Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 22
1.1 Инфекции в гинекологии, акушерстве и неонатологии 22
1.1.1 Современные проблемы инфекционного контроля в акушерско-гинекологической и неонатальной службе 22
1.1.2 Эволюционные аспекты изменчивости микроорганизмов 23
1.1.3 Инфекции в гинекологии и акушерстве: от нормы к патологии 25
1.1.4 Инфекции в неонатологии 35
1.2 Современная микробиологическая диагностика оппортунистических
инфекций с применением инновационных технологий 42
1.2.1 Культуральная диагностика оппортунистических инфекций 42
1.2.2 Роль молекулярно-биологических методов в диагностике оппортунистических инфекций 44
1.2.3 Масс-спектрометрический анализ в микробиологии 50
1.2.3.1 Развитие масс-спектрометрии в идентификации микроорганизмов 50
1.2.3.2 MALDI–TOF–MS для идентификации грамотрицательных и грамположительных бактерий 59
1.2.3.3 MALDI–TOF–MS для идентификации трудноидентифицируемых бактерий 64
1.2.3.4 MALDI–TOF–MS для идентификации дрожжевых грибов 65
1.2.3.5 MALDI–TOF–MS для определения антибиотикорезистентности и типирования бактерий 68
1.2.4 Прямая индикация микроорганизмов в биологических жидкостях 70
1.2.4.1 Метод проточной уроцитофлюориметрии для диагностики бактериурии 70
1.2.4.2 MALDI–TOF–MS для прямой индикации микроорганизмов в моче и крови 72
1.2.5 Перспективы комплексного внедрения новых технологий в рутинную практику для решения задач «быстрой микробиологии» 75
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 77
2.1 Клинический материал и общий объем проведенных исследований 77
2.2 Бактериологические методы 81
2.3 Протеометрические методы 85
2.3.1 Видовая идентификация методом MALDI–TOF–MS анализа выделенных при посеве микроорганизмов 85
2.3.2 Прямая индикация микроорганизмов в клиническом материале методом MALDI–TOF–MS анализа 88
2.4 Молекулярно-биологические методы 89
2.4.1 Метод ПЦР в диагностике состояния микроценоза влагалища 89
2.4.2 Молекулярно-генетическое типирование микроорганизмов 91
2.5 Уроцитофлуориметрический метод анализа мочи 92
2.6 Статистическая обработка данных 93
ГЛАВА 3. Изучение диагностической возможности метода MALDI–TOF–MS анализа при идентификации и штаммовой дифференциации микроорганизмов 96
3.1 Оптимизация технологии проведения MALDI–TOF–MS анализа бактерий 96
3.1.1 Оптимизация технологии MALDI–TOF–MS анализа нейссерий и изучение возможности их штаммового типирования 96
3.1.2 Оптимизация технологии MALDI–TOF–MS анализа стафилококков и изучение возможности их штаммового типирования 102
3.1.3 Оптимизация технологии MALDI–TOF–MS анализа лактобацилл 108
3.2 Оптимизация технологии MALDI–TOF–MS анализа дрожжевых грибов...111
ГЛАВА 4. Оценка диагностической значимости MALDI–TOF–MS в сравнении с традицонными бактериологическими и молекулярно-генетическими методами 118
4.1 Оценка достоверности видовой идентификации грамположительных бактерий 118
4.2 Оценка достоверности видовой идентификации грамотрицательных бактерий 130
4.3 Оценка достоверности видовой идентификации трудноидентифицируемых (в том числе строгих анаэробных) бактерий 139
4.4 Оценка достоверности видовой идентификации дрожжевых грибов 150
ГЛАВА 5. Разработка технологии прямого MALDI–TOF–MS анализа микроорганизмов в клиническом материале (моча, кровь) и оценка возможности ее применения при скрининге бактериурии и бактериемии 158
5.1 Разработка и усовершенствование технологии прямого масс-спектрометрического профилирования микроорганизмов в моче и оптимизация диагностики бактериурии 158
5.2 Разработка и усовершенствование технологии прямого масс -спектрометрического профилирования микроорганизмов в гемокультуре и
оптимизация диагностики бактериемии 167
ГЛАВА 6. Изучение особенностей микроценозов у беременных и новорожднных в норме и патологии с использованием инновационных методов 174
6.1 Результаты изучения состояния микроценоза влагалища беременных женщин на основе комплексной микробиологической (культуральной, протеометрической и молекулярно-генетической) оценки 174
6.2 Результаты выявления различными микробиологическими методами особенностей микробной колонизации и этиологии ИВЗ у новорожднных,
находящихся на выхаживании в стационаре 187
ГЛАВА 7. Разработка диагностического алгоритма микробиологического обследования беременных и новорожднных с применением инновационных технологий 200
7.1 Разработка методологических подходов к созданию диагностических панелей для быстрой идентификации возбудителей внебольничных и внутрибольничных инфекций 200
7.2 Разработка оптимального алгоритма микробиологического обследования
беременных женщин 213
7.3 Определение наиболее эффективного метода микробиологического мониторинга в неонатальных стационарах 216
Обсуждение результатов 220
Выводы 242
Практические рекомендации 244
Приложения 245
Список литературы
- Современные проблемы инфекционного контроля в акушерско-гинекологической и неонатальной службе
- Видовая идентификация методом MALDI–TOF–MS анализа выделенных при посеве микроорганизмов
- Оптимизация технологии MALDI–TOF–MS анализа нейссерий и изучение возможности их штаммового типирования
- Оценка достоверности видовой идентификации грамотрицательных бактерий
Введение к работе
Актуальность исследования. В течение последнего десятилетия в России проблема репродуктивного здоровья женщин относится к числу приоритетных в демографической политике государства. Реализация национальных программ в сфере здравоохранения способствует динамичному развитию и неонатальной службы, что позволило перейти на международные стандарты выхаживания новорожденных с низкой и экстремально-низкой массой тела (ОНМТ, ЭНМТ), родившихся раньше срока (Национальный проект «Здоровье», 2006; ФЗ от 21 ноября 2011г. №323–ФЗ; Приказ МЗ РФ от 27 декабря 2011г. №1687н). Одним из основных направлений развития медицинской помощи является совершенствование диагностики и профилактики инфекционно-воспалительных заболеваний (ИВЗ) и мониторинг возбудителей инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП) в условиях стационара (Сергевнин В.И., 2008; Крапивина И.В., 2010). Согласно Национальной концепции профилактики ИСМП, стратегической задачей здравоохранения является обеспечение качества медицинской помощи и создание безопасной среды пребывания для пациентов в организациях, осуществляющих медицинскую деятельность (Концепция профилактики ИСМП, 2011).
Несмотря на постоянный поиск новых быстрых методов диагностики, способов лечения и профилактики инфекционных осложнений в акушерстве и гинекологии, гнойно-воспалительная заболеваемость при данной патологии до настоящего времени остается высокой, а летальность достигает 5-26% (Сидорова И.С., 2006 Серов В.Н., 2011). По опубликованным данным среди живорожденных детей от 27 до 36% внутриутробно инфицированы, из них доля недоношенных новорожденных достигает 60%. Инфекции в 16% случаев являются причиной мертворождаемости и от 11 до 45% – смертности новорожденных (Кафарская Л.И., 2002, Боровкова Е.И., 2005, Зубков В.В., 2009).
Особый интерес, в настоящее время, заслуживают оппортунистические инфекции – заболевания, вызываемые условно-патогенными микроорганизмами (УПМ), которые обычно не приводят к болезни у здоровых людей. УПМ, в норме колонизирующие кожные покровы, слизистые оболочки урогенитального и желудочно-кишечного трактов (ЖКТ), нередко способны вызывать ИВЗ у пациентов с приобретенными иммунодефицитными состояниями, в том числе у беременных, родильниц и новорожденных, в особенности недоношенных (Анкирская А.С., 2004; Петерсен Э., 2007).
Наличие огромного числа возбудителей оппортунистических инфекций, среди которых представители родов Staphylococcus, Enterococcus, Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Pseudomonas, Acinetobacter, Serratia и дрожжевых грибов рода Candida, существенно осложняет этиологическую диагностику и проведение своевременного, адекватного лечения на всех этапах оказания медицинской помощи (Бондаренко В.М., 2011). Известно, что широкое и не всегда оправданное применение антимикробных препаратов ведет к росту частоты инфекций, вызванных антибиотикорезистентными микроорганизмами (Козлов Р.С., 2007; Руднов В.А., 2011; Сидоренко С.В., 2003, 2009), которые легко реализуют свои патогенные свойства в отношении иммунокомпрометированных лиц. Несомненно, складывающаяся ситуация требует расширения и совершенствования методической базы выполнения микробиологических исследований с целью ускорения получения результатов и наиболее полного выявления всех возможных этиологических агентов (Шагинян И.А., 2000; Clark A., Fournier P., 2013).
В конце ХХ века произошла революция в методах, которые могут быть использованы для идентификации возбудителей оппортунистических инфекций, в том числе бактериальной природы. Наряду с традиционной культуральной диагностикой, появился целый арсенал молекулярно-генетических способов, а также протеомный анализ, основанный на использовании физических технологий, к числу которых относится матрично-активированная лазерная дезорбционная/ ионизационная времяпролётная масс-спектрометрия – MALDI–TOF–MS.
Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР), уже нашедшей достаточно широкое применение в практике, позволяет быстро провести индикацию микроорганизмов в клиническом образце, без культурального исследования, но в условиях преобладания оппортунистических инфекций этого оказывается недостаточно для установления истинного возбудителя. В частности, нет разработанных и сертифицированных комплексных диагностических панелей, а также отсутствуют способы быстрого определения детерминант резистентности к антибактериальным препаратам и возможность проводить штаммовую дифференциацию возбудителей инфекций (Weile J., 2009; Володин Н.Н., 2010).
Постепенно накапливаемый мировой опыт применения MALDI–TOF–MS для видовой идентификации микроорганизмов, выделенных из клинического материала, подтверждает высокую ценность данного метода, а потенциальная возможность проводить прямую индикацию бактерий в клиническом материале значительно сокращает сроки выполнения анализов и открывает новые ресурсы для использования в различных схемах микробиологической диагностики (Dare D., 2006; Seng P., 2009; Ильина Е.Н., 2009; El-Bouri K., 2012).
Учитывая специфику акушерско-гинекологических и неонатальных стационаров, где от быстроты принятия решения часто зависит жизнь пациента, внедрение MALDI–TOF–MS может оказаться практически высокозначимым и важным процессом. Совершенствование комбинаций молекулярно-генетического и протеомного тестирования, дающих возможность быстрой и точной видовой идентификации микроорганизмов, проведения молекулярного типирования лекарственно устойчивых штаммов, и тем самым, улучшение качества диагностики и лечения оппортунистических инфекций в целях сохранения здоровья матери и ребенка является приоритетным в данном научном исследовании.
Степень разработанности темы. Идея исследования базируется на анализе имеющихся в научной литературе работ по использованию современных молекулярно–биологических методов диагностики оппортунистических инфекций (Трофимов Д.Н., 2010; Ворошилина Е.С., 2012), а также появившейся возможности проводить видовую идентификацию УПМ с помощью MALDI–TOF–MS на основе анализа специфического маркера бактерий – профиля белковых спектров. В начале XXI столетия метод MALDI–TOF–MS предложен как способ идентификации бактерий, выделенных на питательных средах, а в 2002 году за его открытие К. Tanaka и J. Fenn присуждена Нобелевская Премия (Lay O., 2001; Wilkins C., 2006; Ильина Е.Н., 2009).
Начиная с 2000-х годов, в мире проводятся исследования по изучению достоверности MALDI–TOF–MS идентификации различных родов бактерий, грибов и простейших, а также по определению целесообразности использования метода в рутинной практике микробиологических лабораторий (Clark A., 2013). За это время постепенно создаются системы и базы данных масс-спектров микроорганизмов. Однако, несмотря на то, что анализ микробных изолятов проводится по принципу отпечатка пальцев («finger print»), его дискриминационная способность по видам нередко варьирует. Примечательно, что влияние на воспроизводимость масс-спектров и достоверность результатов оказывают отсутствие в базах данных сведений о ряде бактериальных таксонов, а также стандартов культивирования и подготовки проб (Yen-Peng Ho, 2010; Reich M., 2013). Малоизученными пока остаются возможности использования MALDI–TOF–MS при видовой идентификации трудноидентифицируемых микроорганизмов, прямой индикации УПМ в клиническом материале, определении антибиотикорезистентности и штаммовой дифференциации микроорганизмов.
Проблема микробиологического мониторинга за возбудителями ИВЗ и нозокомиальных инфекций является актуальным вопросом на протяжении последних десятилетий (Анкирская А.С., 2004; Крапивина И.В., 2010). Необходимость определения методологических основ, как комплексной, так и дифференцированной диагностики оппортунистических инфекций в клинической практике и разработки алгоритмов обследования беременных и новорожденных не вызывает сомнений.
Цель исследования: Оптимизировать микробиологическую диагностику оппортунистических инфекций у беременных и новорожденных на основе комплекса автоматизированных бактериологических, MALDI–TOF–MS и молекулярно-генетических (ПЦР, секвенирование) технологий.
Задачи исследования
-
Изучить диагностические возможности метода MALDI–TOF–MS анализа при видовой идентификации и штаммовой дифференциации микроорганизмов, а также усовершенствовать преаналитические этапы исследования для повышения достоверности результатов.
-
Сравнить диагностическую ценность MALDI–TOF–MS c традиционными бактериологическими и молекулярно-генетическими методами при видовой идентификации условно-патогенных микроорганизмов, выделенных из различных локусов у пациентов акушерско-гинекологического и неонатального профилей.
-
Разработать технологию прямого MALDI–TOF–MS анализа микроорганизмов в клиническом материале (моча, кровь) и оценить возможность его применения при скрининге бактериурии и бактериемии.
-
Изучить особенности микроценоза влагалища у беременных женщин в норме и при различных вариантах его нарушений, используя сочетание культурального метода, MALDI–TOF–MS анализа и количественной ПЦР.
-
Обосновать целесообразность использования и место MALDI–TOF–MS анализа и количественной ПЦР в системе микробиологического мониторинга у новорожденных с высоким риском развития инфекционной патологии.
-
Разработать методологические подходы к созданию диагностических панелей молекулярно-генетического выявления условно-патогенных микроорганизмов и детерминант их лекарственной устойчивости.
-
Разработать диагностические алгоритмы микробиологического обследования беременных и новорожденных с использованием современных методов диагностики оппортунистической инфекций.
Научная новизна
Оптимизация и усовершенствование преаналитических этапов MALDI–TOF–MS позволили систематизировать микробиологический анализ и ускорить видовую идентификацию труднодиагностируемых микроорганизмов (лактобацилл, грибов, коринебактерий, актиномицетов, строго анаэробных бактерий, нейссерий), а также проводить прямую индикацию возбудителей в биоматериале (моча, кровь).
Впервые проведена комплексная сравнительная оценка методов видовой идентификации УПМ, выделенных из различных локусов у пациентов акушерско-гинекологического и неонатального профиля, с применением современных технологий: бактериологические (биохимические) методы, MALDI–TOF–MS, количественная ПЦР, секвенирование рРНК. Показаны преимущества и недостатки каждого из этих методов.
Расширены знания о составе микробиоты влагалища беременных женщин российской популяции в норме и при патологии. Впервые в этом экотопе выявлены лактобациллы 21 вида, основными, из которых являются L. crispatus, L. iners, L. jensenii и L. gasseri. Лактобациллы обнаружены во влагалище у всех обследованных женщин, причем: L. crispatus – ведущий вид при нормоценозе (79,8%), L. iners – при бактериальном вагинозе (84,0%). Опровергнуто представление о ведущей роли вида L. acidophilus в пуле молочно-кислых бактерий вагинальной микробиоты российских беременных женщин: вид L. acidophilus составил лишь 0,3% от общего количества идентифицированных лактобацилл.
Впервые изучение условий культивирования L. iners определило необходимость наличия в составе среды дефибринированной крови и обнаружило подавление их роста при низких значениях pH, а анализ воздействия аэрации определил предпочтение для роста L. iners облигатно-анаэробные условия.
Совокупность методов классической бактериологии, MALDI–TOF–MS анализа и секвенирования рРНК позволила выявить широкий спектр дрожжевых грибов, включающий 6 родов (Candida, Saccharomyces, Rodotorulla, Trichosporon, Pichia, Malassezia) 21 вида, при кандидозах у женщин репродуктивного возраста и у новорожденных. Установлена этиологическая роль грибов видов Candida non-albicans в развитии поздних неонатальных инфекций у новорожденных с низкой и экстремально низкой массой тела. Метод MALDI–TOF–MS оказался наиболее эффективным и достоверным способом видовой идентификации грибов. Получены отсутствующие в базе данных MALDI BioTyper воспроизводимые масс-спектры для штаммов Candida famata, Pichia fabianii, Malassezia furfur.
Впервые на госпитальных штаммах S. epidermidis и S. haemolyticus различных сиквенс-типов путем кластеризации индивидуальных масс-спектров с построением корреляционных матриц показана принципиальная возможность применения MALDI–TOF–MS для внутривидовой дифференциации этих бактерий.
Впервые предложена концепция дифференцированной микробиологической диагностики оппортунистических инфекций с включением протеометрических и молекулярно-генетических методов в протоколы микробиологического обследования беременных женщин и систему микробиологического мониторинга неонатального стационара третьего уровня.
Теоретическая и практическая значимость
Проведенное исследование обосновало достоверность и воспроизводимость результатов видовой идентификации микроорганизмов с помощью времяпролётной масс-спектрометрии и показало целесообразность ее внедрения в практику клинической микробиологии. Реализована возможность применения метода MALDI–TOF–MS анализа в рутинной практике бактериологической лаборатории для видовой идентификации ряда грамположительных, грамотрицательных УПМ (в том числе строгих анаэробов) и дрожжевых грибов, а также для их прямой индикации в клиническом материале (кровь, моча). Показана целесообразность применения метода MALDI–TOF–MS анализа в комплексной диагностике оппортунистических инфекций влагалища у беременных женщин и ИВЗ у новорожденных.
Значительная диагностическая ценность метода MALDI–TOF–MS анализа при видовой идентификации редко встречающихся и/или труднодиагностируемых микроорганизмов, таких как лактобациллы, нейссерии, коринебактерии, актиномицеты, ряд анаэробных бактерий открывает возможность изучать их роль как в формировании нормоценозов, так и развитии патологических состояний.
Полученные новые данные о частоте встречаемости различных видов лактобацилл при вагинитах в сравнении с нормоценозом, а именно доминирование вида L. crispatus во влагалище здоровых женщин, позволили теоретически обосновать использование L. crispatus при производстве пробиотических препаратов. Результаты исследования учтены при разработке отечественного биопрепарата Вагинормин-1, содержащего комплекс пробиотических штаммов L. crispatus, L. gasseri, L. plantarum.
Для проведения скрининга бактериурии, бактериемии и быстрого тестирования возбудителей внутриутробных, нозокомиальных, в т.ч. грибковых инфекций впервые разработаны комплексные диагностические панели, основанные на молекулярных технологиях и данных многолетнего микробиологического мониторинга инфекций в акушерско-неонатальном стационаре.
Полученные сравнительные результаты прямой MALDI–TOF–MS индикации микроорганизмов в моче, традиционных методов бактериологической диагностики и метода проточной уроцитофлюориметрии позволили определить оптимальный способ скрининга бактериурии. Предложенный «Способ скрининга бактериурии с помощью MALDI–TOF масс-спектрометрии и проточной цитофлюориметрии», оформлен в виде патента (заявка на патент от 23.12.2013, регистрационный №2013156910). На основании полученных данных предложена к разработке диагностическая панель для комплексной детекции уропатогенов в моче, основанная на молекулярных технологиях («Инфекции. Уро-панель»).
Сравнительные результаты индикации микроорганизмов в положительной гемокультуре методом прямой MALDI–TOF–MS и количественной ПЦР с применением разработанной диагностической панели для скрининга бактериемии («Инфекции. Септи-панель») показали возможность определять патогены в крови каждым из этих методов.
В рамках Государственного контракта № 16.522.12.2009 «Разработка и организация производства комплекса диагностических тест-систем на основе полимеразной цепной реакции в реальном времени для решения задач репродуктивной медицины и неонатологии», заключенному в целях осуществления мероприятий 2.2 Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007 - 2012 годы» совместно с ООО «НПО ДНК-Технология», разработаны и апробированы комплексные диагностические наборы для идентификации ряда УПМ при скрининге внутриутробных, внутрибольничных бактериальных и грибковых инфекций: «Инфекции. Неонатальный скрининг» и «Инфекции. Нозокомиальный скрининг». Дата подачи на регистрацию 28.10.2013 №ММ40797 и ММ40810. Показана целесообразность использования панелей для быстрой диагностики ИВЗ у новорожденных.
Материалы исследования и рекомендации нашли отражение в «Руководстве по лабораторной диагностике инфекций урогенитального тракта» (под ред. Домейка М. и др. – СПб.: Изд-во Н-Л, 2012г.); разработанных и внедренных в практику стационара 3 уровня алгоритмах микробиологического обследования беременных и новорожденных (утверждены главным врачом ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России 13 января 2014г.).
Методология и методы исследования
В работе использованы классические микробиологические (микроскопический, культуральный) и инновационные высоко технологичные (протеометрический (MALDI–TOF–MS анализ), молекулярно-биологические (количественная ПЦР, секвенирование 16S (или 18S) pPНК, мультилокусное секвенирование (MLST)), проточная уроцитофлюориметрия) методы исследования.
Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения
Алгоритм обследования беременных женщин, усовершенствованный алгоритм микробиологического мониторинга в отделениях новорожденных используются в практической работе отдела микробиологии и клинической фармакологии ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России: внедрены в работу научно-поликлинического и акушерско-гинекологических отделений, а также отдела неонатологии и педиатрии Центра. Материалы диссертации используются в лекционном материале при обучении на курсах повышения квалификации врачей, обучении клинических ординаторов и аспирантов, на семинарах и конференциях, проводимых в Центре, и на сертификационных курсах повышения квалификации по специальности «Бактериология» НИИ антимикробной химиотерапии ГБОУ ВПО «СГМА» Минздрава России.
«Руководство по лабораторной диагностике инфекций урогенитального тракта» (под ред. Домейка М. и др. / СПб.: Изд-во Н-Л, 2012г.); используется при диагностике инфекций урогенитального тракта в Российской Федерации.
Степень достоверности результатов исследования
Для решения поставленных задач в работе использованы современные средства и методы проведения анализа. Результаты исследования достоверны, что определятся достаточным объемом выборки анализируемых данных и их адекватной статистической обработкой. Научные положения документированы таблицами, рисунками и диаграммами. Сделанные выводы строго обоснованы и вытекают из результатов проведенных исследований.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: 15th International Pathogenic Neisseria Conferens, Квинсленд, 2006; 12th International Union against Sexually Transmitted infections World Congress (IUSTI), Нью Дели, 2011г.; VI Всероссийской научно-практическая конференции с международным участием «Рациональная фармакотерапия в Урологии 2012», Москва, 2012г.; Всероссийском конгрессе с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая практика в эпицентре женского здоровья», Москва, 2012г.; XVII научно-практической конференции «Интеграция в лабораторной медицине», Москва, 2012г.; заседании Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 2012г.; 22nd European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, (ECCMID), Лондон, 2012г.; V научно-практической конференции «Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ», Москва, 2012 г.; ХIV Международном конгрессе МАКМАХ по антимикробной терапии (МАКМАХ/ESCMID), Москва, 2012г.; 18th Congress of the International Society for Human and Animal Mycology (ISHAM), Берлин, 2012г.; XIII Всероссийском научном форуме «Мать и Дитя», Москва, 2012г.; 13th Asia-Pacific Congress of Clinical Microbiology and Infection (APCCMI), Пекин, 2012г.; V научно-образовательном конгрессе «Анестезия и реанимация в акушерстве и неонатологии», Москва, 2012г.; II международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Казань, 2012г.; VII Международный конгресс по репродуктивной медицине, Москва, 2013г.; 23rd ECCMID, Берлин, 2013г.; XV МАКМАХ/ESCMID, Москва, 2013г.; 28th International Congress of Chemotherapy and Infection (ICC 2013), Якохама, 2013г.
Обсуждение диссертационной работы состоялось на заседании апробационной комиссии 16 декабря 2013 года и Ученом Совете ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России 14 января 2014 года.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 52 научные публикации, в том числе 29 в рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК РФ.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Усовершенствованные преаналитические этапы в технологии MALDI–TOF–MS анализа повышают объективность и значительно сокращают сроки тестирования ряда грамположительных, грамотрицательных бактерий и дрожжевых грибов, а также позволяют быстро проводить видовую идентификацию микроорганизмов, ранее не диагностируемых традиционными классическими методами.
2. Разработанные технологии прямой MALDI–TOF–MS индикации микроорганизмов в моче и гемокультуре значительно (минимум на 24 часа) ускоряют выявление инфекционных агентов и могут использоваться как основной метод «быстрой микробиологии» при скрининге бактериурии и бактериемии.
3. Для достоверной оценки состояния микроценоза влагалища беременных женщин необходимо использовать комплекс протеометрических и молекулярно-генетических методов, что позволяет повысить качество диагностики дисбиотических нарушений и оппортунистических инфекций.
4. Дифференцированный подход и рациональное применение молекулярно-генетических и протеометрических методов в системе микробиологического мониторинга позволяют оперативно реагировать на негативные тенденции в течение эпидемического процесса в стационарах новорожденных, а также ускорить назначение этиотропной терапии в каждом конкретном случае.
Личный вклад автора в получении научных результатов. Автор самостоятельно планировала проведение данной научной работы, составляла дизайн исследования и план комплексного микробиологического обследования беременных и новорожденных. Для обработки и анализа результатов разработан «Протокол ведения микробиологического исследования», опытным путем подобраны протоколы пробоподготовки, на лабораторных и контрольных штаммах различных микроорганизмов отработаны этапы проведения масс-спектрометрического исследования. Автором лично выполнены анализ и интерпретация полученных результатов, формулировка выводов, практических рекомендаций, оформление диссертации и автореферата, предложены алгоритмы обследования беременных и новорожденных.
Клинический материал предоставлен врачами акушерско-гинекологических отделений (заведующие отделениями Кан Н.Е., Аполихина И.А., Байрамова Г.Р.) и отдела неонатологии и педиатрии (заведущий отделом Зубков В.В.) ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Лабораторные штаммы патогенных нейссерий получены в отделе микробилогии ФГБУ «ГНЦДиК» Минздрава России (заведующий отделом Фриго Н.В.). Молекулярно-генетические исследования проводились в лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ФГБУН «НИИ ФХМ» ФМБА России (заведующий лабораторией Ильина Е.Н.) и молекулярно-генетических методов исследования ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России (заведующий лабораторией Трофимов Д.Ю.).
Формы внедрения. Руководство, журнальные статьи, выступления на российских и международных конгрессах, патент, биопрепарат, диагностические тест-системы для научного и практического применения.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации и результаты проведённого исследования соответствуют паспорту научной специальности 03.02.03 – микробиология.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 7 глав, включающих обзор литературы, собственные исследования и их результаты, заключения, выводы, практические рекомендации, список литературы, содержащий 90 отечественных и 210 зарубежных источников. Работа изложена на 293 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 44 таблицами, 45 рисунками и 5 иллюстрациями.
Современные проблемы инфекционного контроля в акушерско-гинекологической и неонатальной службе
Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения.
Алгоритм обследования беременных женщин, усовершенствованный алгоритм микробиологического мониторинга в отделениях новорожднных используются в практической работе отдела микробиологии и клинической фармакологии ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России внедрены в работу научно-поликлинического и акушерско-гинекологических отделений, а также отдела неонатологии и педиатрии Центра. Материалы диссертации используются в лекционном материале при обучении на курсах повышения квалификации врачей, обучении клинических ординаторов и аспирантов, на семинарах и конференциях, проводимых в Центре и на сертификационных курсах повышения квалификации по специальности «Бактериология» НИИ антимикробной химиотерапии ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
«Руководство по лабораторной диагностике инфекций урогенитального тракта» (под ред. Домейка М. и др. / СПб.: Изд-во Н-Л, 2012г.) используется при диагностике инфекций урогенитального тракта в Российской Федерации.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: 15th International Pathogenic Neisseria Conference, North Queensland, Australia, 2006г. 12th IUSTI International Union against Sexually Transmitted infections World Congress, NewDelhi, India, 2011г. VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Рациональная фармакотерапия в Урологии 2012», Москва, Россия, февраль 2012г. Всероссийском конгрессе с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая практика в эпицентре женского здоровья», Москва, Россия, март 2012г. XVII научно-практической конференции «Интеграция в лабораторной медицине», Москва, Россия, март 2012г Всероссийском научно-практическом обществе эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, Россия, 2012г. 22rd European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, (ECCMID), London, United Kingdom, March-April 2012г. V научно-практической конференции «Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ», Москва, Россия, май 2012г ХIV Международном конгрессе межрегиональной ассоциации по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии (МАКМАХ/ESCMID), Москва, май 2012г. 18th Congress of the International Society for Human and Animal Mycology (ISHAM), Berlin, Germany, июнь 2012г. XIII Всероссийском научном форуме «Мать и Дитя», Москва, Россия, сентябрь 2012г. 13th Asia-Pacific Congress of Clinical Microbiology and Infection (APCCMI), Beijing, China, October 2012. Ученом совете ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия, ноябрь 2012г. V Научно-образовательном конгрессе «Анестезия и реанимация в акушерстве и неонатологии» (АРАН), Москва, Россия, ноябрь 2012г. II международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Казань, Россия, ноябрь 2012г. VII Международном конгрессе по репродуктивной медицине, Москва, Россия, январь 2013г 23rd ECCMID, Berlin, Germany, April 2013. XV международном конгрессе МАКМАХ/ESCMID, Москва, Россия, май 2013г. 28th International Congress of Chemotherapy and Infection (ICC 2013), Yokohama, Japan, June 2013. 24rd ECCMID, Barcelona, Spain, May 2014. XVI международном конгрессе МАКМАХ/ESCMID, Москва, Россия, май 2014г
Обсуждение диссертационной работы состоялось на межклинической конференции сотрудников Отдела микробиологии и клинической фармакологии, лаборатории молекулярно-генетических методов, клинико-диагностической лаборатории, Отдела неонатологии и педиатрии, поликлинического и акушерско-гинекологических отделений ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России 4 декабря 2013 года; заседании апробационной комиссии 16 декабря 2013 года и Ученом Совете ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России 14 января 2014 года.
Видовая идентификация методом MALDI–TOF–MS анализа выделенных при посеве микроорганизмов
За время изучения возможности применения масс-спектрометрии для видовой идентификации микроорганизмов постепенно создаются системы и базы данных для рутинного использования в микробиологических лабораториях. Однако, несмотря на то что анализ микробных изолятов с помощью MALDI–TOF–MS проводится по принципу отпечатка пальцев («finger print») и основывается на сравнении полученных масс-спектров бактерий с масс-спектрами в базах данных приборов, дискриминационная способность по видам варьирует в зависимости от метода и полноты используемой базы данных [24, 30]. Примечательно, что некоторые бактериальные таксоны, не представленные в базах данных, а также технические проблемы (такие, как вариации в условиях культивирования, подготовки проб и самого масс-спектрометра) оказывают влияние на воспроизводимость масс-спектров и достоверность результатов. Кроме того, такие микроорганизмы как, стрептококки, неферментирующие грамотрицательные и анаэробные бактерии, как правило, труднее дискриминировать, чем другие бактерии, хотя этот недостаток может быть в дальнейшем частично исправлен путем обогащения доступных баз данных спектров из большего количества штаммов [24, 37].
Имеются сообщения о способности MALDI–TOF–MS определять различные виды вирусов, но на сегодняшний день коммерчески доступные базы данных масс-спектрометров не содержат вирусные спектры, поэтому использование MALDI–TOF–MS в рутинной практике микробиологических лабораторий для определения вирусов пока не представляется возможным [25, 28].
Использование специальных условий (например, десорбции/экстракции в кислой среде и применение гидроксикоричной кислоты как матрицы) позволяет регистрировать масс-спектры молекул преимущественно белковой природы, что наиболее ценно, так как белки хорошо представлены в клетке в количественном соотношении и характеризуются определнной изменчивостью. Данный подход подразумевает прямой масс-спектрометрический анализ белковой фракции лизата микробной клетки, который исключает выделение и очистку отдельных белков. Называется такой метод «прямое белковое профилирование» [30, 207]. Впервые протокол «прямого белкового профилирования» бактерий методом масс-спектрометрии разработан на лабораторном штамме E.coli DH5 и основан на индивидуальности белков. Предназначен этот метод для видовой идентификации и штаммовой дифференциации бактерий [208]. Начиная с 2000-х годов, в мире стали проводиться исследования по изучению достоверности идентификации различных родов бактерий, грибов и простейших методом MALDI–TOF–MS анализа, а также по определению целесообразности его использования в рутинной практике микробиологических лабораторий. В течение этого периода времени усовершенствуются протоколы пробоподготовки, тестируются смеси растворителей с различными концентрациями и соотношениями для получения клеточного лизата, анализируются используемые для ионизации образца матрицы, изучается воспроизводимость масс-профилей, как для отдельного штамма, так и на уровне родов и видов бактерий [34, 206, 36, 209, 210].
Быстрая и наджная идентификация микроорганизмов без длительных манипуляций, связанных с пробоподготовкой материала, является одной из основных задач в клинической микробиологии. Анализ биологических проб всегда будет сложной процедурой из-за большого их разнообразия и определенных технических сложностей. С появлением масс-спектрометрии становится реальным быстро и с высокой пропускной способностью идентифицировать микроорганизмы при прямом анализе всей микробной популяции в биологических жидкостях практически без предварительной подготовки образца [30, 211].
Существуют различные методы, применяемые в сочетании с масс-спектрометрией, для достижения точности анализа: хроматографические методы, в том числе газовая хроматография (GC), капиллярный электрофорез, жидкостная хроматография (LC); иммуномагниты и наночастицы (NPS), а также родственные методы – SELDI и ESI-MS [36, 205]. Протеометрические подходы к идентификации микроорганизмов могут воспользоваться вариациями с геномными методами – измерение геномных последовательностей в результате различий в молекулярной массе продуктов ПЦР. Хотя в настоящее время ПЦР анализы могут быть конкретными, быстрыми и аналитически чувствительными, они не могут использоваться непосредственно для идентификации, особенно в случаях наличия в образце неизвестных (незаявленных в наборе) микроорганизмов. Методики, сочетающие в себе ПЦР и масс-спектрометрию, опираются на сильные стороны каждого из методов и помогают давать дополнительные сведения о тестируемых изолятах [36, 209].
На сегодняшний день одной из труднорешаемых задач в развитии масс-спектрометрии является стандартизация пробоподготовки образца при прямом анализе бактерий в биологических жидкостях. Наличие тканевых белков или метаболитов подавляет и мешает сигналам биомаркеров, сгенерированных из клеток микроорганизмов во время масс-спектрометрического анализа. Поэтому разработка специфических зондов для определенного микроорганизма – это подход, который может эффективно свести к минимуму помехи при анализе [36, 209]. Afonso C. и Fenselau C. описали метод детекции бактерий из сложных биологических смесей в сочетании с MALDI–MS. Они использовали метод аффинной съемки с использованием лектин-иммобилизирующего субстрата, как ловушку следов бактериальной клетки в комплексе биологических смесей [209].
Иммуномагнитный (Immunomagnetic) метод разделения в образцах предполагает применение магнитных частиц, покрытых антителами к конкретным микроорганизмам, например E.coli. Этот метод требует только микролитр объема материала и количество бактерий 107 клеток/мл, которые могут быть обнаружены в физиологическом буфере [209, 210].
Оптимизация технологии MALDI–TOF–MS анализа нейссерий и изучение возможности их штаммового типирования
Таким образом, достоверность видовой идентификации дрожжевых грибов методом MALDIOF-MS при культивировании на колумбийском агаре, не зависела от температурного режима (32C, 37С) и возрастала по мере увеличения длительности культивирования до 48 часов. Минимальные значения score (1,7-1,9) через 24 часа культивирования отмечены у четырех видов (С glabrata, С. norvegensis, С. dublimensis и С. albicans), а через 48 часов - у двух (С. glabrata С. dublimensis).
При использовании среды Сабуро через 24 часа культивирования при 32 C и 37С с низким значением score (1,5-1,6), неприемлемым для видовой идентификации, идентифицированы дрожжевые грибы двух видов: С. lusitamae и С. norvegensis. Через 48 часов культивирования на этой же среде указанные штаммы были идентифицированы со значением score (1,9-2,1), достаточным для определения видовой принадлежности грибов. При культивировании грибов на среде Сабуро при 32C в зависимости от степени достоверности (score 2,0 и более) идентифицированы половина штаммов в первые 24 часа и семь штаммов через 48 часов культивирования. Аналогичные результаты получены при культивировании на среде Сабуро в течение 24 и 48 часов при температуре 37С.
Результаты видовой идентификации дрожжевых грибов при различных условиях культивирования в сочетании с использованием стандартного метода предварительной экстракции белков показаны в таблице 8.
Частота получения результатов идентификации с различной степенью достоверности(score/%)
Из таблицы следует, что на колумбийском агаре все штаммы дрожжевых грибов вне зависимости от температурного режима и времени культивирования идентифицированы c различной степенью достоверности. Так, культивирование грибов на колумбийском агаре при 32 C позволило определить видовую принадлежность исследуемых штаммов с высокой степенью (score 2,0) в восьми случаях с тенденцией к возрастанию до девяти при увеличении времени культивирования до 48 часов. При 37C через 24 часа на колумбийском агаре с высокой степенью достоверности идентифицировано семь штаммов, а через 48 часов - восемь.
Таким образом, достоверность видовой идентификации с помощью метода MALDIOF-MS анализа дрожжевых грибов, культивированных на колумбийском кровяном агаре, не зависела от температурного режима (32C, 37С), но возрастала по мере увеличения длительности культивирования до 48 часов. Минимальные значения score (1,7-1,9) через 24 часа отмечены у четырех видов (С glabrata, С. norvegensis, С. dublmiensis и С. albicans), а через 48 часов - у двух (С glabrata и С. dubliniensis).
При использовании среды Сабуро через 24 часа культивирования при 32 C и 37C с низким значением score (1,5-1,6), неприемлемым для видовой идентификации, идентифицированы дрожжевые грибы двух видов: С. lusitaniae и С. norvegensis. Через 48 часов культивирования на этой же среде указанные штаммы были идентифицированы со значением score (1,9-2,0), т.е. достаточным для определения видовой принадлежности дрожжевых грибов. В зависимости от степени достоверности (score 2,0) при культивировании грибов на среде Сабуро при 32C в первые 24 часа идентифицировано восемь штаммов, а через 48 часов - девять. При культивировании на среде Сабуро в течение 24 и 48 часов при температуре 37C идентифицировано девять штаммов.
В целом, через 48 часов при прямой детекции белковых спектров дрожжевых грибов идентифицировано 100% исследованных культур. Более достоверные результаты видовой идентификации (score 2,0 и более) независимо от температурного режима получены через двое суток культивирования как на колумбийском агаре, так и на среде Сабуро.
Cравнение результатов идентификации дрожжевых грибов на колумбийском агаре методом прямой детекции белков и с использованием стандартного метода предварительной экстракции при прочих равных условиях 116 культивирования показало, что при помощи экстракции степень достоверности идентификации (score 2,0) повысилась при 32С, а при 37С она оставалась на прежнем уровне. На среде Сабуро при 32C на первые сутки значение score соответствовало 2,0 и более у 8 штаммов, а на вторые сутки удалось достичь максимальной степени достоверности идентификации у 100% дрожжевых грибов. При 37C на среде Сабуро как в первые, так и вторые сутки у 9 штаммов получены максимальные значения score. С умеренной степенью достоверности идентифицированы такие виды, как С. parapsilosis и С norvegensis.
В результате, метод предварительной экстракции с использованием среды Сабуро для культивирования грибов позволил идентифицировать с максимально достоверными значениями девять штаммов при 37C, независимо от длительности инкубации и десять - при 32C на вторые сутки культивирования.
Проведенное исследование показало, что методом прямой детекции белков идентифицировано до вида 100% исследованных штаммов грибов. Однако лучшие результаты получены при использовании для культивирования колумбийского кровяного агара независимо от температурного режима и чаще идентификация получена с максимально высокой степенью достоверности через 48 часов культивирования.
Использование метода предварительной экстракции белков позволило увеличить частоту получения высоко достоверных результатов идентификации до 100%. Лучшие результаты по сравнению с колумбийским кровяным агаром получены при культивировании на среде Сабуро, особенно на вторые сутки и независимо от температурного режима.
Использование метода прямой детекции белков и снижение порога оценочного коэффициента (score от 1,7) позволило идентифицировать 100% исследованных штаммов грибов, причм в подавляющем большинстве с высокой степенью достоверности (score 2,0). Анализ полученных данных в зависимости от условий культивирования не показал влияния температурного режима на результаты идентификации и не выявил существенного преимущества какой-либо из использованных питательных сред. В то же время, степень достоверности улучшалась через 48 часов инкубации в сравнении с результатами идентификации через 24 часа. Сопоставление MALDI–TOF–MS результатов идентификации с применением метода прямого нанесения образца на мишень со стандартным методом экстракции белков и биохимической идентификацией продемонстрировало совпадение определений видовой принадлежности дрожжевых грибов. Прямая детекция белков без предварительной экстракции заметно (с 5-10 минут на образец до 1-3 мин/образец) сокращает время идентификации и экономически менее затратна.
Оценка достоверности видовой идентификации грамотрицательных бактерий
1 Разработка и усовершенствование технологии прямого масс-спектрометрического профилирования микроорганизмов в моче и оптимизация диагностики бактериурии
Для оптимизации диагностики бактериурии нами отработана технология прямой масс-спектрометрической индикации микроорганизмов в осадке мочи. При этом изучена возможность видовой идентификации микроорганизмов при различных степенях бактериурии.
Учитывая отсутствие на момент начала исследования стандартных протоколов пробоподготовки осадка мочи к MALDI–TOF–MS анализу, разработана собственная оригинальная методика пробоподготовки, включающая обработку образца и режимы центрифугирования. Предварительно методика апробирована на опытных (модельных) образцах. Для этого в контейнер с 100 мл мочи здорового человека, у которого по предварительным результатам микроскопии осадка мочи отсутствовали бактерии, инокулировали 1 мл суспензии физиологического раствора, содержащего взвесь E. coli и получали разные концентрации бактерий в пробе мочи – 10х7, 10х6, 10х5, 10х4 КОЕ/мл. Один образец мочи без инокуляции бактерий использовали в качестве отрицательного контроля.
Пробоподготовку образца к масс-спектрометрическому исследованию проводили по следующему протоколу: – из контейнера отбирали 1,5-2 мл мочи, помещали в пластиковую центрифужную пробирку и центрифугировали на скорости 15000 об/мин в течение 20 минут для получения осадка; – к осадку добавляли 1 мл дистилированной воды и центрифугировали 10 минут, а вновь образовавшийся осадок ресуспендировали в 1 мл 80% этанола и центрифугировали ещ 10 минут; – осадок растворяли в растворе, состоящем из 15 мкл деионизованной воды и 35 мкл муравьиной кислоты, добавляли 50 мкл ацетонитрила и полученный образец центрифугировали 2 минуты; – один микролитр надосадочной жидкости (супернатант) размещали на 3 ячейки стальной мишени и высушивали на воздухе при комнатной температуре, затем покрывали 1 мкл матрицы (см. «Материалы и методы»).
Далее проводили масс-спетрометрический анализ согласно обычному протоколу. Для каждого спектра собраны и проанализированы 600 лазерных выстрелов (100х6 лазерных выстрелов с разных позиций target spot). Для анализа полученных масс-спектров использовали программное обеспечение MALDI Biotyper 3.0 (Bruker Daltonics, Германия).
В результате полученных данных исследования опытного образца при концентрациях бактерий в 10х7, 10х6, 10х5 КОЕ/мл E. coli идентифицирована со значением score 2,0 (рис. 31), а в пробе с 10х4 КОЕ/мл со значением score =1,876.
Таким образом, получена возможность применения метода MALDI–TOF– MS для прямой видовой идентификации микроорганизмов в осадке мочи с применением разработанного протокола. В дальнейшем отработанную методику прямого масс-спектрометрического анализа использовали при скрининге бактериурии всех образцов мочи, полученных в лаборатории, а также при изучении возможности оптимизации диагностики ИМП.
Проведен комплексный анализ 790 клинических образцов мочи, полученных при подозрении на ИМП у беременных и новорожднных, находившихся на амбулаторном или стационарном лечении.
Исследование проводили параллельно 3-мя методами: – Методом проточной уроцитофлюориметрии, на автоматическом бактериологическом анализаторе UF-500i (Sysmex corp., Япония) в ручном режиме измеряли содержание лейкоцитов (L) и бактериальных клеток в образцах мочи (BACT). – Методом прямого белкового профилирования осадка мочи c помощью MALDI–TOF масс-спектрометра Autoflex III (Bruker Daltonics, Германия). – Классическим культуральным методом, путем посева на питательные среды с последующей идентификацией и определением чувствительности к АМП на VITEK2Compact (BioMerieux, Франция). Результаты комплексного анализа 790 образцов показали: – отрицательными «-» всеми тремя методами оказались 422 образца, что составило 53,4%; – положительными «+» всеми тремя методами – 96 образцов (12,2%); – в 272-х образцах мочи (34,4%) имелись расхождения (рис. 32).
![Оптимизация лабораторной диагностики гонореи и антибиотикочувствительность Neisseria gonorrhoeae по материалам г. Екатеринбурга и Свердловской обл. [Электронный ресурс]](/i/i/4436/199888.png "Оптимизация лабораторной диагностики гонореи и антибиотикочувствительность Neisseria gonorrhoeae по материалам г. Екатеринбурга и Свердловской обл. [Электронный ресурс] Кобенко Эльвира Георгиевна")
