Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
Хламидийные инфекции и особенности микробиологической диагностики 10
1.1. История изучения хламидий 10
1.2. Становление таксономии хламидий 11
1.3. Цикл развития хламидий 21
1.4. Клинические проявления хламидийной инфекции 27
1.5. Лабораторные методы диагностики инфекций, вызванных Chlamydia trachomatis 37
1.6. Чувствительность и специфичность методов, используемых в микробиологической диагностике хламидийных инфекций 46
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 54
2.1. Исследуемые группы 54
2.2. Клинические материалы 56
2.3. Используемые методы исследования 58
2.3.1. Полимеразная цепная реакция 59
2.3.2. Прямая иммунофлюоресценция 62
2.3.3. Культура клеток 65
2.4. Способы оценки диагностических методов 67
2.5. Методы статистической обработки и критерии оценки 68
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 71
Сравнение методов лабораторной диагностики инфекций, вызываемых chlamydia trachomatis 71
3.1. Эффективность использования метода культуры клеток (КК) в сравнении с ПЦР и ПИФ 71
3.2. Сравнительный анализ используемых тест-систем для полимеразной цепной реакции (ПЦР) 82
3.3. Сравнительный анализ тест-систем для прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) 95
3.4. Сравнение основных показателей методов ПЦР, ПИФ и КК при диагностике инфекций, вызываемых Chlamydia trachomatis, среди разных групп пациентов 98
3.5. Обнаружение Chlamydia trachomatis в различных клинических материалах урогенитального тракта 105
Обсуждение 117
Выводы 130
Практические рекомендации 132
Список литературы 133
- История изучения хламидий
- Клинические проявления хламидийной инфекции
- Эффективность использования метода культуры клеток (КК) в сравнении с ПЦР и ПИФ
- Сравнительный анализ используемых тест-систем для полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Введение к работе
Современный этап жизни человеческого общества характеризуется заметным ростом числа заболеваний, вызванных инфекциями, передающимися половым путем (ИППП). Растет заболеваемость гонореей, сифилисом, инфекций с давно и хорошо разработанной диагностикой, хотя она продолжает совершенствоваться. В числе ИППП большое место по распространенности занимает урогенитальныи хламидиоз, в диагностике которого еще имеется целый ряд трудностей. Они связаны как с особенностями биологии этого микроорганизма, так и с характером течения и симптоматикой самого заболевания. Широко распространены бессимптомные формы хламидийной инфекции, которые диагностируются исключительно лабораторными методами. При отсутствии каких либо симптомов заболевания за медицинской помощью люди обычно не обращаются и служат источником заражения своих половых партнеров. Несмотря на частое бессимптомное течение, нераспознанный урогенитальныи хламидиоз нередко осложняется тяжелыми поражениями маточных труб и эндометрия у женщин, предстательной железы у мужчин, последствиями которых являются бесплодие, внематочные беременности, тяжелые воспалительные заболевания тазовых органов.
Случаи бессимптомного хламидиоза могут быть диагностированы лишь методами лабораторной диагностики, проводимой скрининговыми исследованиями определенных групп населения. Здесь следует остановиться на биологии Chlamydia trachomatis, так как облигатный внутриклеточный паразитизм этого микроорганизма резко ограничивает методические подходы к его выявлению.
Существующие методы лабораторной диагностики сложны, требуют участия в диагностической работе квалифицированных специалистов, хорошо ориентирующихся в использовании культуры клеток, иммунофлюоресцентных, иммуноферментных и молекулярно-биологических методов с применением стандартных тест-систем.
Расхождения в результатах диагностики, выполненных в различных лабораториях с использованием разных тест-систем, бывают значительными. Данный факт послужил основной причиной проведения сравнительных исследований одного и того же клинического материала разными лабораторными методами. Работа проведена в сотрудничестве с институтом клинической микробиологии Уппсальского университета (Швеция) и является частью комплексного программного исследования под эгидой ВОЗ.
Все это позволило получить в распоряжение современную аппаратуру и арбитражные тест-системы, отвечающие мировым стандартам. В работе также проведена оценка использования образцов, полученных без применения агрессивных процедур, что позволяет расширить контингенты лиц, обследуемых в порядке скрининга. Это, в свою очередь, в значительной мере снижает стоимость исследований за счет взятия материалов самими пациентами. Такой подход к лабораторной диагностике урогенитального хламидиоза поможет правильно оценить эпидемиологическую ситуацию и избежать гипер- и гиподиагностики этого широко распространенного заболевания.
Актуальность темы исследования связана, прежде всего, с объективными трудностями процесса микробиологической диагностики инфекций, вызванных Chlamydia trachomatis. Они состоят в использовании нерегламентированной схемы обнаружения и идентификации микроорганизма. Воздействие антимикробных препаратов существенно снижает диагностическую и прогностическую ценность используемых методов лабораторной диагностики и увеличивает число хронических форм инфекции, диагностика которых затруднена.
Основной целью работы является оптимизация методов лабораторной диагностики инфекций, вызываемых Chlamydia trachomatis, с применением нескольких методов и разных клинических материалов для обнаружения хламидий.
Основными задачами исследования являются: сравнительный анализ основных параметров различных тест-систем, используемых для выявления Chlamydia trachomatis методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) и прямой иммунофлюоресценции (ПИФ), с «золотым стандартом» - методом культуры клеток (КК); определение чувствительности, специфичности и прогностической значимости положительного и отрицательного результатов при использовании методов лабораторной диагностики инфекций, вызванных Chlamydia trachomatis; проведение сравнительного исследования основных параметров методов ПЦР, ПИФ и КК в группах с разной частотой встречаемости Chlamydia trachomatis; определение частоты обнаружения Chlamydia trachomatis при использовании различных клинических материалов (соскобы из уретры, цервикального канала, вагинальные выделения у женщин, соскобы из уретры и первая порция мочи у мужчин); сравнение возможности использования различных клинических материалов для выявления Chlamydia trachomatis; составление алгоритма исследования для диагностики хламидийных инфекций с учетом чувствительности, специфичности и прогностической значимости.
Научная новизна
Впервые в России проведено сравнение методов выявления Chlamydia trachomatis (ПИФ, ПЦР, КК) с определением чувствительности, специфичности и прогностической значимости положительного и отрицательного результатов с использованием различных отечественных и зарубежных тест-систем.
Впервые проведено сравнение значимости использования различных клинических материалов для обнаружения Chlamydia trachomatis и установлена возможность использования неинвазивных методов получения материала (первая порция свободно выпущенной мочи у мужчин и отделяемое влагалища у женщин) наряду с классически используемыми материалами из цервикального канала и уретры.
Впервые на основании сравнения чувствительности, специфичности и прогностической значимости построен алгоритм обследования пациентов с целью выявления Chlamydia trachomatis
Впервые научно обоснована необходимость использования нескольких методов диагностики при частоте встречаемости Chlamydia trachomatis в популяции равной 5-10%.
Научно-практическая значимость
Сравнительный анализ чувствительности, специфичности и прогностической значимости различных методов диагностики инфекций, вызванных Chlamydia trachomatis, позволил выбрать метод ПЦР с использованием праймеров к криптической плазмиде в качестве скринингового, а культуральный метод или метод ПИФ рекомендовать в качестве подтверждающих методов. «Золотым стандартом» диагностики инфекций, вызванных С. trachomatis, впервые предложено считать сочетание ПЦР и культурального метода. Обоснована необходимость использования двух методов для выявления С trachomatis. Дано научно подтвержденное обоснование возможности использования неинвазивных способов получения клинического материала для обнаружения С. trachomatis. Наряду с материалами, полученными из цервикального канала и уретры, возможно использование и отделяемого влагалища, и первой порции свободно выпущенной мочи.
Положения, выносимые на защиту
Культуральный метод, является «золотым стандартом» по специфичности, но чувствительность метода недостаточна (30-60%). Метод ПЦР имеет достаточно высокую чувствительность (80-95%), но в ряде случаев уступает культуральному методу по специфичности.
ПЦР с праймерами к криптической плазмиде (Crypt) является наиболее приемлемой для выявления Chlamydia trachomatis по параметрам: чувствительность (80%), специфичность (100%), прогностической значимость положительного (97%) и отрицательного (92%) результатов, а также по наименьшему числу спорных результатов при сравнении с арбитражным набором и методом КК. Констатация расхождений в результатах ПЦР и КК служит сигналом к применению третьего -арбитражного метода.
Диагностические наборы Syva и Orion для ПИФ не отличаются друг от друга по чувствительности, специфичности и прогностической значимости положительного и отрицательного результата и близки по параметрам эффективности к методу КК.
Существует зависимость между частотой встречаемости микроорганизма в исследуемой популяции и чувствительностью используемых методов. При частоте выявления Chlamydia trachomatis в нашем регионе, равной 5-10%, расхождения в чувствительности методов, используемых для диагностики хламидийной инфекции статистически значимы, что диктует обязательное параллельное использование двух и более методов.
Частота выявления хламидии увеличивается при использовании двух различных клинических материалов таких, как соскоб из цервикального канала и уретры. Адекватным клиническим материалом для исследования у мужчин является соскоб из уретры. Дополнительное исследование первой порции мочи у мужчин не увеличивает частоту выявления Chlamydia trachomatis.
6. Использование метода ПЦР с праймерами к криптической плазмиде позволяет исследовать любые клинические материалы, в том числе полученные неинвазивным путем: отделяемое вагины у женщин и первую порцию мочи у мужчин, особенно, при проведении скрининговых исследований, что экономически выгодно.
Все микробиологические исследования, анализ, статистическая обработка материала проведены автором лично. Часть исследования проведена в рамках Российско-Шведского проекта на базе Института клинической бактериологии Университета г. Уппсала (Швеция), за что автор выражает искреннюю благодарность руководителю Российско-Шведского проекта по И111111, руководителю центра ВОЗ по ИШШ, руководителю отдела Института по контролю за инфекционными заболеваниями (Швеция) профессору Marius Domeika и заведующей лаборатории микробиологии Института клинической бактериологии Университета г. Уппсала (Швеция) доктору Eva Hjelm.
История изучения хламидий
Хламидий, как патогенные микроорганизмы, широко распространены в природе. Они вызывают различные заболевания млекопитающих, птиц, рептилий, амфибий, рыб, членистоногих и моллюсков. Впервые эти микроорганизмы были описаны в начале 20 века. P.-A. Mardh в 1990 году составил таблицу по этапам изучения хламидий, где наиболее наглядно показаны основные этапы изучения этой бактерии (таблица 1). Определение цитоплазматических включений в эпителии конъюнктивы при трахоме
Определение связи неонатального конъюнктивита с заболеванием матери цервицитом или уретритом обоих родителей Описание жизненного цикла Bedsonia (Chlamydia psittaci) Первое выделение хламидий на куриных эмбрионах Выделение хламидий в культуре клеток (клетки McCoy, облученные рентгеновскими лучами)
Разработка реакции микроиммунофлюоресценции. Разделение Chlamydia trachomatis на серологические типы, установление роли хламидий в неосложненных генитальных инфекциях
Упрощение методик культивирования (обработка клеток DEAE-декстраном, йоддезоксиуридином, циклогексимидом) Выяснение роли хламидий в возникновении интра-абдоминальных заболеваний (периаппендицитов, перигепатитов, периколитов, периспленитов) Биохимическая, антигенная и генетическая характеристика хламидийной клетки, «эра молекулярной биологии хламидийной клетки»
Прямое обнаружение антигена в клинических пробах с помощью метода ИФА (ELISA), изготовление моноклональных видоспецифических антител для иммунофлюоресцентной микроскопии
Выяснение этиологической роли хламидий в развитии респираторных инфекций человека (TWAR)
Выделение генитальной хламидийной инфекции как крупной проблемы здравоохранения В дальнейшем исследования хламидий развивались следующим образом. 1989 год - выделен новый вид Chlamydia pneumoniae [76]. 1991 год - выяснена роль белка теплового шока (hsp-60) в патогенезе хламидийных поражений, а также проведено разделение вида Chlamydia trachomatis на 18 сероваров 1993 год - выделен еще один вид - Chlamydia ресогит [62]. Предложены молекулярно-биологические методы обнаружения хламидий. 1999 год - определены последовательности генома Chlamydia trachomatis [143]. На основании анализа последовательности 16-S рРНК и 23-S рРНК предложено выделить два рода и девять видов хламидий [56].
Становление таксономии хламидий
Хламидий - неподвижные, грамотрицательные микроорганизмы прокариотной природы, размером от 0,2 до 0,4 мкм, характеризующиеся облигатным внутриклеточным паразитизмом. Облигатность паразитизма обусловлена физиологической и репродуктивной зависимостью репродукции хламидий от клетки хозяина. Обладая собственной метаболической системой, хламидии, тем не менее, не могут синтезировать АТФ, и поэтому они энергетически зависимы от клетки хозяина. Это и определяет их биологическое положение в системе микроорганизмов.
Широкий спектр заболеваний и особенности течения инфекций, вызываемых этими микроорганизмами, обусловливают необходимость их всестороннего изучения.
Открытые раньше других хламидий (L. Halberstadter, S. Prowazek, 1907) «тельца Гальберштедтера-Провачека» - Chlamydia trachomatis, являются наиболее изученным представителями порядка Chlamydiales. Среди инфекций, вызываемых С. trachomatis, следует, прежде всего, отметить заболевания урогенитального тракта и эндемичную трахому (хронический кератоконъюнктивит) - заболевание, широко распространенное в развивающихся странах Азии, Африки и Южной Америки.
В настоящее время С. trachomatis рассматривается как самый распространенный бактериальный возбудитель заболеваний, передающихся половым путем. По данным ВОЗ (2001) количество случаев инфекций, вызванных С. trachomatis во всем мире, ежегодно составляет около 92 млн. [73,163], по сравнению с 90 млн. в 1996 году [143]. В Австралии и Новой Зеландии зарегистрировано 340 000 случаев хламидийной инфекции. В Северной Африке и на Среднем Востоке - 3 млн., на территории суб-Сахарной Африки - 16 млн. случаев заболеваний, вызванных С. trachomatis. В регионах Южной и Юго-Восточной Азии - 43 млн., Восточной Азии и странах Тихоокеанского региона - 5,3 млн. На территории Восточной Европы и Центральной Азии - 6 млн., в Западной Европе - 5 млн. случаев обнаружения С. trachomatis. На континенте Северной Америки - 4 млн., а в странах Латинской Америки и Карибского региона - 9,5 млн.
Клинические проявления хламидийной инфекции
Развитие цитоплазматических включений, синтез ДНК, РНК и белков, изменение антигенных и инфекционных свойств выявляются в процессе исследований, включая электронную микроскопию. Жизненный цикл хламидий может быть разделен на две фазы.
Хламидий растут и размножаются в виде микроколоний в цитоплазматическом включении - пузырьке, оболочка которого возникает путем впячивания клеточной мембраны клетки хозяина. Клетка может захватывать не одно, а несколько элементарных телец, в результате чего в ее цитоплазме может оказаться несколько микроколоний хламидий. В зрелых цитоплазматических включениях одновременно наблюдаются все формы микроорганизма: ЭТ и РТ.
Основными морфологическими формами хламидий являются элементарные (ЭТ) и ретикулярные (РТ) тельца. Инфекционные формы хламидий представлены элементарными тельцами. Это зрелые формы возбудителя, обладающие низкой биохимической активностью - отношение РНК/ДНК меньше 1. ЭТ имеют вид сферических микроорганизмов диаметром 300-400 нм, покрытых двумя трехслойными (унитарными) мембранами толщиной 8 нм. Эти мембраны морфологически идентичны мембранам клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Белковыми компонентами наружной мембраны хламидий являются белки: ompl, отр2 и отрЗ {отр - outer membrane protein - белок наружной мембраны). Это богатые цистеином белки, обеспечивающие ригидность клеточной стенки хламидий благодаря наличию множественных дисульфидных поперечных связей между этими белками. Белок ompl или МОМР (главный белок наружной мембраны) составляет около 60% молекулярной массы всех мембранных белков. В зависимости от принадлежности к серотипу его молекулярный вес колеблется в пределах от 38 до 42 Ша [108].
Ретикулярные тельца являются неинфекционными (вегетативными) формами хламидий, и образуются в процессе размножения микроорганизмов в клетке хозяина. Это предшественники нового поколения элементарных телец. РТ обладают выраженной метаболической активностью (отношение РНК/ДНК - 3/4), и представляют собой овальные или округлые образования размером 400-600x800-1000 нм. Ретикулярные тельца окружены двумя трехслойными мембранами, морфологически соответствующими мембране клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Толщина каждой мембраны равна 8 нм. Ригидный слой клеточной стенки у ретикулярных телец отсутствует, поэтому на этой стадии развития хламидий проявляют чувствительность к воздействию физико-химических факторов и антибиотиков. Цитоплазма ретикулярных телец отличается от элементарных телец меньшей плотностью. Полный цикл развития занимает 48-72 часа [5].
Инфекционные ЭТ взаимодействуют с рецепторами гепарин-сульфата на поверхности эпителиальных клеток хозяина, и, провоцируя эндоцитоз, проникают в них, с образованием фагосомы [116,141,166]. В мембрану фагосомы встраиваются секретированные микроорганизмом белки IncA, IncD, IncE, IncF, IncG, которые, по предположению, препятствуют слиянию фагосом с лизосомами [78,137]. В течение первой фазы, длящейся от 7 до 10 часов после инфицирования, ЭТ проникают в цитоплазму клетки недалеко от аппарата Голъджи и начинают формировать мелкие цитоплазматические включения. ЭТ в течении 2-8 часов превращаются в РТ: ослабляются дисульфидные связи между МОМР и другими внешними белками мембраны, что приводит к повышению проницаемости мембраны клетки микроорганизма, увеличению транспорта питательных веществ и возрастанию метаболической активности [23,155]. Кроме изменения клеточной поверхности происходит деконденсация хроматина хламидий, необходимая для активации процессов транскрипции и трансляции. Через 2 часа после интернализации начинается экспрессия некоторых генов (recA, rpoB rpoD, groEL и др.). При окраске акридиновым оранжевым (АО) ЭТ окрашиваются в красный цвет, что указывает на присутствие в них РНК. Синтез хламидийных антигенов начинается тогда, когда подавляется синтез ДНК клетки-хозяина. В течение второй фазы (14-22 часа) наблюдаются, в основном, крупные РТ. Хламидийные РНК и белки синтезируются в этот период непрерывно. Синтез хламидийной ДНК, как показывает зеленовато-оранжевое свечение при окрашивании АО начинается через 14 часов. РТ начинают трансформироваться в ЭТ: конденсируется хроматин, в оболочке появляются цистеин-богатые белки, обеспечивающие ее жесткость за счет дисульфидных связей [111]. После 20-22 часов вновь образовавшиеся ЭТ способны к заражению новых клеток хозяина. В течение третьей фазы (после 24-30 часов) в цитоплазматических включениях присутствуют в основном ЭТ
Эффективность использования метода культуры клеток (КК) в сравнении с ПЦР и ПИФ
Многие лаборатории осуществляют диагностику хламидийных инфекций, используя только один метод и наборы реактивов одной фирмы, не принимая во внимание достоверность результатов и не имея возможности сравнить качество реактивов тех или иных фирм-производителей. Зачастую, работая даже с двумя тест-системами и получая противоположные результаты, нельзя дать ответ о наличии или отсутствии той или иной инфекции из-за невозможности провести третье, так называемое, арбитражное исследование. В связи с этим возникла необходимость сравнения информативности и результативности применения разных тест-систем при работе одним методом и оценить чувствительность и специфичность разных методов при работе с различными клиническими материалами.
Chlamydia trachomatis - внутриклеточный облигатный паразит, и одним из первых методов выявления этого микроорганизма был метод выделения хламидий на перевиваемых клеточных линиях. Долгое время метод культуры клеток считался «золотым стандартом», но с появлением новых молекулярно-биологических методов ситуация изменилась. Однако до сих пор положительные результаты, полученные при помощи метода культуры клеток, не вызывают сомнений и считаются истинно положительными результатами, не требующими никаких дополнительных подтверждений. При оценке новых методов используют такие характеристики, как чувствительность, специфичность, прогностическая значимость положительного и отрицательного зезультатов.
В нашем исследовании использовался метод культуры клеток линия McCoy) с индикацией включений моноклональными антителами к V10MP антигену Chlamydia trachomatis (Syva MicroTrak для культуры клеток) (см. рис. 3).
Результаты культурального исследования мы сравнивали с результатами, полученными методом ПЦР с праймерами к разным участкам ДНК и прямой иммунофлюоресцентной микроскопией.
Для оценки эффективности использования культурального метода диагностики мы применили критерий Мак-Нимара. Он достаточно прост в применении и наиболее эффективен в данном случае, так как в качестве параметров используется типичный качественный признак - диагноз, который принимает одно из двух значений («есть-нет»), и, кроме того, применение критерия связано с анализом повторных наблюдений.
Результаты, полученные методом КК, попарно сравнивали с результатами каждого метода (ПЦР - Rl, R2, Crypt, Pdl/Pd2; ПИФ - Syva, Orion) посредством построения таблиц сопряженности размером 2x2. За основу для этого сравнительного исследования мы взяли материалы от пациентов I группы с установленным диагнозом «урогенитальная хламидийная инфекция» (цервикальный канал у женщин и уретру у мужчин). Всего обследовано 197 женщин и 50 мужчин. Пациентов, у которых в совокупности каждый из используемых методов дал положительный либо отрицательный результат, мы исключили из этого сравнения. Из 197 женщин у 16 (8,1 ±1,9%) С. trachomatis обнаружены всеми методами, а у 106 (53,8±3,6%) результаты были отрицательными также при применении всех методов. Из 50 мужчин у 6 (12,0±4,6%) результаты были положительными и у 29 (58,0±7,0%) -отрицательными также при использовании всех методов диагностики. Таким образом, сравнение культурального и 6 других методов выявления С. trachomatis проведено при исследовании клинических материалов у 75 (38,1±3,5%) женщин и 15 (30,0±6,5%) мужчин, то есть материалов, при исследовании которых получены сомнительные результаты.
Сравнительный анализ используемых тест-систем для полимеразной цепной реакции (ПЦР)
По данным большинства исследователей, метод ПЦР имеет высокую чувствительность и специфичность и может быть использован для выявления Chlamydia trachomatis [17,32,121,151]. Но, работая этим методом всего лишь с одним набором праймеров, можно столкнуться с проблемой возникновения большого числа ложноположительных результатов, если не подтверждать их другими тест-системами.
Данные сравнения разных тест-систем для ПЦР анализа основаны на результатах исследований классически используемых клинических материалов (соскоб эпителия цервикального канала женщин и соскоб эпителия уретры мужчин) I группы, состоящей из 197 женщин и 50 мужчин. Следует подчеркнуть, что эта группа пациентов состояла из лиц, которым в лечебных учреждениях города был установлен диагноз хламидийной инфекции и которые не лечились по поводу этого заболевания.
Первые отечественные диагностические наборы для выявления Chlamydia trachomatis методом ПЦР были произведены с праймерами к рибосомальному гену 16S РІЖ. Мы обозначили их как Rl: (U15 -CACGAGCTGACGACAACCATGCA-3 )/ (L1 5 - AAAGGGCGTGTAGGCGGAAAG-3 ) Позже были разработаны тест-системы для ПЦР с праймерами к рибосомальному гену 16S РНК, обозначенные нами как R2: (CHLR-rev5 -CGTCACCTTGGGCGCCTCTC-3 )/ (CHLR-for 5 -GCGGCAGAAATGTCGTTTTCC-3 ) При исследовании клинических материалов от женщин методами ПЦР с использованием наборов R1 положительный результат по обнаружению С. trachomatis был получен в 81 случае из 197, что составило 41,1 ±3,5%; при использовании наборов R2 - в 41 случае (20,8±2,9%). Различия статистически значимы (х =28,167, Р 0,05). У мужчин из 50 клинических материалов, полученных из уретры, 13 (26±6,2%) были положительными при проведении ПЦР с наборами R1 и 12 (24±6,0%) - с ПЦР R2. Различия статистически незначимы - х2=0,1, Р 0,05.
В таблице 16 представлены данные сравнения тест-систем для метода ПЦР с использованием рибосомальных праймеров R1 и R2.
При сравнении этих результатов видно, что только 34 (17,3±2,7%) образца из цервикального канала были положительными при постановке ПНР как с праймерами R1, так и R2. При этом 109 (55,3±3,5%) проб были отрицательными. Результаты 54 (27,5±3,2%) клинических образцов у женщин были спорными, т.е. 47 (23,9±3,0%) проб были положительными с праймерами R1 и отрицательными с праймерами R2, и 7 (3,6±1,3%) проб были отрицательными с праймерами R1 и положительными с праймерами R2.
По результатам исследования клинических материалов, полученных из мужской уретры, положительными в обеих реакциях были 8 (16,0±5,2%) образцов, а отрицательными 32 (64,0±6,8%). Большое количество спорных результатов было среди проб из уретры - 10 из 50 (20,0±5,7%); 5 (10,0±3,1%) проб были положительны при проведении ПНР с праймерами R1 и 5 (10,0±4,2%) - с праймерами R2. При сравнении тест-систем R1 и R2 для выявления С. trachomatis из цервикального канала женщин методом ПЦР были получены статистически значимые различия - х2=28,167, Р 0,05. Иными словами, получена вероятность того, что результаты, полученные этими методами, совпадают меньше, чем в 5%.
При выявлении С. trachomatis из уретры у мужчин статистически значимых различий при использовании данных тест-систем (Rl, R2) не выявлено-х2 0,1, Р 0,05.
Далее мы сравнили тест-системы с праймерами R1 и R2 с новыми наборами, содержащими праймеры к критической плазмиде Crypt: Crypt 12 (5 GCGCAAAGACAAAATTTCGTCTAAC3 )/ Crypt 11 (5 GCCTCTAAACAGGCTAGAGCGGCAT3 ).
При исследовании клинических материалов методом ПЦР с праймерами к криптической плазмиде хламидии были обнаружены в 31 (15,7±2,6%) образце, полученном из цервикального канала 197 женщин, и в 12 (24,0±6,0%) - из мужской уретры. В таблице 17 представлены данные сравнения использования тест-систем с праймерами R1 и Crypt.
