Введение к работе
Актуальность проблемы
Болезни желчного пузыря и желчевыводящих путей и печени составляют одну из важнейших медицинских и социальных проблем: во всем мире отмечается постоянный рост заболеваний гепатобилиарной системы. Хронический некалькулезный холецистит является одним из самых распространенных заболеваний не только среди болезней билиарного тракта, но и среди заболеваний органов пищеварения (Ильиченко А.А., 2001). Хроническим калькулезным холециститом страдает до 10% взрослого населения развитых стран. Из года в год растет количество операций на желчных путях, а также число послеоперационных осложнений, которые заставляют прибегать к повторным хирургическим вмешательствам и нередко приводят к стойкой потере трудоспособности больного.
Этиология заболеваний желчевыводящих путей до настоящего времени окончательно не установлена. В желчи больных с патологией билиарной системы обнаруживают патогенные (сальмонеллы, лептоспиры и др.) и условно-патогенные бактерии (кишечная палочка, клебсиеллы, протей, энтеробактер, стафилококки, энтерококки и др.), вирус гепатита А, грибы рода Candida, возбудители протозойных и глистных инвазий. В печати появились сообщения об обнаружении ДНК бактерий рода Helicobacter в органах гепатобилиарной системы (Avenaud P. et al., 2000; . et al., 2010; Dore M.P. et al., 2002; Esmat G. et al., 2012; Fan X.G. et al., 2002; Fukuda K. et al., 2002; Karagin P. et al., 2010; Lee J.-W et al., 2010; Moricz A. et al., 2010; Rocha M. et al., 2005; Silva L.D. et al., 2011; Xuan S.Y. et al., 2006). Роль Helicobacter pylori в развитии воспалительных заболеваний гепатобилиарной системы окончательно не изучена. Возможное участие H.pylori в патогенезе заболеваний гепатобилиарной системы подтверждают положительные результаты молекулярно-генетических, серологических исследований, выявление цитотоксического действия H.pylori на клеточные культуры гепатоцитов in vitro и в опытах in vivo на животных моделях (Zhou D. еt al., 2011). Обнаружение ДНК H.pylori в образцах слизистой оболочки желчного пузыря при холециститах, холелитиазе и карциноме сочеталось с выявлением этого микроорганизма в тканях иммуногистохимическими методами, что указывает на возможность обитания бактерии в билиарном тракте (. et al., 2011). Двухлетнее изучение патогенного действия H.pylori на мышей линии С57ВL/6, зараженных перорально, показало наличие сочетанного поражения слизистой оболочки желудка и печени в виде воспаления, фиброза, гиперплазии гепатоцитов (Tian X.F. еt al., 2008) и развитие первичного билиарного цирроза (Goo M.J. et al., 2008). Выявление корреляции между присутствием ДНК хеликобактеров и повышением клеточной пролиферации желчного эпителия демонстрирует высокую вероятность участия этих бактерий в генезе заболеваний билиарной системы (Fukuda K. et al., 2002).
Штаммы H. pylori отличает большое разнообразие. Для клинических изолятов H.pylori, выявляемых у больных с гастродуоденальной патологией, характерна выраженная генетическая гетерогенность в отношении факторов вирулентности – продуктов генов cagA, vacA, babA2 (Yamaoka Y., 1999). Определение связи между генотипами H. pylori и клиническими проявлениями у лиц, инфицированных определенными штаммами, представляет большой научный и практический интерес, но вопрос о генотипах изолятов H.pylori, колонизирующих гепатобилиарную систему остается не изученным.
Следует заметить, что в большинстве опубликованных работ указывается на трудности получения чистой культуры хеликобактеров: сообщения об успешном выделении бактерий рода Helicobacter из печени и желчи единичны (de Magalhaes Queiroz D.M. et al., 2001; Xuan S.Y. et al., 2006). Трудности бактериологического метода исследования могут быть обусловлены особенностями микроорганизма, недостатками технического исполнения или несовершенством питательных сред, что требует разработки новых диагностических подходов к детекции бактерий рода Helicobacter и совершенствования технологий культивирования микроаэрофильных и капнофильных микроорганизмов.
Потенциальная роль желчетолерантных хеликобактеров в генезе поражений печени и билиарного тракта может быть объяснена наличием определенных факторов патогенности этих возбудителей, запускающих каскад патологических процессов в гепатобилиарной системе , но их роль в поражении эпителия желчного пузыря и гепатоцитов остается не выясненной. Отсутствие «золотого» стандарта микробиологического подтверждения обнаружения хеликобактеров в тканях печени, желчного пузыря и желчи может оказывать сдерживающий эффект в исследованиях по изучению этиологической значимости этих бактерий в патогенезе заболеваний гепатобилиарной системы. Все вышесказанное объективно обосновывает необходимость оптимизации микробиологической диагностики заболеваний гепатобилиарной системы, ассоциированных с H.pylori – инфекцией, совершенствования и создания новых технологий культивирования и детекции бактерий рода Helicobacter.
Цель исследования: оптимизация методов диагностики Нelicobacter pylori инфекции у больных хроническими воспалительными заболеваниями гепатобилиарной системы с разработкой новых биотехнологий культивирования и детекции микроаэрофильных и капнофильных бактерий рода Helicobacter.
Задачи исследования:
-
Изучить микробиоценозы различных биотопов желудочно-кишечного тракта (желудка, 12-перстной кишки и желчного пузыря) у больных хроническими воспалительными заболеваниями гепатобилиарной системы.
-
Определить частоту обнаружения H.pylori в органах гепатобилиарной системы и морфологические изменения слизистой оболочки желчного пузыря при H.pylori – инфекции.
-
Выявить частоту обнаружения H.pylori молекулярно-генетическими методами и изучить гены патогенности изолятов H.pylori, выделенных от больных с гепатобилиарной патологией.
-
Провести микробиологический мониторинг циркуляции H.pylori – инфекции с изучением динамики распространенности хеликобактериоза среди жителей г.Казани.
-
Усовершенствовать диагностику H.pylori –инфекции путем разработки новых биотехнологий культивирования и детекции.
-
Разработать алгоритм комплексного исследования, направленного на выявление инфицирования H.pylori больных с гепатобилиарной патологией.
Научная новизна
Впервые выполнено одновременное изучение пристеночной микрофлоры слизистой оболочки желудка, 12- перстной кишки, желчного пузыря и желчных протоков с морфологической оценкой патологических изменений слизистых оболочек больных с воспалительными заболеваниями билиарного тракта и пациентов контрольной группы без гепатобилиарной патологии, что позволило оценить значение расстройств микробиоценозов биотопов гастродуоденальной зоны и билиарного тракта в развитии хронических воспалительных заболеваний гепатобилиарной системы. Выявлена высокая частота инфицирования органов гепатобилиарной системы H.pylori у больных хроническим некалькулезным холециститом и циррозом печени, ассоциированная с развитием патологических морфологических изменений, что дало возможность установить этиологическое значение этого микроорганизма в патогенезе хронических воспалительных заболеваний гепатобилиарной системы. Обнаружены закономерности колонизации различных биотопов микроорганизмами (бактериями, грибами, простейшими) с определением частоты и степени обсемененности, что позволило продемонстрировать прямую связь гастродуоденального дисмикробиоценоза и микробохолии, а также верифицировать восходящий (дуоденогенный) путь инфицирования желчных путей.
Впервые в результате изучения генов патогенности изолятов H.pylori, выделенных из органов гепатобилиарной системы, определены доминирующие генотипы, выявлены закономерности распределения Tox+ и Tox- генотипов при патологии гепатобилиарной системы. Обнаружены существенные различия генотипов H.pylori, выделенных из гастродуоденальной зоны, желчного пузыря и печени, что позволило выявить феномен специфичной колонизации гепатобилиарного тракта штаммами хеликобактеров, отличных от изолятов, колонизирующих желудок или двенадцатиперстную кишку. Впервые получены новые данные о преимущественной роли сagA – негативных штаммов H.pylori, связанные с выявлением ранее неизученных сторон патогенеза хеликобактериоза, при этом показана роль данного микроорганизма в развитии хронических воспалительных заболеваний гепатобилиарной системы.
Установлена высокая частота распространенности H.pylori инфекции среди жителей города Казани как среди детского, так и взрослого населения c тенденцией повышения инфицированности с возрастом и достижения в подростковом возрасте уровней инфицирования взрослых, что указывает на сохранение высоких степеней риска для этой популяции развития онкологических заболеваний желудочно-кишечного тракта и требует широкого внедрения скрининговых методов диагностики хеликобактериоза и проведения своевременной эрадикационной терапии с целью первичной профилактики злокачественных новообразований.
Разработан оптимальный диагностический комплекс исследований для применения в условиях микробиологических лабораторий, который включает современные высокоэффективные микробиологические и молекулярно-генетические методы и отвечает актуальным требованиям технологии обследования пациентов с целью выявления возбудителя и назначения эрадикационной терапии. Создана комбинированная питательная среда для накопления бактерий рода Helicobacter, позволяющая облегчить идентификацию и постановку антибиотикограмм, а также разработан метод окраски катионовым синим (О) основным для детекции H.pylori и выявления патоморфологических изменений.
Теоретическая значимость работы
Исследования микробиоценозов различных биотопов желудочно-кишечного тракта (желудка, 12-перстной кишки и желчного пузыря) у больных хроническими воспалительными заболеваниями гепатобилиарной системы позволили установить связь дисбиотических нарушений с развитием патологических морфологических изменений в органах гепатобилиарной системы. Научно обоснована и разработана новая концепция этиологической и патогенетической роли H. pylori в развитии хронических воспалительных заболеваний гепатобилиарной системы. Выявление закономерностей колонизации органов гепатобилиарной системы различными генетическими вариантами H.pylori позволило раскрыть ранее неизученные вопросы патогенеза хеликобактериоза и послужило основой для развития инфекционной теории роли микроорганизмов в патогенезе воспалительных заболеваний гепатобилиарной системы.
Практическая значимость исследования.
Выявлена корреляция патоморфологических изменений слизистой оболочки желчного эпителия с микробохолией, которая позволяет предположить значение микробной колонизации желчных путей в развитии хронического воспаления. При этом тяжесть морфологических изменений находится в прямой зависимости от колонизации H.pylori и степени обсемененности. Результаты, полученные в ходе исследования, подтверждают предположение о существовании желчетолерантных вариантов H.pylori, что указывает на необходимость коррекции микробиоценозов желчевыводящих путей с помощью противомикробных и пробиотических препаратов.
Высокая частота распространенности H.pylori инфекции среди жителей города Казани как среди детского, так и взрослого населения указывает на необходимость проведения комплексных противоэпидемических и санитарно-гигиенических мероприятий по разрыву путей передачи инфекции, внедрения скрининговых малоинвазивных методов для наиболее полного выявления инфицированных и проведения эрадикационной терапии.
Для накопления культуры H.pylori рекомендован метод тонкослойного двухфазного культивирования, обладающий рядом преимуществ, а именно отсутствие необходимости использования дополнительного оборудования для поддержания микроаэрофильных условий в жидкой фазе среды, использование стандартных питательных сред (Колумбия агара и бульон Шедлера), накопление чистой культуры H.pylori в количестве, достаточном для морфологической, биохимической идентификации и постановки антибиотикограммы. Разработана биотехнология культивирования микроаэрофильных и капнофильных бактерий на двухфазной питательной среде, основанная на биологических особенностях хеликобактеров, которая создает условия роста и размножения, приближенные к естественным, когда часть жизненного цикла микроба требует плотной питательной среды, а другие стадии проходят в жидкой фазе, что свойственно эпителиальным патогенам, к которым относятся бактерии рода Helicobacter, размножающиеся пристеночно и в просвете органа.
Окраска катионовым синим О (основным) для цитологического метода диагностики H.pylori обеспечивает высокую контрастность микроорганизмов, а также позволяет оценить морфологические изменения окружающих тканей. Предложенный метод отличается быстротой, простотой, доступностью исполнения, воспроизводимостью полученных результатов и может быть использован как для первичной диагностики H.pylori инфекции, так и для контроля эрадикационной терапии.
Разработан алгоритм комплексного обнаружения H.pylori у больных хроническими воспалительными заболеваниями гепатобилиарной системы. В качестве «золотого» стандарта детекции бактерий рода Helicobacter в органах гепатобилиарной системы предложена многоступенчатая полимеразная цепная реакция, которая предусматривает проведение поэтапной генетической идентификации хеликобактеров.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Нарушения микробиоценозов гастродуоденального и гепатобилиарного биотопов указывают на возможность развития сочетанной патологии.
-
H.pylori способен колонизировать органы гепатобилиарной системы, что подтверждено цитологическим, иммуногистохимическим, молекулярно-генетическим и бактериологическим методами, и может являться одним из этиологических факторов развития хронических воспалительных заболеваний гепатобилиарной системы и одним из факторов риска развития неоплазий желудочно-кишечного тракта.
-
Доминирующий генотип изолятов H.pylori, выделенных от больных хроническими воспалительными заболеваниями гепатобилиарной системы, представлен ureA+vacA+cagA-babA- подтипом.
-
Алгоритм обнаружения H.pylori, включающий морфологические, молекулярно-генетические, микробиологические исследования с использованием биотехнологических методов, позволяет оптимизировать диагностику H.pylori – инфекции у больных с гепатобилиарной патологией.
Апробация работы
Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 27 сентября 2012 года, протокол № 7.
Основные положения диссертации доложены на IX съезде Научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2009); XXII International Workshop on Helicobacter and related bacteria in chronic digestive inflammation and gastric cancer (Porto, Portugal, 2009); GASTRO - 2009, UEGW/WCOG (The United European Gastroenterology Federation (UEGF) and the World Gastroenterology Organization (WGO) (London, 2009); международном форуме «Гастро-2010» (Санкт-Петербург, 2010); XXIII International Workshop on Helicobacter and related bacteria in chronic digestive inflammation and gastric cancer (Rotterdam, 2010); 8 Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии (С.-Петербург, 2011); XXV International Workshop on Helicobacter and related bacteria in chronic digestive inflammation and gastric cancer (Slovenia, 2012); 14 Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург-Гастро-2012»; IV Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2012); X съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации» (Москва, 2012); III Международной научной онлайн конференции "Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии" (Казань, 2012). Результаты исследования были представлены на Всероссийском конкурсе научных работ «Инфекция H.pylori в России» (С.-Петербург, 2010), где была отмечена дипломом почетного участника; на II международном конкурсе научно-исследовательских работ «Инфекция Helicobacter pylori и дыхательная диагностика заболеваний и патологических состояний организма человека по выдыхаемому воздуху» (С.-Петербург, 2011); на III международном конкурсе научно-исследовательских работ «Диагностика заболеваний желудочно-кишечного тракта по выдыхаемому воздуху» (С.-Петербург, 2012).
Внедрение результатов исследования.
Получено положительное заключение экспертизы на заявку патента на изобретение РФ №2012125394/10 «Способ тонкослойного культивирования Helicobacter pylori».
Результаты исследования внедрены в лечебно-диагностическую работу эндоскопического центра и бактериологической лаборатории Государственного автономного учреждения здравоохранения «Республиканский клинический онкологический диспансер» МЗ Республики Татарстан (акт о внедрении от 5.06.2012); цитологической лаборатории и эндоскопического центра ООО «Лечебно-диагностический центр «Фарм-Т» (г.Казань) (акт о внедрении от 3.04.2012г.). Полученные результаты внедрены в научно-исследовательскую работу научно-исследовательских лабораторий кафедр микробиологии и генетики Института фундаментальной медицины и биологии Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Федеральный (Приволжский) университет» Министерства образования и науки Российской федерации (акт о внедрении от 10.04.2012 г.); ООО «ГенДжин» (г.Казань) (акт о внедрении от 15.09.2012 г.); лаборатории диагностики и профилактики инфекционных заболеваний ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (акт о внедрении от 20.09. 2012г.).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 30 научных работ, в том числе 15 статей в рецензируемых изданиях, в сборниках научных трудов и материалах конференций - 14, монография – 1. Получено положительное заключение экспертизы на заявку патента №2012125394/10.
Структура и объем диссертации.
Материалы диссертации изложены на 304 страницах машинописного текста, иллюстрированы 25 таблицами, 65 рисунками. Диссертационная работа включает обзор литературы, материалы и методы исследования, четыре главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, список литературы, содержащий 36 отечественных и 467 зарубежных источника.
