Оптимизация лабораторной диагностики гонореи и антибиотикочувствительность Neisseria gonorrhoeae по материалам г. Екатеринбурга и Свердловской обл. [Электронный ресурс] Кобенко Эльвира Георгиевна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. CLASS Обзор литератур CLASS ы 13

1.1. Эпидемиология гонококковой инфекции на современном этапе 13

1.2. Особенности клиническкого течения гонореи в современных условиях. Значение гонорейно-хламидийных ассоциаций 15

1.3. Современные методы лабораторной диагностики гонококковой инфекции - приемущества и недостатки. Методы определения чувствительности к антибиотикам 19

1.4. Современные подходы к типированию штаммов Neisseria gonorrhoeae 26

1.5. Современные биохимические и генетические аспекты адаптации к действию антибиотиков грамотрицательных микроорганизмов 31

1.6. Характеристика методов лечения гонореи и чувствительность Neisseria gonorrhoeae к антимикробным препаратам 35

Глава 2. Собственные исследования 42

2.1. Группы обследуемых контингентов 42

2.2. Клинический материал 43

2.3. Лабораторные методы диагностики 44

2.3.1. Бактериоскопический метод 44

2.3.2. Бактериологический метод 45

2.3.3. Молекулярно-биологический метод 49

2.4. Определение чувствительности к антимикробным препаратам 51

2.4.1. Дискодиффузионный метод 51

2.4.2. Метод серийных разведений 52

2.5. Определение продукции бета-лактамаз 56

2.5.1. Цефиназый тест определения продукции бета-лактамаз 56

2.5.2. Чашечный метод определения продукции бета-лактамаз 5 7

2.6. Анкетно-статистический метод 58

2.7. Методы статистической обработки 58

Глава 3. Чувствительность и специфичность отечественных ПЦР-систем «Амплис-Сенс-Гонорея» и «Гонопол» при обследовании на гонорею мужчин и женщин в сравнении с бактериоскопическим и бактериологическим методами 60

3.1. Чувствительность отечественных ПЦР-систем «АмплисСенс-Гонорея» и «Гонопол» при обследовании на гонорею мужчин и женщин с клиническими проявлениями инфекции 60

3.2. Специфичность отечественных ПЦР-систем «АмплисСенс-Гонорея» и «Гонопол» при обследовании на гонорею мужчин и женщин 61

3.3. Чувствительности бактериологического метода при обследовании мужчин и женщин с установленным диагнозом «гонорея» 62

3.4. Сравнение чувствительности и специфичности ПЦР тест-систем «Ам-плиСенс-Гонорея» и «Гонопол», культурального метода и бактериоскопии при обследовании мужчин и женщин 63

Глава 4. Показатели работы кабинетов профилактических медицинских осмотров по выявлению гонореи среди лиц декретированных профессий и сравние чувствительности молекулярно-биологического метода (ПЦР тест-системы «Гонопол» и «АмплиСенс-Гонорея») с бактериоскопическим методом при обследовании женщин декретированных профессий 66

4.1. Результативность работы кабинетов и отделений профилактических медицинских осмотров по активному выявлению гонореи среди лиц декретированных профессий при использовании бактериоскопического метода 66

4.2. Сравнение чувствительности молекулярно-биологического метода и бактериоскопии при профилактическом медицинском обследовании на гонорею женщин декретированных профессий 69

Глава 5. Чувствительность N. gonorrhoeae на территории г. Екатеринбурга и Свердловской области к наиболее часто применяемым антибактериальным препаратам 71

5.1. Чувствительность к пенициллину и распределение МПК пенициллина для умеренно-чувствительных и устойчивых изолятов N. gonorrhoeae 71

5.2. Динамика антибиотикочувствительности N.gonorrhoeae к пенициллину, тетрациклину, ципрофлоксацину, цефтриаксону, спектиномицину в период проводимого исследования - с 2002 по 2004 г.г. 75

5.3.Определение бета-лактамазнои активности N.gonorrhoeae при использовании цефиназного теста и чашечного метода 77

Глава 6. Сравнительный анализ антибиотикочувствительности и беталактамазной активности гонококков, циркулирующих в различных регионах России — Центральной части, Приморьи и на Урале 79

Заключение 84

Выводы 97

Практические рекомендации 98

Список литературы 99

• Характеристика методов лечения гонореи и чувствительность Neisseria gonorrhoeae к антимикробным препаратам
• Цефиназый тест определения продукции бета-лактамаз
• Сравнение чувствительности и специфичности ПЦР тест-систем «Ам-плиСенс-Гонорея» и «Гонопол», культурального метода и бактериоскопии при обследовании мужчин и женщин
• Сравнение чувствительности молекулярно-биологического метода и бактериоскопии при профилактическом медицинском обследовании на гонорею женщин декретированных профессий

Введение к работе

Актуальность проблемы

В Российской Федерации гонорея остается социально значимой инфекцией, что обусловлено ее широким распространением и неблагоприятным влиянием на репродуктивное здоровье населения [Гомберг М. А., 2000, Дмитриев Г. А., 2003, Кубанова А.А., 2004, Васильев М.Н., 2004].

Ежегодно в мире диагностируется около 60 миллионов случаев заболевания [Ison.C.A., 1998., Gersbase А.С.,1998]. В России на протяжении последних пяти лет, регистрируется 150-170 тысяч новых случаев гонореи, что в несколько раз меньше, чем в Западной Европе (1,2 млн. случаев в год), сопоставимой по численности населения с нашей страной [Gersbase А.С., 1998., Се-хин СВ., 2001., Федеральное Государственное статистическое управление, форма №9, 2000-2004 г.г.].

Согласно Приказам МЗ СССР № 1570 от 04.12.86. "Об улучшении выявления больных гонорей и трихомониазом в акушерских, гинекологических отделениях и урологических кабинетах поликлинник", а также МЗ РФ № 415 от 20.08.03. "Об утверждении протокола ведения больных «Гонококковая инфекция»" обязательному бактериологическому обследованию с изучением ферментативных свойств N.gonorrhoeae подлежат только девочки и женщины старше 60 лет, в остальных случаях верификация диагноза допускается на основании результатов одного из методов - культурального или бактериоско-пического (окраска мазков по Граму).

Однако, при исследовании отделяемого цервикального канала женщин с признаками инфекции чувствительность метода не превышает 40-50%. При хроническом или бессимптомном течении инфекции, когда микроскопическая картина может не укладываться в рамки общепринятых представлений о пейзаже мазков при урогенитальной гонорее (отсутствие «привычного» лейкоцитоза, четкости бобовидных форм и уменьшение размеров микроорганизма), а также в случае сочетания гонореи с бактериальным вагинозом, сопровож-

дающимся обилием сопутстствующей грам-вариабильной бактериальной флоры, возможность визуальной детекции гонококков бактериоскопическим методом практически исключается [Сехин СВ., 2002, Васильев М.М., 2003, Мавзютов А.Р., 2004].

Применение бактериоскопического исследования без учета характера процесса и пола пациента, при профилактическом медицинском обследовании лиц декретированных профессий (Приказ МЗ МП РФ № 90 от 14.03.1996 «О порядке проведения предварительных и периодических медицинских осмотров работников и медицинских регламентах допуска к профессии»), вероятно, способствуют формированию скрытого резерва неучтенной заболеваемости среди населения Российской Федерации (особенно среди женщин), о чем свидетельствует общий показатель заболеваемости гонореей, который в 2,8 раза выше среди мужчин, чем среди женщин (181,9 и 64,9), а доля осложненных форм в 4,5 раза выше у женщин, чем у мужчин (12,5% и 2,8%) {Федеральное Государственное статистическое управление, форма №14,1999].

Молекулярно-генетические методы исследования, основанные на ДНК-гибридизации и амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР, ЛЦР) при чувствительности от 94,7% до 99,8%, позволяют одновременно исследовать значительное количество образцов и идентифицировать возбудитель в течение 4,5-5 часов, определять малые количества нуклеиновой кислоты возбудителя и исследовать не только мазки - соскобы генитального тракта, но и мочу, пункта-ты, биопсийный материал [Buhner М., 1996., Stary А., 1997, Young Н., 1997, Alonzo Т., 1999, Van DyckE.,2001].

Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) регламентирована Приказом МЗ РФ от 21 февраля 2000 г. № 64 «Об утверждении номенклатуры клинических лабораторных исследований», тем не менее методы, основанные на выявлении ДНК возбудителя, не включены в отраслевые стандарты по гонорее, а данные о широкомасштабных исследованиях молекулярно-генетическими видами диагностики в параллели

с общепринятыми методами у разных контингентов обследуемых и о сравнительной эффективности отечественных ПЦР тест-систем отсутствуют [Сехин СВ., 2002, Фриго Н.В.,2004].

С начала 70-х годов во всем мире отмечается рост числа N.gonoirhoeae устойчивых к пенициллину и тетрациклину, а с начала 90-х годов и к фторхинолонам [Matsuda Т., 1990, Jons R .В., 1991, Backman М., 1995, Коау A. S., 1996, Adegbola R.A., 1997,TanakaM., 1997,FoxK.K., 1997, Lee К., 1998,DosenZ., 1999, BoswellFJ., 1999, Morse A., 2000, Tsunoe H., 2001, Ehret J.M., 2002].

На территории Российской Федерации выбор препаратов для лечения гонореи проводится эмпирически, без учета региональных исследований антибиотикочувствительности и бета-лактамазной активности гонококков, соответствующих требованиям Международного комитета по клиническим лабораторным стандартам (NCCLS) [Страчунский Л.С., 2000].

В Свердловской области изучение антибиотикочувствительности N .gonorrhoeae проводилось лишь в 1967-1972 г.г., причем, только к пенициллину. Результаты проводимых исследований свидетельствовали о 100% чувствительности к пенициллину [Фурман О.А. 1972, Беднова В.Н.,1983].

Несомненно, что эффективность профилактики распространения и
лечения инфекции, обеспечивающих предупреждение развития осложнений,
могут основываться только на использовании современных
микробиологических, молекулярно-генетических методов диагностики и
научно-обоснованных данных регионального мониторинга

антибиотикочувствительности N.gonorrhoeae [Кубанова А.А., 2004].

Все выше изложенное и определило актуальность и объем наших исследований, а также позволило сформулировать цель и задачи.

Цель работы - научно обосновать предложения по повышению качества лабораторной диагностики урогенитальной гонореи и изучить региональ-

региональные особенности антибиотикочувствительности и активности бета-лактамаз N. gonorrhoeae. Задачи

1. Определить чувствительность и специфичность полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием отечественных тест-систем «АмплиСенс-Гонорея», «Гонопол» в сравнении с бактериоскопическим и бактериологическим методами при обследовании на гонорею мужчин и женщин с воспалительными заболеваниями нижних отделов мочеполовой системы.

2. Сравнить эффективность молекулярно-биологического метода (ПЦР) с бактериоскопией при обследовании на гонорею женщин декретированных профессий.

3. Изучить активность бета-лактамаз и чувствительность к пенициллину, тетрациклину, цефтриаксону, ципрофлоксацину, спектиномицину изолятов N. gonorrhoeae, циркулирующих на территории г. Екатеринбурга и Свердловской области.

4. Сравнить данные об активности бета-лактамаз и антибиотикочувствительности N. gonorrhoeae в различных регионах Российской Федерации.

Научная новизна

1. Получены данные о высокой чувствительности и специфичности
отечественных ПЦР тест-систем ЦНИИЭ «АмплиСенс-Гонорея» (91,6-97,5%)
и НПФ «Литех» «Гонопол» (92,5-96,3%).

2. Доказано, что при обследовании женщин с клиническими проявлениями инфекции метод ПЦР превышает чувствительность бактериоскопии мазков (51,4%) при использовании тест-систем «Гонопол» (88,6%) в 1,7 и «АмплиСенс-Гонорея»(91,4%) в 1,8 раза.

3. Показано, что применение молекулярно-биологического метода (ПЦР) при профилактическом медицинском обследовании лиц декретирован-

декретированных профессий повышает показатель активного выявления гонореи на 1000 обследуемых в 5 раз.

4. Установлено, что на территории г. Екатеринбурга и Свердловской области преобладают штаммы N. gonorrhoeae устойчивые к пенициллину (95,4%) и тетрациклину (98,0 %) и в период с 2002 по 2004 г.г. отмечается увеличение устойчивости к цефтриаксону - в 1,9 раза и ципрофлоксацину — в 5,9 раза.

5. Выявлены существенные различия антибиотикочувствительности и активности бета-лакамаз N gonorrhoeae в различных регионах России.

Практическая значимость

1. Полученные результаты свидетельствуют, что при диагностическом обследовании на гонорею женщин в качестве основных методов допускается применение как бактериологического, так и метода ПНР с использованием отечественных тест-систем «Гонопол» и «АмплиСенс-Гонорея».

2. Высокая чувствительность молекулярно-биологического метода (ПЦР) свидетельствуют о целесообразности его применения при профилактическом медицинском обследовании лиц декретированных профессий.

3. Ежегодное увеличение на территории г. Екатеринбурга и Свердловской
области штаммов N.gonorrhoeae устойчивых к цефтриаксону и

ципрофлоксацину и различия антибиотикочувствительности N.gonorrhoeae в Центральной части России, Приморье и на Урале, а также существенные различия активности бета-лактамаз обосновывают актуальность регионального мониторинга.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Высокая чувствительность и специфичность молекулярно-биологического метода (ПЦР) с использованием праймеров отечественных тест систем «Гонопол» и «АмплиСенс-Гонорея» свидетельствуют о целесообразности применения при обследовании больных с воспалительными заболеваниями органов мочеполовой системы и женщин декретированных профес-

декретированных профессий при профилактических медицинских осмотрах

с целью своевременного выявления больных гонореей и снижения скрытого резерва неучтенной заболеваемости среди населения России.

2. Ежегодное увеличение устойчивых штаммов N. gonorrhoeae к
ципрофлоксацину в г. Екатеринбурге и Свердловской области и
существенные различия чувствительности N.gonorrhoeae к тетрациклину,
цефтриаксону, ципрофлоксацину, азитромицину в Центральной части России,
Приморье и на Урале доказывают практическую значимость региональных
исследований при составлении территориальных формулярных перечней по
лечению больных гонореей.

3. Различия активности бета-лактамаз в Центральной части, на Урале и
Приморье свидетельствуют о региональных особенностях в формировании
механизмов резистентности N. gonorrhoeae на различных территориях России.

4. Территориальная отдаленность регионов страны и биологические
особенности гонококка (аутолизис после 48 часов инкубации, потеря
активности бета-лактамаз при пересевах), объективно обусловливают
целесообразность организации региональных центров по мониторингу в
соответствии с требованиями NCCLS (США), с целью своевременного
внесения научно-обоснованных данных при составлении единого протокола
ведения больных гонореей.

Внедрение результатов в практику Результаты исследования внедрены в практику Уральского НИИ дерматологии и иммунопатологии, Свердловского областного кожно-венерологического диспансера, используются в учебном процессе на кафедре кожных и венерических болезней ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия».

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены на:

1. Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы терапии инфекций, передаваемых половым путем, и хронических дерматозов», г. Екатеринбург, 30-31 мая, 2002 г.

2. Межрегиональном научно-практическом семинаре «Генодиагностика и терапия инфекций, передаваемых половым путем», г. Екатеринбург, 23-24 апреля, 2003 г.

3. Первом Российском конгрессе дерматовенерологов г. Санкт-Петербург, 2003 г.

4. Заседании Свердловского отделения Российского общества дерматовенерологов, г. Екатеринбург, 2004 г.

5. Всероссийской научно-практической конференция «Медицинская микробиология - 21 век», г. Саратов, 2004 г.

6. 5-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней», г. Москва, 2004 г.

7. Межрегиональной научно-практической конференции «Организационно-экономические и социально-правовые реформирования дерматовенерологической службы», г. Екатеринбург, 21-22 октября, 2004 г.

8. 5-ой Всероссийской научно-практической конференции
«Генодиагностика инфекционных болезней», г. Москва, июль 2004;

9. IX съезде дерматовенерологов, г. Москва, июнь 2005.
Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Объем и структура диссертации

Диссерация изложена на 125 страницах машинописного текста, проиллюстрирована 15 таблицами и 13 рисунками; состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который состоит из 126 отечественных и 104 зарубежных источников.

Характеристика методов лечения гонореи и чувствительность Neisseria gonorrhoeae к антимикробным препаратам

До открытия антибиотиков и сульфаниламидных препаратов лечение гонореи с помощью местного применения антисептических средств было затяжным, малоуспешным и нередко приводило к развитию осложнений, в том числе к постгонорейным стриктурам уретры, которые встречались у 3-4% больных [Шинделькройт Б.И. 1936].

Еще немногим более 10 лет назад основными антибактериальными препаратами используемыми для лечения гонореи были пенициллины, которые ингибируют биосинтез клеточной стенки бактерий, оказывают бактерицидное действие на микроорганизмы, находящиеся в фазе роста, и тетрациклины, подавляющие биосинтез белка микробной клетки на уровне рибосом. Курс применения этих препаратов составлял 7 дней и более [Навашин СМ., 1992, Машковский М.Д., 1995, Справочник «Видаль»., 2000]. Однако применение антимикробных средств привело к возникновению и селекции штаммов N. gonorrhoeae, обладающих как хромосомной, так и плазмидной Р-лактамазной резистентностью [Abigail А.,1997, Gorwirz R.J., 1998, Handsfield Н.Н., et al., 1998].

Обнаружение пенициллиназопродуцирующих штаммов гонореи явилось значительным событием в венерологии. Первые публикации о выделении р -лактомазапродуцирующих штаммах в нашей стране появились в 1983 году [Беднова В.Н., 1983]. Несмотря на то, что в результате циркуляции пеницил-линазопродуцирующих штаммов от одного больного к другому гонококки могут терять способность продуцировать фермент, разрушающая активность р-лактамаз сопутствующей микрофлоры остается постоянной, а в ряде случаев усиливается [Swanson J., 1987, Дмитриев Г.А., 1988, Gordon S.M., 1999, Казанский В.А.,2002]. Закономерно, что курсовые дозы пенициллина, составляющие в первые годы его применения 150 000-200 000 ЕД, увеличились в 10-15 раз при неосложненной и в 20-30 раз при осложненной гонорейной инфекции. [КисинаВ.Н.,2003].

Общая резистентность гонококков к пенициллину в США составляет 13-15,6% [Gorwirz R.J., et al. 1991, Fox K.K., 1997., Adegbola R. A.,1997, Ison С. A., 1998, Morse A., 2000], а в странах Юго-Восточной Азии (Малайзия - 74 %, Вьетнам 98 %) [Коау A.S., 1996, ВОЗ, 1997].

Несмотря на высокую эффективность и широкое применение антибиотиков тетрациклинового ряда для лечения гонококковой инфекции, уже в первые годы его применения отмечались различные постгонорейные осложнения: у 16% больных, получивших тетрациклин, у 22%-получивших вибрамицин, у 9% -получавших рондамицин [Скуратович А.А., 1979]. В течение последних лет отмечено возрастание резистентности N. gonorrhoeae, к тетрациклинам, и, если в 1965 г. минимальная подавляющая концентрация тетрациклина составляла 0,5 мкг/мл, то в настоящее время среди 3-лактамазо-продуцирующих штаммов N. gonorrhoeae МПК тетрациклина соответствует 1 мкг/мл и выше [Adegbola R.A. et al. 1997]. В США число выделенных штаммов N. gonorrhoeae, устойчивых к тетрациклинам, достигает 15-20% от общего количества изолятов [Кпарр J.S. 1983, Fox К.К., 1997]. Высокий уровень резистентности к тетрациклину отмечен в Южной Корее, где он достигает 100% [Lee К., 1998], при этом в Швеции - всего 1,8% - 7,7% [Baskman М., 1995].

В последующем широкое распространение получили новые антибиотики, лечение которыми в течение даже одного дня стало в равной степени эффективным, в сопоставлении с курсовыми методиками. К таким антибиотикам относятся: цефалоспорины третьего поколения (цефтриаксон), который ингибирует ферменты клеточных мембран бактерий, находящихся в стадии размножения; спектиномицин - антибактериальный препарат трициклической группы, который нарушает синтез белка в микробной клетке, связываясь с 30S субъединицей бактериальных рибосом; фторхинолоны, которые ингибируют фермент ДНК-гиразу, контролирующую структуру и функции ДНК, а также влияют на синтнз РНК и белков, на стабильность мембраны и другие жизненные процессы бактериальных клеток [Навашин СМ., 1992, Машковский М.Д., 1995, Справочник «Видаль»., 2000].

Наметившаяся в последние годы тенденция к назначению однократных методик применения лекарственных средств основной задачей ставит эради-кацию микроорганизмов. В то же время следует учитывать, что инфицирование патогенными возбудителями может привести к обострению хронических неспецифических воспалительных процессов мочеполовых органов (сальпин-гоофоритов, циститов, простатитов и т.д.). В подобных ситуациях трудно ожидать клинического излечения при использовании коротких курсов препаратов, что обусловливает необходимость комплексной оценки клиинко-микробиологического состояния урогенитальной системы для выбора адекватной тактики терапии [Кисина В.И., 2003].

Благодаря широкому спектру антибактериальной активности и ввиду возросшей резистентности N gonorrhoeae к большинству антибиотиков цефтриаксон в США признан "золотым стандартом" в лечении гонококковой инфекции, т.к. микроорганизмы, обладающие множественной устойчивостью к таким антибиотикам, как пенициллины, более ранние цефалоспорины и ами-ногликозиды, являются чувствительными к цефтриаксону [Jons R.B. et al., 199Щвропейское руководство по клинической оценке антиинфекционных лекарственных средств Европейского общества клинической микробиологии и инфекционных болезней рекомендует при неосложненной гонорее использовать 250 мг цефтриаксона в однократной дозе (внутримышечно). Частота излечения при использовании этой схемы составляет более 98% для гениталь-ной и ректальной инфекций и более 90%) - для ее фарингеальной локализации [Satcher D., et al., 2000]. В 1998 г. изучена эффективность цефтриаксона в однократной дозе 500 мг при лечении неосложненной гонореи у 44 мужчин в возрасте от 18 до 48 лет. Клинико-лабораторное наблюдение показало отсутствие гонококков в уретральном отделяемом у 39 больных уже на следующий день после инъекции, у остальных они исчезли на 2-е и 3-й сутки [Иванов О.Л., 1998]. Изучение цефалоспоринов, показало, что они продолжают оставаться высокоэффективными препаратами для лечения гонококковой инфекции: этиологическое излечение составляет 98-100%), что свидетельствует о перспективности их дальнейшего применения. [Кубанова А.А., 2001, Козлов В. Г., 2001].

Одним из требований ВОЗ к препаратам, применяемым для лечения ШИШ, является комплаентность. К подобным препаратам относится, в частности спектиномицин (тромбицин), при применении которого в однократной курсовой дозе 2 г достигается этиологическое излечение в 96% наблюдений [Кубанова А. А., 1993].

Другим классом антимикробных препаратов, используемых при лечении гонореи и других ИППП, являются фторхинолоны, которые характеризуются большим объемом распределения, слабым связыванием с белками плазмы и полной биодоступностью после перорального приема. [Boswell F.J., 1999]. Начиная с 1989 года лечение гонореи рекомендовано одной перораль-ной дозой ципрофлоксацина и несмотря на возрастающую резистентность возбудителей гонорейной инфекции, преимущественно происходящей из Юго-Восточной Азии, к фторхинолонам, они, будучи безопасными, высокоэффективными и удобными в применении (одна пероральная доза) и недорогими, до последнего времени оставались наиболее предпочитаемыми препаратами для лечения как неосложненной, так и осложненной (например, острым тазовым воспалением) гонореи [Hook E.W., 1998], поэтому появление штаммов N. gonorrhoeae, устойчивых к хинолонам, вызывает особое опасение [Яковлев В.П., 1997, Кубанова А. А., 2004], т.к. устойчивость гонококков к лекарственным препаратам приводит к неэффективности лечения инфекции, возникновению клинических рецидивов заболевания, переходу гонореи в хроническую форму с последующим вовлечением в патологический процесс органов малого таза [Каминский А.А.,2001].

Цефиназый тест определения продукции бета-лактамаз

Тестирование всех выделеннных штаммов проводилось сразу после выделения свежей (не более 24 часов инкубации) чистой культуры гонококков.

Для постановки теста использовались официальные диски, пропитанные нитроцефином (Cefinase, Becton Dickinsom) следующим образом:

— Диск помещался на чистую чашку Петри и смачивался стерильной дистиллированной водой;

- С помощью стерильной платинвоой бактериологической петли не сколько колоний гонококков переносилось на диск.

При изменении цвета с жёлтого на розовый или красный в течение 5 с — 15 мин тест расценивается как положительный. При отсутствии изменения окраски диска через 15 мин - как отрицательный.

В качестве положительного контроля использовался штамм Staphylococcus aureus АТСС 29213, а в качестве отрицательного - Haemophilus influenzae АТСС 10211. 2.5.2. Чашечный метод определения продукции бета-лактамаз

Методика по определению бета-лактамазной активности гонококков чашечным методом проводилась в соответствии с приложением «Лабораторнаяя диагностика гонореи и трихомониаза» к Приказу МЗ СССР № 1570 от 04.12.86. "Об улучшении выявления больных гонорей и трихомонмазом в акушерских, гинекологических отделениях и урологических кабинетах поли-клинник".

При определении продукции бета-лактазы исследуемых изолчтов N. Gonorrhoeae использовали плотную питательную среду, пропись которой описана в разделе 2.3.2. (стр.41) без добавления сухого бычьего гемоглобина производства Becton Dickinson (США), стадартизованный диск с пенициллином производства производства bioMerieux (Франция), штамм чувствительный к пенициллину Staphylococcus aureus АТСС 209 и в качестве положительного контроля использовался продуцирующий бета-лактамазу штамм Staphylococcus aureus АТСС 29213.

Из суточной культуры штамма Staphylococcus aureus АТСС 209 готовили взвесь путем суспезирования в стерильнрм физиологическом растворе, которая сравнивалась со стандартом мутности соответствующей 0,5 МакФарланд, далее разводилась в 10 раз. Взвесь штамма Staphylococcus aureus АТСС 209 в объеме 6 мл вносили в 100 мл охлажденого до 45 градусов агара плотной питательной среды, тчательно перемешивали и разливали в стерильные чашки Петри. На застывшую среду в центр чашки помещали диск с пенициллином и, отступая от него 1-3 мм радиально до края чашки Петри, засевали испытуемые изоляты N.gonorrhoeae и контрольный - продуцирующий бета-лактамазу штамм Staphylococcus aureus АТСС 29213.

Учет результатов проводили после суточной инкубации чашек в термостате с повышенным содержанием влажности и С02 (3-5%) при температуре 37С. Через сутки среда, проастает чувствительным к пенициллину штаммом Staphylococcus aureus ATCC 209 за исключением зоны задержки роста вокруг доска с пенициллином, образуя "газон". Микроорганизмы, не продуцирующие бета-лактамазу, дают рост в виде полосы, не изменяя очертаний зоны задержки роста "газона". При выработке гонококком бета-лактамазы она нейтрализует пенициллин, диффундирующий в питательную среду из диска, в результате чего по краям линии роста такого микроорганизма по направлению к диску наблюдается рост Staphylococcus aureus ATCC 209 внутри среды, что приводит к искривлению очертаний зоны задержки роста "газона" (феномен "бабочки"). Степень искривления зоны задержки роста свидетеьствует о количестве вырабатываемой испытуемы штаммом бета-лактамазы. Микроорганизмы, продуцирующие стафтлоцин, который губительно действуют на ста-филококки,по ходу своего роста образуют полосу просветления в зоне роста чувствительного к пенициллину Staphylococcus aureus ATCC 209.

Важным является то, что при пересевах гонококк может потерять способность продуцировать бета-лактамазу.

Демонстрация определения продукции бета-лактамазы чашечным методом представлена в Главе 5 (стр. 73).

Для получения статистических данных по активному выявлению гонореи при профилактическом медицинском обследовании лиц декретированных профессий проводили анкетирование дерматовенерологических учреждений 18 субъектов РФ (Урал, Сибирь и Дальний Восток).

Диагностическую значимость бактериоскопического метода и ПЦР оценивали по отношению к культуральному исследованию, как к «золотому стандарту». Чувствительность рассчитывали как долю положительных результатов, полученных тестируемым методом, среди положительных результатов, полученных культуральным методом. Специфичность рассчитывали как долю отрицательных результатов, полученных тестируемым методом, среди отрицательных результатов, полученных культуральным методом. Чувствительность бактериологического метода расчитывали как долю положительных результатов, полученных при обследовании пациентов с подтвержденным диагнозом «гонорея» Согласованность методов проверяли с помощью теста МакНемара.

Статистическая обработка полученных данных осуществлялась с использованием параметрических и непараметрических методов статистического анализа, описанных в руководстве «Медико-биологическая статистика»[Glantz., 1999]. Количественные признаки предварительно исследовались на нормальность распределения. Для анализа качественных признаков использовался критерий %-квадрат, а для определения значимости различий средних величин — t-критерий Стьюдента.

Для качественных переменных определяли частоту и долю (%) от общего числа случаев, для количественных переменных - среднее арифметическое, среднеквадратическое отклонение и ошибку среднего, дисперсию, минимальное и максимальное значение показателей. Для исследования связи применялся коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Различия считались дос-товепными призначений Р 0,05. Статистические параметры вычислялись при помощи персонального компьютера на базе процессора Pentium 111-1000 (ОС Windous ХР) с использованием пакетов приклодных программ Microsoft Exel, BIOSTAT.

Сравнение чувствительности и специфичности ПЦР тест-систем «Ам-плиСенс-Гонорея» и «Гонопол», культурального метода и бактериоскопии при обследовании мужчин и женщин

Результаты чувствительности и специфичности ПЦР тест-систем «АмплиСенс-Гонорея» и «Гонопол», культурального метода, бактериоскопии при обследовании мужчин и женщин представлены на рис. 2, Рис. 3. Чувствительность и специфичность тест-систем «АмплиСенс-Гонорея», «Гонопол», бактериоскопии и культурального метода при обследовании женщин А ) Чувствительность Б) специфичность

Чувствительность и специфичность ПЦР тест-систем «АмплиСеяс-Гонорея» и «Гонопол», культурального метода и бактериоскопии при обследовании мужчин и женщин представлены на рис. 4.

. Чувствительность и специфичность тест-систем «АмплиСенс-Гонорея», «Гонопол», бактериоскопии и культурального метода при обследовании мужчин и женщин: а) чувствительность, 6) специфичность

Чувствительность и пецифичность тест-систем «АмплиСенс-Гонорея», «Гонопол» и культурального метода представлена на рис. 5. .

Чувствительность Специфичность

Рис. 5. Чувствительности1 ) и специфичность ) тест-систем «АмплиСенс-Гонорея», «Гонопол» и культурального метода.

Таким образом, по результатам наших исследований, молекулярно-биологический метод (ПЦР) с использованием праймеров отечественных тест - системы и является высоко чувствительным и специфичным («Гонопол» -91,6-92,5%, «АмплиСенс-Гонорея» - 96,3-97,5% соответственно) и превышает чувствительность бактериоскопического исследования при обследовании женщин с клиническими проявлениями инфекции (51,4%) при использовании тест системы «Гонопол» в 1,7 (88,6%), тест системы «АмплиСенс-Гонорея» в 1,8 раза (91,4%), что свидетельствует о целесообразности его применения в диагностических целях (рис. 3 а, 5) . Анализ работы кабинетов профилактических медицинских осмотров по выявлению гонореи среди лиц декретированных профессий и сравние чувствительности молекулярно-биологического метода (пцр тест-системы «гонопол» и «амплисенс-гонорея») с бактериоскопическим методом при обследовании женщин декретированных профессий

. Результативность работы кабинетов и отделений профилактических медицинских осмотров по выявляемости гонореи среди лиц декретированных профессий бактериоскопическим методом

Учитывая низкую чувствительность бактериоскопии при обследовании на гонорею женщин даже с клиническими проявлениями инфекции (51,4%) и регламентированное Приказами МЗ № 286 от 07.12.93. "О совершенствовании контроля за заболеваниями, передаваемыми половым путем" (приложение №6) и МЗ МП РФ № 90 от 14.03.1996 «О порядке проведения предварительных и периодических медицинских осмотров работников и медицинских регламентах допуска к профессии», применение микроскопии при профилактическом медицинском обследовании лиц декретированных профессий, среди которых высокий удельный занимают женщины, следующий раздел работы был посвящен изучению сравнительной эффективности молекулярно-биологического метода и бактериоскопии при обследовании декретированных групп населения.

С этой целью нами были проанализированы анкетно-статистические данные по выявляемости гонореи при профилактическом медицинском обследовании лиц декретированных профессий за 2001-2003 гг., полученные от дерматовенерологических учреждений 18 субъектов Урала, Сибири и Дальнего Востока РФ, которые представлены в табл. 8.

Сравнение чувствительности молекулярно-биологического метода и бактериоскопии при профилактическом медицинском обследовании на гонорею женщин декретированных профессий

Учитывая низкую чувствительность бактериоскопического метода при обследовании женщин с клиническими проявлениями инфекции (51,4%) и высокий удельный женщин среди лиц декретированных профессий, с целью сравнения эффективности бактериоскопии и ПЦР при профилактическом медицинском обследовании на гонорею лиц декретированных профессий, нами было исследовано 200 проб отделяемого цервикального канала женщин бак-териоскопическим, бактериологическим и молекулярно-биологическим методами (тест-системы «АмплиСенс - Гонорея», «Гонопол»).

Во всех случаях результаты бактерископического исследования были отрицательными. В трех случаях (1,5%), при отрицательном результате бактериоскопического исследования мазка отделяемого цервикального канала, окрашенного метиленовым синим и по Граму, гонококк был обнаружен бактериологическим и методом ПЦР с использованием обеих тест-систем. При микроскопии отделяемого цервикального канала женщин с бактериологически подтвержденной гонореей в мазках обнаруживались лейкоциты от 10 до 30 в поле зрения, "ключевые клетки" и Грам-вариабельная коккобацилярная микрофлора в большом количестве.

Из анамнеза женщин с подтвержденным диагнозом «гонорея» выяснено: две пациентки в возрасте 25 и 36 лет не состояли в браке (разведены), имели случайные половые связи и отягощенный гинекологический анамнез. Пациентка в возрасте 36 лет страдала вторичным бесплодием; пациентка в возрасте 28 лет, рожавшая в 18 лет, состояла в повторном браке, отличалась промис-куитетным типом поведения. Все женщины профилактические медицинские осмотры проходили регулярно, заболевание гонореей в прошлом и у половых партнеров отрицали. Таким образом, по результатам нашего исследования, применение мо-лекулярно-биологического метода по сравнению с методом бактериоскопии мазков повышает выявляемость гонореи среди женщин декретированных профессий не менее чем в 10 раз - с 0,13 до 1,5%, улучшая качественный показатель активной выявляемое на 1000 обследуемых в 5 раз - с 3,0 до 15,0, что свидетельствует о целесообразности применения ПЦР при профилактическом медицинском обследовании лиц декретированных профессий с целью сокращения резерва скрытой, неучтенной заболеваемости среди населения России.

Чувствительность Neisseria gonorrhoeae к наиболее часто применяемым антибактериальным препаратам и распределение МП К пенициллина для умеренно-чувствительных и устойчивых изолитов N.gonorrhoeae.

Массированное применение антибиотиков в терапии ИППП и отсутствие региональных данных по антибиотикочувствительности гонококков приводит к неконтролируемому накоплению мультирезистентных штаммов, которые обусловливают негативные результаты лечения и формирование вялотекущей, многоочаговой инфекции, поэтому нами была изучена чувствительность изо-лятов Neisseria gonorrhoeae к наиболее часто применяемым атибактериаль-ным препаратам.

Чувствительность изолятов Neisseria gonorrhoeae в период 2002-2004 гг.по материалам г.Екатеринбурге и Свердловской области

Выявление высокого процента умерен нечувствительных (75,3%) и устойчивых (22,7%) изолятов гонококков обусловило необходимость в изучени МПК данного антибиотика.

Распределение МГЖ пенициллина для 116 умереннорезистентных и 35 резистентных изолятов Neisseria gonorrhoeae представлено в табл. 11 и на рис. 8.

Распределение значений минимальных подавляющих концентраций пенициллина (МПК) для умеренночувствительных и устойчивых штаммов N. gonorrhoeae (%); У-Ч-умеренно-чувствительные (п = 116); Р - устойчивые (п = 35).

Анализ значений МПК пенициллина для умеренно-резистентных изоля-тов Neisseria gonorrhoeae, у которых в 64,6% случаев уровень МПК пенициллина — 1 (мкг/мл) максимально приближен к значению соответствующему резистентным штаммам - 2 (мкг/мл), а для резистентных - в 11,4% случаев МПК имеет максимально высокие значения - 16 и 32 (мкг/мл) (рис. 8). В тоже время, методом математического анализа определено среднее значение диаметров зон задержки роста исследуемых изолятов N. gonorrhoeae, которое соответствует значению "умеренно - чувствительные" (30,2 мм). При стандартном отклонении равному 6,7 (мм) и его смещении вправо, значение зоны задержки роста микроорганизма вокруг диска с пенициллином равно 36,9 (мм) и также соответствует значению "умеренно-чувствительные", а при отклонении влево - 23,4 (мм) - "устойчивые ", что еще раз указывает на тенденцию формирования устойчивости к пенициллину.

Изоляты Neisseria gonorrhoeae устойчивые к тетрациклину отмечены в 74% случаев. На основании значений совокупного профиля устойчивости изолятов гонококков к тетрациклину (95,4%) и пенициллину (98,0%), можно считать, что применение этих антибиотиков для лечения гонореи на территории Свердловской области нецелесообразно (табл. 12, рис. 9).

Похожие диссертации на Оптимизация лабораторной диагностики гонореи и антибиотикочувствительность Neisseria gonorrhoeae по материалам г. Екатеринбурга и Свердловской обл. [Электронный ресурс]

Оптимизация микробиологической диагностики туберкулеза. Особенности эпидемического процесса туберкулеза в Республике Саха (Якутия)Алексеева Галина Ивановна

Оптимизация микробиологической диагностики туберкулеза. Особенности эпидемического процесса туберкулеза в Республике Саха (Якутия)Алексеева, Галина Ивановна

Оптимизация методов диагностики Helicobacter pylori-инфекции у больных хроническими воспалительными заболеваниями гепатобилиарной системыИсаева, Гузель Шавхатовна

Оптимизация микробиологической диагностики оппортунистических инфекций у беременных и новорожденных на основе протеометрических и молекулярно-генетических методовПрипутневич Татьяна Валерьевна

Оптимизация и комплексное использование полимеразной цепной реакции в диагностике актуальных инфекционных заболеваний на модели острых кишечных, хеликобактерной, негонококковых урогенитальных инфекций и вирусных гепатитовМазепа, Владимир Николаевич

Оптимизация и комплексное использоваие полимеразной цепной реакции в диагностике актуальных инфекционных заболеваний на модели острых кишечных, хеликобактерной, негонококковых урогенитальных инфекций и вирусных гепатитовМазепа Владимир Николаевич

Бруцеллезные бактериофаги. Оптимизация технологии производства и способов применения в лабораторной диагностике бруцеллезаЛяпустина Лариса Вениаминовна

Оптимизация диагностики вируса кустистой карликовости малины методом RT-PCRНемцова Елена Валентиновна

Оптимизация диагностики хромосомных аномалий человека Гайнер Татьяна Александровна

Оптимизация диагностики и лечения лямблиозаЕрмакова Лариса Александровна