желточно-солевой агар (ЖСА), среду Эндо, на селективный агар с амфоланом для избирательного выделения штаммов протея и провиденция, на среду, содержащую N -цетилпири-динийхлорид (ЦПХ) для селективного выделения штаммов синегной-ной палочки, на 1,5$ мясо-пептонный агар (МПА) и одновременно готовили мазки, окрашенные по Граму.
Бактерии, выросшие на КСА и образующие мутные бляшки вокруг колоний, свидетельствующие о лецитиназной активности, относили к стафилококкам. Для видовой идентификации стафилококка ( s.aureus и S.epidermidis ) использовали в первую очередь два теста: определение способности к плазмокоагуляции по методике Г .Б .Выгодчикова (1963) и ферментации їланнита в анаэробных условиях (Международный подкомитет по таксономии стафилококков и микрококков, 1965).
На селективной среде с амфоланом, как правило, вырастали бактерии родов протея и провиденции. К роду Proteus относили подвижные грамотрицательные палочки, продуцирующие сероводород, расщепляющие мочевину, не утилизирующие лактозу и маннит. Представителей рода Proteus (P.vulgaris , P.mirabilis) различали по ферментации мальтозы, продуцированию индола, росту на среде Симмонса, декарбоксилированию орнитина. Для их дифференциации от представителей рода Providencia использовали среду с мочевиной (представители рода Providencia фермента уреа-зы не образуют).
Кишечную палочку дифференцировали от других бактерий по характеру роста колоний на МПА и на среде Эндо с последующей микроскопией мазков, окрашенных по Граму. Штаммы кишечной па лочки не утилизируют цитрат, не образуют ацетилметилкарбинол (отрицательная реакция Фогэс-Проскауэра), не образуют ферментов уреазы и фенилаланиндезаминазы, не утилизируют малонат натрия, не образуют сероводород, ферментируют глюкозу с образованием газа, дают положительную реакцию с метиловым красным.
К нейссериям относили грамотрицательные полимерфные кокки , дающие положительный оксидазный тест. Культуры синегноинои палочки идентифицировали по следующим признакам: росту на селективной среде с ЦИХ, образованию сине-зеленого пигмента пиоцианина, росту при ч42С и отсутствию роста при +5С, положительному тесту на цитохромоксидазу, окраске по Граму, подвижности, характеру аэробного роста (способности образовывать при выращивании на бульоне гомогенную взвесь с сероватой пленкой на поверхности среды).
Данная часть работы была выполнена совместно с сотрудниками бактериологической лаборатории Московского областного клинического института им.М.Ф.Владимирского (с.н.с. К.И.Савицкая) и сотрудникшли лаборатории ожоговых инфекций научно-исследовательского института микробиологии и эпидемиологии им .Н.Ф.Гамалеи (с.н.с. Н.Г. Анциферова).
Питательная среда и метод культивирования штаммов синегноинои палочки Для выделения частично очищенных антигенов слизи бактериальные клетки синегноинои палочки выращивали в течение 18-24 часов на чашках Петри с плотной питательной средой, на поверхность которой помещали целлофановые диски. Питательная среда имела следующий состав: 20$ гидролизата бычьего сердца, 3% гли -48 церина, 1$ дрожжевого экстракта, 0,5$ хлористого натрия, 1,5$ агар-агара СА.Д.Александров с соавтор., 1981). Культивирование проводили при температуре +37С.
Для выделения и частичной очистки препаратов слизи был использован метод Alms, Bass (1967а) с некоторыми нашими модификациями. Выросшую на целлофановых дисках бактериальную массу смывали физиологическим раствором. Полученную суспензию перемешивали на мешалке в течение 2-3 минут со скоростью вращения ротора 2-3 тыс. об/мин. и центрифугировали при 6000g I час при +4С. Супернатант отделяли от осадка (бактериальные клетки) центрифугированием, который повторно суспензировали в стерильном физиологическом растворе и подвергали центрифугированию. Затем осадок отбрасывали, супернатанты объединяли, фильтровали через фильтр Miliipore (с диаметром пор 0,45 мкм) и подвергали ультрацентрифугированию при 105 000 & в течение 2 часов при +4С. Дальнейшие операции проводили на холоду. К полученному раствору слизи синегнойной палочки добавляли уксусной кислоты и уксусно-кислого натрия до конечной концентрации I и 10$ соответственно и по каплям при перемешивании приливали три объема охлажденного 96$ этанола. Образовавшийся осадок через 18-24 часа отделяли центрифугированием в течение 30 минут при 6 000g и растворяли в минимальном объеме дистиллированной воды с последующим диализом его в течение 2-3 суток против дистиллированной воды. После диализа препарат слизи лиофильно высушивали и хранили в герметично закрытой посуде при комнатной температуре
Агглютинация штаммов синегнойной палочки антислизевыми сыворотками
Известно, что синегнойная палочка обладает сложной антигенной структурой. Одним из таксономических признаков, характерных для вида P.aeruginosa, наряду со способностью к образованию сине-зеленого пигмента пиоцианина и утилизации ацета - 63 мида как единственного источника азота и углерода Haynes (1951) предложил использовать способность культур синегнойной палочки продуцировать внеклеточную слизь. Продукция экстрацел-люлярной слизи была выявлена у 92,8$ штаммов синегнойной палочки вне зависимости от вида клинического материала, из которого данные штаммы были выделены (К.И.Савицкая с соавтор., 1979). В слизи синегнойной палочки содержится несколько антигенных компонентов, спектр которых различен у разных штаммов синегнойной палочки ( Mates, Zand , 1974; И.И.Колкер с соавтор., 1976; Н.А.Палкина с соавтор., 1978; Pier et al. 1978).
Наше внимание было направлено на изучение серологических свойств внеклеточной слизи, образуемой этим микроорганизмом, с целью выявления возможности использования последней в качестве антигена для диагностики синегнойной инфекции.
При использовании тех или иных антигенных компонентов микробной клетки или ее внеклеточных продуктов в качестве антигенов с целью серодиагностики необходимо прежде всего учитывать их серологическую специфичность. В литературе тлеется лишь несколько сообщений об антигенной типо- и видоспецифичности слизи синегнойной палочки. Так, Nadaud et al. (1977) выделили 4 группы слизевых антигенов P.aeruginosa /которые по данным авторов не со ответствовали серологической специфичности О-антигенов. Marresz-Babczyszyn, Sokalska (1977), И.Г.Зайднер с соавтор. (1979), Pier et al. (1983) отмечали перекрестную серологическую активность между препаратами слизи, полученными от штаммов P.aeruginosa разных О-серогрупп, что свидетельствует о на-. личии в слизи общих антигенов или общих антигенных детерминант.
Приведенные выше немногочисленные данные литературы послужили предпосылкой для изучения типо- и видоспецифичности слизи синегнойной палочки с целью поиска как общих, так и групповых антигенных компонентов слизи для решения вопроса о возможности использования указанных компонентов в качестве антигена в серологических реакциях. В данном разделе экспериментальных исследований нами были использованы препараты слизи синегнойной палочки, полученные осаждением этиловым спиртом по методу Alms, Bass (1967а) в модификации А.Д.Александрова с соавтор. (1981).
Пре параты антигенов слизи получали из ряда клинических и типовых штаммов синегнойной палочки, относящихся к разным 0-серогруп пам по схеме НаЪв . Характеристика клинических штаммов по 0-серотипам (была использована международная схема Habs ) и данные химического состава выделенных из этих штаммов препаратов антигенов слизи представлены в табл.1.
Согласно результатам, приведенным в табл.1, препараты слизи синегнойной палочки гетерогенны по химическому составу. Содержание белка в препаратах слизи варьировало от 5,2 до 27,4$, нуклеиновых кислот -от 5,4 до 19,3$, общих углеводов - от 10,8 до 36,0$, 2-кето-3-дезоксиоктоновой кислоты (КДО) до 0,93$. Как следует из приведенных в табл.1 данных, содержание компонентов слизи по химическому составу варьирует довольно широко от штамма к штамму синегнойной палочки и не зависит от их серологической принадлежности.
Для изучения антигенного состава слизи синегнойной палочки были получены иммуные кроличьи антисыворотки к препаратам слизи из штаммов Ш 82, 85, 87, 93, 700, а позднее - к слизи из штаммов синегнойной палочки PA-ЮЗ и № 16. Титры иммуных кроличьих сывороток в реакции бактериальной агглютинации с гомологичными штаммами составляли 1:1280 - 1:5120, а в диффузионной преципитации с препаратами слизи гомологичных штаммов (при концентрации антигена 10 мг/мл) 1:8 - 1:64.
Выбор оптимальной концентрации препарата слизи и условий его сорбции на твердофазном носителе
При выборе оптимальней дозы антигена использовали различные концентрации очищенного видоспецифического антигена слизи синегнойной палочки выделенного из штамма $ 16 от 0,01 до 100 мкг/мл) по сухой навеске лиофилизованного материала). Антиген сорбировали в следующих буферных растворах: 0,05 М ацетатном буфере рН 4,5; 0,15 М фосфатном буфере рН 7,2; 0,05 М карбонат-бикарбонатном буфере рЕ 9,6. Кроличью антисыворотку к препарату слизи синегнойной палочки штамма JS 16 разводили до 1:20 000, а коньюгат анти- IgG кролика-пероксидаза разводили до 1:800. Как было отмечено в главе 2, результаты ищу - 106 ноферментной реакции учитывали колориметрически по интенсивности развития желтого окрашивания в лунках пластины при длине волны 492 нм.
Данные исследований представленных, на рис.3, свидетельствуют о том, что оптимальные концентрации препарата слизи, адсорбированного при трех разных значениях рН буферных растворов различаются сущзственно. Наибольшее увеличение значений оптической плотности наблюдали при иммобилизации антигена в 0,15 М фосфатном буфере рН 7,2. При данных условиях сорбции антигена кривая изменения величины оптической плотности в зависимости от дозы антигена достигает плато при концентрации последнего 25 мкг/мл. Дальнейшее увеличение дозы антигена не приводило к возрастанию показателя оптической плотности.
При иммобилизации препарата слизи в двух других буферных растворах в указанном диапазоне концентрации мы не наблюдали достижения максимуму оптической плотности. Очевидно, что наибольшее увеличение показателя оптической плотности при данных условиях было бы достигнуто при более высоких концентрациях антигена по сравнению стой концентрацией, которую мы обнаружили в предыдущем случае. Поэтому в наших исследованиях мы ограничились изучением оптимальных значений дозы антигена в случае его иммобилизации в 0,15 М фосфатном буферном растворе рН 7,2.
Однако использование в качестве антигена очищенного видо-специфического препарата слизи осложнялось тем, что последний при растворении давал мутные растворы, причем наблюдалось снижение серологической активности препарата, что, вероятно, объясняется его частичной денатурацией в процессе лиофилиза-ции. Ввиду этого в наших дальнейших экспериментах мы использо - 107 -0,8
Чувствительность иммуноферментной реакции в зависимости от условий сорбции и концентрации слизи синегнойной палочки. По оси абсцисс - десятичный логарифм концентрации антигена.
Ік- сорбция очищенного антигена при рЕГ4,5 ф- сорбция очищенного антигена при рН 7,2 - сорбция очищенного антигена при рН 9,6 Л- сорбция частично очищенного антигена при рН 7,2. - 108 вали частично очищенный из штамма № 16 препарат слизи, полученный путем осаждения этиловым спиртом. Препараты слизи, выделенные указанным способом, стабильны при хранении, свободны от бактериального загрязнения, при разведении дают полностью прозрачные растворы - то есть имеют свойства, предъявляемые к антигенам, используемым для иммуноферментного метода. Содержание белка, нуклеиновых кислот, общих углеводов в препаратах слизи, выделенных из одного штамма варьировало незначительно от., одной партии полученного антигена к другой. Препарат слизи, полученный из штамма синегнойной палочки Л 16, содержал по данным иммуноэлектрофореза четыре антигенных компонента, один из которых является видоспецифическим (фото 3). Оптимальные условия сорбции частично очищенного препарата слизи идентичны найденным в предыдущих экспериментах (рис.3), за исключением того, что существенно увеличивалась концентрация антигена до 100 мкг/мл. Этот факт не вызывает удивления, поскольку, как мы уже отмечали, препарат слизи содержит довольно значительное количество серологически неактивного материала, выявляемого при фракционировании на ионо-обменнике (рис.1). Таким образом, найденная концентрация препарата слизи, равная 100 мкг/мл, являлась оптимальной для выполнения иммуноферментного анализа и была использована в дальнейших экспериментах. При определении времени иммобилизации препарата слизи синегнойной палочки на поверхности рабочего объема лунок, нами было найдено, что сорбция антигена осуществляется в течение 18 часов в условиях комнатной температуры (рис.4). Пластины, иммобилизованные препаратом слизи, могут храниться - 109 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Бремя (час) Рис.4. Чувствительность иммунофарментной реакции от времени иммобилизации слизи на поверхности полистирола. - по по меньшей мере, в течение месяца без снижения специфической иммунологической активности антигена. 6.2. Подбор времени инкубации антисыворотки, полученной к антигену слизи, с гомологичным антигеном, и антислизевой сыворотки с коньюгатом анти- igG кролика В следующем разделе работы была изучена кинетика связывания специфических антител с препаратом слизи синегнойной палочки II 16. Установлено, что для полного их связывания необходимо не менее 6 часов (рис.5). Изучение кинетики связывания антислизевой антисыворотки с коньюгатом анти-igG кролика -пероксидаза показало, что для полного связывания антител с коньюгатом необходимо также 6 часов (рис.6). Для удобства проведения анализа коньюгат инкубировали с кроличьей сывороткой, полученной к препарату слизи синегнойной палочки, в течение 18 часов (ночи) и результаты реакции учитывали на следующий день.
