Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Таксономия хламидий 12
1.2. Серотипы Chlamydia trachomatis 14
1.3. Геном Chlamydia trachomatis 18
1.4. Жизненный цикл Chlamydia trachomatis 21
1.5. Роль хламидийной инфекции в нарушении репродуктивной функции человека 23
1.6. Устойчивость Chlamydia trachomatis к антибиотикам 27
1.6.1.Механизмы действия тетрациклинов, макролидов и фторхинолонов 27
1.6.2. Формирование устойчивости микроорганизмов к антибиотикам.. 29
1.6.3. Антибиотикорезистентность Chlamydia trachomatis: актуальность проблемы и возможные механизмы... 33
Глава 2. Материалы и методы 41
Глава 3. Результаты собственных исследований 50
3.1. Чувствительность клинических изолятов хламидий к антибактериальным препаратам 50
3.2. Мониторинг элиминации хламидий в ходе терапии джозамицином... 65
3.3. Определение нуклеотидной последовательности пептидилтрансферазной петли 23 S рРНК клинических изолятов С. trachomatis, устойчивых к макролидам 71
3.4. Применение метода ОТ-ПЦР (ПНР с обратной транскрипцией) для оценки эффективности действия антибиотиков на рост хламидий в культуре клеток 77
Глава 4. Обсуждение результатов 83
Выводы 94
Практические рекомендации 95
Литература 96
- Таксономия хламидий
- Роль хламидийной инфекции в нарушении репродуктивной функции человека
- Чувствительность клинических изолятов хламидий к антибактериальным препаратам
- Применение метода ОТ-ПЦР (ПНР с обратной транскрипцией) для оценки эффективности действия антибиотиков на рост хламидий в культуре клеток
Введение к работе
Облигатные внутриклеточные бактерии Chlamydia trachomatis относятся к числу самых распространенных инфекционных агентов, передающихся половым путем. Особенно опасны хламидии тем, что примерно у 75% женщин и 50% мужчин заболевание протекает бессимптомно, что обеспечивает быстрое распространение С.trachomatis в популяции, так как инфицированные хламидиями мужчины и женщины не обращаются за медицинской помощью. Кроме того, отсутствие своевременной диагностики и лечения может способствовать переходу возбудителя в верхние отделы урогенитального тракта и инициации патологических процессов, влекущих за собой тяжелые последствия -воспалительные заболевания органов малого таза [Cohen 1999], внематочную беременность [Sziller 1998], невынашивание беременности и трубное бесплодие [Paavonen 1999]. Существуют также данные, хотя и весьма ограниченные, свидетельствующие о возможной связи хламидийной инфекции и мужского бесплодия [Munoz 1995, Paavonen 1999].
Для лечения хламидийной инфекции традиционно используются тетрациклины, макролиды и некоторые препараты фторхинолонового ряда [Ridgway 1997]. Сообщения последних лет свидетельствуют о возникновении проблемы устойчивости хламидии к антибиотикам, проявляющейся как в неудачах антихламидийной терапии, так и в выделении клинических изолятов С.trachomatis, устойчивых к антибиотикам [Jones 1990, Somani 2000]. Оценка масштаба и клинической значимости явления антибиотикорезистентности хламидии представляет собой нелегкую задачу в силу нескольких причин. Во-первых, микробиологический контроль излеченности далеко не везде является общепринятой практикой. Во-вторых, реинфекция занимает значительное место среди случаев выявления хламидии после лечения [Kjar 2000]. Наконец, определение чувствительности хламидии к антибиотикам лабораторными методами сопряжено с серьезными трудностями стандартизации процедуры тестирования и интерпретации его результатов [Peeling 1994].
Одним из самых актуальных вопросов для клиницистов и микробиологов является вопрос о рецидивирующей хламидийной инфекции. Причинами возникновения рецидивов хламидийной инфекции считают: а) назначение неадекватного лечения или нарушение пациентом предписанной схемы лечения; б) устойчивость хламидий к антибиотикам; в) способность хламидий к персистенции - длительному выживанию внутри клетки-хозяина, что, в свою очередь, может быть самым сложным и тесным образом связано с антибиотикорезистентностью хламидий.
Изучение механизмов резистентности различных патогенных бактерий к антибиотикам ведется уже много лет, однако, до сих пор практически ничего не известно о формировании антибиотикорезистентности хламидий. Поскольку размножение и развитие хламидий происходит внутри клетки-хозяина, приобретение генов резистентности от других микроорганизмов представляется маловероятным [Stephens 1998]. Возможно, антибиотикорезистентность хламидий возникает в результате селективного давления при воздействии субингибирующих концентраций антибиотиков. Так, в литературе описано получение лабораторных мутантов, устойчивых к фторхинолонам, которые имели нуклеотидные замены в гене, кодирующем мишень хинолонов - ДНК-гиразу [Dessus-Babus 1998]. Этот механизм - изменение мишени действия антибиотика - может быть задействован в формировании антибиотикорезистентности хламидий в ходе антибактериальной терапии; на сегодняшний день, однако, никаких данных относительно клинических изолятов С. trachomatis не получено.
Макролиды относятся к числу антибиотиков, обладающих высокой антихламидийной активностью. Несмотря на то, что первое сообщение о резистентности хламидий к эритромицину in vitro появилось в 1980 году
7 [Mourad 1980], механизмы формирования резистентности хламидий к макролидам не изучены. Ингибирующее действие макролидов на рост микроорганизмов связано с их влиянием на синтез белка. В процесс образования пептидных связей вовлечена так называемая пептидилтрансферазная петля - фрагмент 23 S рРНК. Устойчивость микроорганизмов к макролидам часто связана с изменениями в 23 S субъединице РНК, в том числе с нуклеотидными заменами в гене 23 S рРНК, которые приводят к структурным изменениям пептидилтрансферазного домена [Weisblum 1995].
Данное исследование было предпринято с целью оценить актуальность проблемы резистентности С. trachomatis к антибактериальным препаратам, а также изучить молекулярные изменения в гене 23 S рРНК и выявить возможную связь между наличием точечных мутаций в этом гене и резистентностью хламидий к макролидам.
Для достижения поставленной цели планировалось решить следующие задачи:
Разработать методику определения чувствительности С.trachomatis к антибиотикам в культуре клеток
Охарактеризовать чувствительность клинических изолятов С.trachomatis к антибиотикам, наиболее широко применяемым для антихламидийной терапии
Сопоставить результаты антихламидийной терапии с результатами определения чувствительности хламидий к антибиотикам in vitro и исследовать ассоциацию между антибиотикорезистентностью хламидий in vitro и неудачами антихламидийной терапии
Провести мониторинг элиминации хламидий в ходе терапии джозамицином и выработать рекомендации по проведению контроля излеченности
Исследовать молекулярные изменения в гене 23 S рРНК клинических изолятов хламидий, устойчивых к макролидам
Разработать систему оценки эффективности действия антибиотиков на рост хламидий в культуре клеток на основе метода обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР)
Научная новизна работы
Проведено сопоставление результатов антихламидийной терапии с результатами определения чувствительности хламидий к антибиотикам in vitro и показано отсутствие связи между антибиотикорезистентностью хламидий in vitro и неудачами антихламидийной терапии. Обоснована неэффективность применения теста на определение чувствительности хламидий к антибиотикам при выборе препарата для лечения хламидийной инфекции.
Проведен мониторинг антихламидийной терапии джозамицином, который показал быструю элиминацию возбудителя в ходе лечения.
Впервые показано, что устойчивые к макролидам клинические изоляты хламидий, выделенные от пациентов с неудачами антихламидийной терапии, имеют мутации в гене 23 S рРНК, приводящие к изменению вторичной структуры пептидилтрансферазной петли V домена 23 S субъединицы РНК.
Впервые для оценки эффективности действия антибиотиков на рост С. trachomatis в культуре клеток применен метод ОТ-ПЦР 16S рРНК и мРНК гена отрЗВ, кодирующего белок наружной мембраны хламидий.
Научно-практическая значимость работы
Отсутствие связи между антибиотикорезистентностью хламидий in vitro и неудачами антихламидийной терапии, установленное в данной работе, служит сигналом к пересмотру взгляда на назначение теста чувствительности хламидий к антибиотикам для выбора антихламидийного препарата.
На основании данных мониторинга эффективности антихламидийной терапии выработаны рекомендации по проведению контроля излеченности. Схема мониторинга, примененная в данной работе, может быть использована для изучения изменений морфологических и биохимических свойств хламидии во время антибактериальной терапии.
Обнаружение мутаций в гене 23 S рРНК хламидии, устойчивых in vitro к высоким концентрациям макролидов, свидетельствует о возможном вовлечении этого механизма в формирование устойчивости С.trachomatis к макролидам и дает основание для активного изучения распространенности мутаций в гене 23 S рРНК и их роли в неудачах антихламидийной терапии макролидами. Установление участия этого механизма в формировании резистентности хламидии к макролидам послужит теоретической основой для выявления в клиническом изоляте хламидии, элиминация которых потребует применения других препаратов.
Предложенный в настоящей работе метод ОТ-ПЦР отрЗВ представляет собой альтернативу традиционному методу с применением ПИФ для определения чувствительности хламидии к антибиотикам in vitro. Основным преимуществом метода ОТ-ПЦР отрЗВ является однозначность в оценке значений МИК и МБК, и, как следствие, получение более воспроизводимых результатов.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
Несмотря на высокую частоту встречаемости клинических изолятов С.trachomatis, резистентных к антибиотикам in vitro, в том числе проявляющих множественную резистентность, в подавляющем большинстве случаев антихламидийная терапия приводит к элиминации хламидии.
Трудоемкий дорогостоящий метод характеристики чувствительности хламидии к антибиотикам как рутинный лабораторный тест для выбора
10 антихламидийного препарата не оправдывает материальных расходов и потери времени.
Структурные изменения в пептидилтрансферазном домене 23 S субъединицы РІЖ, обусловленные нуклеотидными заменами в гене 23 S рРНК, могут быть ответственны за устойчивость С. trachomatis к антибиотикам.
Разработка новых методик определения МИК и МБК антибиотиков, в частности, на основе ОТ-ПЦР, предусматривающих однозначную интерпретацию данных, будет способствовать получению более воспроизводимых результатов тестирования чувствительности С. trachomatis к антибиотикам.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 работ.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на Международном конгрессе по резистентности к антимикробным препаратам в Монте-Карло (1999), III Международной конференции МАКМАХ-ASM "Антибиотики и антибиотикорезистентность на пороге XXI века" (Москва, 2000), итоговых конференциях НИИ Физико-химической медицины (Москва, 2000, 2001), VIII Всероссийском съезде дерматовенерологов (Москва, июнь 2001), IV Международной конференции МАКМАХ "Антимикробная терапия" в (Москва, 2001), XI Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Стамбул, 2001), научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» (Москва, 2002), XVIII конгрессе по заболеваниям, передающимся половым путем (Будапешт, сентябрь 2002), XXXVIII научно-практической конференции дерматовенерологов и врачей смежных специальностей (С.-Петербург, 2003).
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы исследования и результаты), обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 9 рисунками; библиографический указатель включает 109 публикаций.
Таксономия хламидий
Хламидийные внутриклеточные включения впервые были описаны Halberstaedter и Prowazek в 1907 году: их наблюдали в пораженных трахомой клетках. Микроорганизм был назван Chlamydozoa; 2 года спустя такие же включения были обнаружены в эпителии конъюнктивы у новорожденных детей с конъюнктивитами. Изолирован микроорганизм был в 1957 году культивированием клинического материала в куриных эмбрионах [Савичева 1998]. До 60-х годов хламидий относили к вирусам из-за небольших размеров и неспособности расти на искусственных питательных средах. Только в 1966 году по совокупности морфологических, цитологических и метаболических признаков хламидий решили отнести к бактериям [Page 1966].
До недавнего времени все хламидий объединяли в один порядок Chlamydiales, состоящий из одного семейства Chlamydiaceae. Семейство Chlamydiaceae включало в себя единственный род Chlamydia, к которому относили 4 вида: С.trachomatis, С.pneumoniae, C.psittaci и С.ресогит. По мере описания новых видов микроорганизмов с характерным для хламидий циклом развития, а также появления новых данных филогенетического анализа и исследований генома хламидий назревала необходимость пересмотра их классификации.
Современная классификация микроорганизмов предполагает использование строгих критериев геносистематики для описания таксономических групп различного уровня: наличие 95% гомологии нуклеотидной последовательности генов 16S и 23 S рРНК для всех представителей рода, 90% - семейства и 80% - порядка и/или класса.
На основании филогенетического анализа генов 16S и 23 S рРНК, подтвержденного данными о генетических и фенотипических признаках, K.D.Everett с соавторами (1999) предложили новое определение порядка Chlamydiales [Everett 1999]. Согласно этому определению порядок Chlamydiales включает облигатные внутриклеточные бактерии, которые имеют сходный с хламидийным цикл развития и уровень гомологии нуклеотидной последовательности генов 16S и 23S рРНК, превышающий 80%.
Семейство Chlamydiaceae разделено на 2 рода: Chlamydia и Chlamydophila. Род Chlamydia объединил существующий вид Chlamydia trachomatis и новые виды Chlamydia suis и Chlamydia muridarum. В новый род Chlamydophila вошли известные виды Chlamydia pecorum, Chlamydia pneumoniae и Chlamydia psittaci, переименованные в Chlamydophila pecorum, Chlamydophila pneumoniae и Chlamydophila psittaci, соответственно. К ним присоединились 3 новых вида, которые раньше представляли собой штаммы, входящие в состав вида Chlamydia psittaci: Chlamydophila abortus, Chlamydophila caviae и Chlamydophila felis. На основании выраженной гомологии генов рРНК и сходства циклов развития ранее неклассифицированные микроорганизмы вошли в 3 новых семейства в составе порядка Chlamydiales: Parachlamydiaceae, Simkaniaceae и Waddli&ceae [Bush 2001] (рисі).
Согласно новой классификации, единственным хозяином Chlamydia trachomatis является человек. Этот микроорганизм ответственен за широкий спектр заболеваний: трахому, венерическую лимфогранулему, инфекции мочеполового тракта. Кроме того, С. trachomatis часто приводит к конъюнктивитам и пневмонии у новорожденных детей в случае заражения от инфицированных матерей.
Элементарные тельца хламидий окружены ригидной малопроницаемой клеточной стенкой, отделенной от плазматической мембраны электронно-прозрачным периплазматическим пространством. Клеточная стенка хламидий имеет характерное для грамотрицательных бактерий двухслойное строение, однако, в отличие от других бактерий, она не содержит пептидогликана в количестве, достаточном для поддержания ее ригидности. Наружная мембрана хламидий, так же как и наружная мембрана других грамотрицательных бактерий, состоит из белков, фосфолипидов и липополисахаридов. Белковыми компонентами наружной мембраны хламидий являются обогащенные цистеином белки Ompl, Omp2 и ОтрЗ (Отр - Outer membrane protein); ригидность клеточной стенки хламидий обусловлена наличием множественных дисульфидных поперечных связей между этими белками [Bavoil 1984].
Примерно 60% общей массы мембранных белков хламидий составляет главный белок наружной мембраны Ompl (или МОМР - Major Outer Membrane Protein) [Caldwell 1981]. Молекулярный вес МОМР варьирует в зависимости от серотипа от 38 до 42 Ша. Локализация в наружной мембране, размеры и изоэлектрические точки МОМР и белков-поринов грамотрицательных бактерий имеют сходство: это говорит в пользу предположения, что МОМР может выполнять функции порина [Batteiger 1985]. Кроме того, показано, что МОМР может функционировать как адгезии [Su 1990,1996].
Белок МОМР является доминантным антигеном С. trachomatis, определяющим их серотип [Caldwell 1981]. Этот белок содержит 4 вариабельных домена VD1-VD4 (VD - Variable Domain), расположенных приблизительно на равном расстоянии друг от друга. Иммуногенные свойства вариабельных доменов обусловлены их поверхностным расположением. Видоспецифические эпитопы описаны в домене VD4, сероварспецифические - в доменах VD1 и VD2 [Yuan 1989]. С помощью моноклональных антител было идентифицировано 19 сероваров С. trachomatis и показана их связь с клиническими проявлениями инфекции [Wang 1985, 1991]. Так, серотипы LI, L2, L2a и L3 обнаруживают в лимфатической ткани, они являются инфекционными агентами венерической лимфогранулемы - системной инфекции, передающейся половым путем.
Роль хламидийной инфекции в нарушении репродуктивной функции человека
Урогентитальные инфекции, вызываемые C.trachomatis, относятся к числу самых распространенных заболеваний, передающимся половым путем. Клиническими проявлениями урогенитальной хламидийной инфекции у женщин являются цервициты, уретриты, сальпингиты и эндометриты, у мужчин - уретриты и эпидидимиты. Отличительной особенностью хламидийной инфекции является то, что примерно у 75% женщин и 50% мужчин заболевание протекает бессимптомно. В этой связи наибольшую опасность хламидии представляют для репродуктивного здоровья женщины, так как отсутствие своевременной диагностики и лечения может инициировать процессы, влекущие за собой тяжелые последствия -воспалительные заболевания органов малого таза (ВЗОМТ) [Cohen 1999], внематочную беременность [Sziller 1998], невынашивание беременности и трубное бесплодие [Paavonen 1999]. Существуют также данные, хотя и весьма ограниченные, свидетельствующие о возможной связи хламидийной инфекции и мужского бесплодия [Munoz 1995, Paavonen 1999].
Полной ясности в понимании патогенеза хламидийной инфекции до сих пор не существует. Ответ на первичную хламидийную инфекцию развивается в эпителии слизистой оболочки в течение первых двух дней и характеризуется воспалением, инфильтрацией нейтрофилами и небольшим количеством моноцитов [Кио 1988]. На животных моделях было продемонстрировано, что ответ хозяина способен контролировать инфекцию, а именно, значительно снижать количество хламидии, причем в этом процессе задействованы факторы как врожденного, так и приобретенного иммунитета [Rank 1985]. Показано, что нейтрофилы, которые в большом количестве накапливаются в сайте инфекции, способны уничтожать доступные ЭТ, возможно, благодаря эффективному слиянию лизосом с фагосомами, содержащими ЭТ, и освобождению миелопероксидазы и оксидантов [Yong Е.С. 1982, 1986]. К тому же, в сайте инфекции собираются Т-лимфоциты, играющие критическую роль в контроле над инфекцией [Williams 1981]. В большинстве случаев ответ хозяина на первичную инфекцию кратковременен и не ассоциирован с серьезными повреждениями тканей [Кио 1988].
В ходе реинфекции или активации персистирующей инфекции развивается воспаление, подобное воспалению при первичной хламидийной инфекции, в то время как инфильтрация Т-клетками происходит быстрее и в большем количестве, по сравнению с ответом на первичную инфекцию. Воспалительная реакция в конечном итоге приводит к фиброзу и образованию рубцов, что и является причиной слепоты, трубного бесплодия и эктопической беременности [Grayston 1985]. В настоящее время достоверных данных относительно механизмов, запускающих процесс разрушения тканей, не получено. Самое большое распространение получила гипотеза о критической роли белков теплового шока в иммунопатогенезе хламидийной инфекции.
В ходе нормального развития любой живой клетки белки теплового шока вовлечены в процессы жизнедеятельности: укладка белков, транслокация их через мембраны, связывание с гормональными рецепторами и т.д. Синтез этих белков значительно возрастает в различных стрессовых ситуациях, таких как воздействие химическими агентами, повышение температуры или инфекционный процесс [Neuer 2000]. Белки теплового шока высоко консервативны в эволюции: так, белки человека и С.trachomatis, принадлежащие одному семейству 60 kDa белков, обнаруживают 48% гомологии аминокислотных последовательностей. Несмотря на это, бактериальные белки теплового шока являются сильными иммуногенами для человека [Neuer 2000]. Хламидии отвечают на различные неблагоприятные воздействия синтезом нескольких белков теплового шока, важнейшим из которых с точки зрения участия в иммунопатогенезе хламидийной инфекции считают белок массой kDa, относящийся к семейству 60 kDa белков теплового шока. Развитие иммунного ответа на хламидийный Hsp60 впервые было описано R.P. Morrison и соавторами (1989). В ходе последующих исследований на макаках Резус было показано, что хламидийный Hsp60 индуцировал провоспалительную иммунную реакцию в фаллопиевых трубах у животных, которые ранее были инфицированы хламидиями, и что именно этот иммунный ответ инициировал спаечный процесс в трубах [Patton 1994].
Исследования, проведенные с целью установить участие хламидийного Hsp60 в патологических процессах в организме человека, выявили корреляцию гуморального [Brunham 1985, Тоуе 1993, Claman 1997, Ault 1998] и клеточного [Witkin 1993] иммунитета к хламидийному Hsp60 с ВЗОМТ и трубным бесплодием. Цервикальные IgA против хламидийного Hsp60 также были обнаружены у женщин при неудачах оплодотворения in vitro [Witkin 1994].
Суть гипотезы относительно роли белков теплового шока в иммунопатогенезе хламидийной инфекции состоит в следующем: за острой хламидийной инфекцией следует иммунный ответ, который ограничен эпитопами белка, специфическими для микроорганизма. Однако в результате пролонгированной или повторной презентации антигена - данная ситуация может иметь место при недиагностированной хламидийной инфекции верхних отделов генитального тракта - возможен запуск иммунного ответа на консервативные эпитопы белка, гомологичные консервативным эпитопам человеческого белка. Последующая сенсибилизация человеческим Hsp60 может вызвать аутоиммунный ответ [Witkin 1996]. Среди реакций иммунного каскада реакциями первостепенной важности являются продукция Т-лимфоцитами и макрофагами цитокинов - интерферона у, фактора некроза опухолей а, интерлейкинов - и экссудация фибрина генитальными и перитонеальными тканями. Исследования in vitro показали, что интерферон у способен блокировать репродуктивный цикл хламидий, подавление же репликации приводит к синтезу хламидиями белков теплового шока [Beatty 1993]. Эти белки, в особенности 60 kDa белок, генерируют гиперчувствительность замедленного типа и поддерживают восприимчивость к воспалительной реакции и реактивации другими бактериальными антигенами, аминокислотные последовательности которых гомологичны хламидийному антигену Hsp 60. Такой медленный воспалительный процесс имеет своим следствием непрерывную продукцию фибрина и повреждение тканей в трубах и органах малого таза [Patton 1994].
Многие авторы связывают риск эктопической беременности с перенесенной в прошлом хламидийной инфекцией. Фактически, повреждения тканей в маточных трубах и нарушения их функций, вызванные недиагностированной и поэтому непролеченной хламидийной инфекцией, являются наиболее частыми причинами эктопической беременности [Neuer 2000].
Многие женщины с трубным бесплодием, так же как и после удаления труб в результате эктопической беременности, пытаются забеременеть посредством оплодотворения in vitro. Белки теплового шока в числе первых начинают экспрессироваться как зиготой, так и децидуальнои оболочкой [Neuer 2000]. Экспрессия белков теплового шока материнскими и эмбриональными тканями в норме не опасна для беременности, если только мать ранее не была сенсибилизирована хламидийным белком теплового шока. В противном случае экспрессия Hsp60 может реактивировать лимфоциты и индуцировать провоспалительный иммунный ответ, способный привести к иммунному отторжению [Witkin 1999].
Авторы многих работ ставят перед собой вопросы, возможно ли предсказание результата оплодотворения in vitro на основании наличия хронической хламидийной инфекции и насколько информативны в таких случаях тесты на обнаружение антител к хламидийным и человеческим белкам теплового шока. Большинство исследователей сходятся во мнении, что ни антитела к основным антигенам хламидии, ни антитела к хламидийному Hsp60 сами по себе не могут служить надежными маркерами для предсказания результатов оплодотворения in vitro, и что необходимо больше исследований для определения такого маркера или ассоциации маркеров [Spandorfer 1999, Witkin 2002].
Чувствительность клинических изолятов хламидий к антибактериальным препаратам
Для определения чувствительности клинических изолятов хламидий к антибиотикам отбор пациентов проводили по следующей схеме: при выделении хламидий в культуре клеток пациента приглашали на повторное исследование с рекомендацией провести его не ранее, чем через 3-4 недели после окончания лечения. Антибактериальную терапию назначали врачи -акушеры-гинекологи и урологи. При взятии материала на контрольное исследование (соскобов эпителия цервикального канала у женщин и уретры у мужчин) врач указывал препараты, которые использовались для антихламидийной терапии, а также последний день приема антибиотиков. Затем клинический материал исследовали методами ГЩР и КК. Изоляты хламидий, выделенные до лечения, хранили при -70С. После получения материала для контрольного исследования эти изоляты размножали и определяли их чувствительность к антибиотикам.
Из 150 пациентов, приглашенных нами на контрольное исследование, явились только 25 - 20 женщин и 5 мужчин. Для клинических изолятов, выделенных от этих пациентов, была определена чувствительность к доксициклину, азитромицину, джозамицину, спирамицину и офлоксацину. Кроме того, определена чувствительность к кларитромицину двух изолятов (18362Сх и 906Сх), выделенных от пациентов, которым было назначено комбинированное лечение. В табл. 2, 3, 4, 5 и 6 представлены значения МИК (минимальная ингибирующая концентрация), МИК9о (минимальная концентрация антибиотика, при которой происходит ингибирование 90% и более популяции хламидий) и МБК (минимальная бактерицидная концентрация) доксициклина, азитромицина, джозамицина, спирамицина и офлоксацина, соответственно. Таблица 2 Значения МИК, МИК90 и МБК доксициклина для 25 клинических изолятов хламидий - концентрации офлоксацина приводятся в мкг/мл контрольный чувствительный штамм Результаты тестирования чувствительности хламидий к антибиотикам суммированы в таблице 7. Так как распределение клинических изолятов по исследуемому признаку - чувствительности к антибиотикам, выраженной в значениях МИК и МБК, - асимметрично, для описания данных тестирования использовалось понятие медианы. Медиана - это элемент выборки, число элементов со значениями больше которого и меньше которого - равно.
Значение для референс штамма 0.16 0.02 0.08 2 - концентрации антибиотиков приводятся в мкг/мл (спирамицина - в Ш/мл) А - VR-885 Из табл. 7 видно, что значения МИК и МБК варьируют в очень широких пределах для всех антибиотиков. Напротив, значения МИК9о всех антибиотиков находятся в очень узком диапазоне - это значит, что резкое уменьшение количества включений (на 90% и более) происходит при очень близких концентрациях антибиотика. Значения МБК незначительно превышают значения МИК: наибольшее отличие в медианах значений МБК и МИК зафиксировано для джозамицина - в 4 раза. Кроме того, в табл. 7 представлены значения МИК и МБК антибиотиков, определенные для контрольного чувствительного штамма YR-885. Их сравнение с медианами значений МИК и МБК антибиотиков для клинических изолятов показывает, что значения МИК и МБК доксициклина, азитромицина и джозамицина, полученные при исследовании клинических изолятов, превышают значения МИК и МБК этих антибиотиков, полученные для референс-штамма: для доксициклина МИК - в 8 раз, МБК - в 4 раза, азитромицина МИК - в 8 раз, МБК - в 16 раз, джозамицина МБК - в 4 раза.
Результаты тестирования чувствительности изолятов 18362Сх и 906Сх к кларитромицину представлены в табл. 8. Полученные данные позволяют сделать вывод о чувствительности этих изолятов к кларитромицину, так как их значения МИК и МБК близки к значениям МИК и МБК для референс-штамма. - концентрации кларитромицина приводятся в мкг/мл - контрольный чувствительный штамм Таблица 9 Чувствительность 25 клинических изолятов хламидий к антибиотикам Изолят Доксициклин Азитромицин Джозамицин Спирамицин Офлоксацин
В результате сравнения МИК и/или МБК клинического изолята с МИК и/или МБК чувствительного референс штамма каждый изолят был определен как чувствительный или устойчивый к антибиотику (табл. 9). Изолят считали устойчивым, если значения МИК и/или МБК превышали значения МИК и/или МБК, определенные для референс штамма, в 10 и более раз. Из 25 изолятов 10 (40±19.6%) продемонстрировали высокий уровень резистентности к доксициклину, и 10 (40±19.6%) - к азитромицину; 11 (44±19.9%) изолятов оказались устойчивыми к джозамицину, 11 (44±19.9%) - к спирамицину и 11 (44±19.9%) - к офлоксацину. Множественную резистентность (устойчивость к двум и более антибиотикам) проявили 12 (48±20%) изолятов, причем 6 из них (изоляты 4873Сх, 1870Сх, 5565U, ПСх, 729Сх и 2481Сх) оказались устойчивыми ко всем протестированным антибиотикам.
Особого внимания заслуживает вопрос о характере резистентности, проявленной клиническими изолятами хламидий. Для всех этих штаммов значения МИК и МБК выходили за пределы исследованного диапазона концентраций антибиотиков, тогда как значения МИК9о не превышали значений МИК90, определенных для контрольного чувствительного штамма. Такой тип резистентности, при котором концентрация антибиотика, необходимая для подавления роста всех микроорганизмов, существенно превышает концентрацию антибиотика, ингибирующую рост 90% популяции, R.B. Jones с соавторами (1990) назвали гетеротипической резистентностью. Для иллюстрации этого понятия представлены кривые роста 2 изолятов, которые мы определили как чувствительный (18362Сх) и резистентный (1870Сх) к доксициклину, в присутствии возрастающих (от 0.01 до 5.12 мкг/мл) концентраций этого антибиотика (рис. 2). Из графика видно, что ингибирование всей популяции изолята 18362Сх произошло в очень узком диапазоне концентраций доксициклина - от 0.04 до 0.08 мкг/мл. Кривая ингибирования изолята 1870Сх показывает, что в диапазоне концентраций доксициклина от 0.08 до 0.16 мкг/мл происходит ингибирование приблизительно 99% популяции хламидий, и с возрастанием концентрации антибиотика количество включений практически не уменьшается. С этой же целью представлены микрофотографии, изображающие рост изолятов 18362Сх и 1870Сх на разных концентрациях доксициклина (рис. 3).
Применение метода ОТ-ПЦР (ПНР с обратной транскрипцией) для оценки эффективности действия антибиотиков на рост хламидий в культуре клеток
Возможности применения метода ОТ-ПЦР для оценки эффективности действия антибиотиков на рост хламидий в культуре клеток были продемонстрированы сравнением двух методических подходов - ОТ-ПЦР и визуализации включений методом прямой иммунофлюоресценции (ПИФ). Для этого 11 клинических изолятов хламидий, отобранных случайным образом, культивировали в присутствии доксициклина, азитромицина и офлоксацина параллельно в двух наборах планшет. Из хламидий, выращенных в одном наборе планшет, выделяли РНК; хламидий, выращенные во втором наборе планшет, визуализировали с применением моноклональных антител.
В качестве мишеней ОТ-ПЦР были использованы 16S рРНК и мРНК гена отрЗВ, кодирующего один из белков наружной мембраны хламидий, так как в тотальном препарате РНК они содержатся в значительном количестве, что обеспечивает высокую чувствительность метода. Кроме того, ген отрЗВ начинает экспрессироваться при формировании инфекционных элементарных телец и поэтому может служить маркером созревания хламидий.
После проведения обратной транскрипции и последующей ПЦР с парами праймеров ОМ1-ОМ2, 16S1-16S2, АС1-АС2 выявляли на электрофореграмме фрагменты длиной 286, 194 и 294 п.о., являющиеся продуктами амплификации кДНК генов отрЗВ, 16S рРНК и цитоплазматического у-актина, соответственно. РНК гена у-актина клеток McCoy можно было выявить как в образцах РНК, экстрагированной из незараженной культуры, так и в РНК, экстрагированной из зараженной С. trachomatis культуры клеток McCoy. В дальнейшем, если в исследуемом
образце не обнаруживалась хламидийная РНК, результаты учитывались только в случае обнаружения в нем мРНК гена у-актина.чувствительности 11 клинических изолятов хламидии к доксициклину, азитромицину и офлоксацину. Значения МБК определяли только методом ПИФ. Для описания данных использовали понятие медианы - элемента выборки, число элементов со значениями больше которого и меньше которого - равно. Иными словами, половина изолятов имеют значение признака (МИК или МБК) больше медианы, половина - меньше. Из табл. 13 видно, что значения МИК и МБК, определенные как методом ОТ-ПЦР, так и ПИФ, варьируют в очень широких пределах для всех антибиотиков. Сравнение медиан значений МИК и МБК, определенных методом ПИФ, показывает, что значения МБК всех трех антибиотиков незначительно (в 2 раза) превышают значения МИК.
Значения МИК, определенные при помощи метода ОТ-ПЦР 16S рРНК, были существенно выше значений МИК и МБК, определенных методом ПИФ. Так, медианы значений МИК всех трех антибиотиков, полученные при использовании метода ОТ-ПЦР 16S рРНК, превышают медианы значений МИК, полученные при использовании метода ПИФ, в 8 раз. На рис. 8 представлена электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента 16S рРНК двух клинических изолятов - 4873Сх и 2830U, выращенных в присутствии возрастающих концентраций азитромицина. Значения МИК и МБК азитромицина, определенные для изолята 4873Сх методом ПИФ, превышали 5.12 мкг/мл (устойчивый изолят). Значения МИК и МБК азитромицина, определенные для изолята 2830U методом ПИФ, равнялись 0.04 и 0.16 мкг/мл, соответственно (чувствительный изолят).
На электрофореграмме видно присутствие продуктов ОТ-ПЦР, полученных амплификацией фрагмента 16S рРНК изолята 4873Сх, на всех концентрациях азитромицина, что согласуется с данными микроскопии: мы наблюдали внутриклеточные включения хламидий при культивировании этого изолята на всех исследованных концентрациях азитромицина. Присутствие продуктов ОТ-ПЦР 16S рРНК изолята 2830U на концентрациях азитромицина, превышающих значение МБК азитромицина для этого изолята (0.16 мкг/мл), говорит о том, что жизнеспособные хламидий обнаруживаются методом ОТ-ПЦР 16S рРНК даже на тех концентрациях антибиотика, на которых хламидийные колонии не обнаруживаются при микроскопии
Электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР фрагмента гена 16S рРНК изолятов 4873Сх и 2830U, культивированных в присутствии азитромицина 1-7 - клинический изолят 4873Сх; 8-14 - клинический изолят 2830U; 1,8-хламидии, культивированные без антибиотика; 2-7 и 9-14 - хламидии, культивированные в присутствии азитромицина в концентрации, удваивающейся от 0.08 мкг/мл до 2.56 мкг/мл. 15 - культура клеток McCoy, не зараженная С. trachomatis
Значения МИК антибиотиков, определенные при помощи ОТ-ПЦР отрЗВ, были близки значениям МБК, полученным при использовании метода ПИФ: из табл. 13 видно, что медианы значений МИК всех трех антибиотиков, определенные методом ОТ-ПЦР отрЗВ, равны медианам значений МИК, определенным методом ПИФ. На рис. 9 представлена электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента гена отрЗВ двух клинических изолятов - 4873Сх и 2830U, выращенных в присутствии возрастающих концентраций азитромицина. На электрофореграмме видно присутствие продуктов ОТ-ПЦР, полученных при амплификации фрагмента отрЗВ изолята 4873Сх, на всех концентрациях азитромицина. Что же касается изолята 2830U, то здесь мы наблюдаем отсутствие продуктов ОТ-ПЦР отрЗВ на концентрациях азитромицина, превышающих 0.16 мкг/мл. Иначе говоря, при использовании метода ОТ-ПЦР отрЗВ мы получили значение МИК азитромицина (0.32 мкг/мл), близкое значению МБК (0.16 мкг/мл), полученное при использовании метода ПИФ
