Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор данных литературы 13
1.1. Классификации хламидий 13
1.2. Общая характеристика хламидий 16
1.3. Клиника и эпидемиология хламидийных инфекций 20
1.4. Методы лабораторной диагностики урогенитальных хламидиозов...26
1.5. Антигенная структура наружной мембраны С. trachomatis 34
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 46
2.1. Материалы 46
2.2. Методы 46
2.2.1. Биологические методы 46
2.2.2. Серологические методы 47
2.2.3. Физико-химические методы 51
2.2.4. Физические методы 54
2.2.5. Статистические методы 54
ГЛАВА 3. Разработка метода выделения и оценка специфической активности растворимых антигенов С. Trachomatis 55
ГЛАВА 4. Изучение химического состава природного видоспецифического антигена С. Trachomatis 71
4.1. Изучение фосфолипидного состава природного видоспецифического антигена С trachomatis 71
4.2. Изучение углеводного состава природного видоспецифического антигена С. trachomatis 74
4.3. Определение содержание аминокислот в составе природного видоспецифического антигена С. trachomatis 75
4.4. Изучение фракционного состава белков природного видоспецифического антигена С. trachomatis 77
ГЛАВА 5. Конструирование и изучение специфичности и чувствительности иммуноферментной тест-системы для определения видоспецифических антител класса g к с. trachomatis 81
5.1. Изучение специфичности разрабатываемой иммуноферментной тест-системы 82
5.2. Оценка чувствительности и специфичности первоначального варианта иммуноферментной тест-системы с помощью сывороток стандартной панели ОСО 42-28-313-00 ГИСК им. Л.А. Тарасевича (серия 002) 86
5.3. Совершенствование комплектации иммуноферментной тест-системы и методики проведения иммуноферментного анализа 89
5.4. Разработка критериев полуколичественной оценки активности исследуемых сывороток в иммуноферментном анализе 92
5.5. Материалы по экспериментально-клинической оценке видоспецифической иммуноферментной тест-системы Хламивид 98
Заключение 101
Выводы 110
Библиографический список
- Классификации хламидий
- Биологические методы
- Изучение фосфолипидного состава природного видоспецифического антигена С trachomatis
- Изучение специфичности разрабатываемой иммуноферментной тест-системы
Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы хламидийные инфекции
приобрели особую актуальность. Значительная распространенность
хламидиозов среди людей ставит их в разряд серьезных проблем национальных
служб охраны здоровья во многих странах мира [15, 29]. Хламидийные
инфекции представляют собой группу этиологически родственных
инфекционных заболеваний антропонозной и зоонозной природы, которые
характеризуются сходным патогенезом и выраженным полиморфизмом
клинических проявлений [20, 42, 82]. Этиологическими агентами хламидийных
инфекций являются хламидии - патогенные облигатные внутриклеточные
грамотрицательные бактерии, объединенные в порядок Chlamydiales. Согласно
современной классификации, порядок Chlamydiales представлен более чем 10
видами хламидии, способных поражать как человека, так и позвоночных и
беспозвоночных животных [25, 155] Антропонозные хламидиозы
характеризуются большим разнообразием нозологических форм, среди которых
можно выделить следующие основные группы:
заболевания, связанные с поражением слизистой оболочки глаза (трахома, паратрахома, различные виды конъюнктивитов);
заболевания верхних дыхательных путей, бронхов и легких (ОРЗ, фарингиты, бронхиты, синуситы, гриппоподобные заболевания, пневмонии, бронхиальная астма);
заболевания мочеполовой системы (цервицит, уретрит, сальпингит, простатит, эпидидимит, венерическая лимфогранулема и др.);
- заболевания, связанные с генерализацией и персистенцией хламидийной
инфекции в организме больного и формированием аутоиммунного ответа на
собственные ткани и органы (синдром Рейтера, эндокардит, коронарная
болезнь, артрит).
6 Наиболее серьезный вред здоровью людей приносят хламидийные
инфекции, передающиеся половым путем - урогенитальные хламидиозы,
которые, как правило, вызываются хламидиями, относящимися к виду
Chlamydia trachomatis [82, 94]. По данным ВОЗ, в 1995 г. в мире
зарегистрировано 89 млн случаев урогенитальных хламидиозов. Отмечено, что
ежегодно выявляется около 10 млн новых больных, страдающих этой
инфекцией [137]. Анализ, проведенный А.А. Шаткиным (1983), показал, что в
России скорость распространения урогенитальных хламидиозов составляет до 1
млн случаев в год. Урогенитальная хламидийная инфекция опасна своими
последствиями как для здоровья отдельного индивидуума, так и благополучия
всего человеческого общества. Последствия не выявленной и не леченой
хламидийной инфекции наносят обществу значительный демографический
ущерб. В настоящее время доказано, что широкая распространенность
урогенитальной хламидийной инфекции в человеческой популяции, наряду с
другими причинами, приводит к снижению уровня рождаемости в
цивилизованных странах [94]. Хламидийная инфекция является также
причиной высоких экономических затрат, обусловленных необходимостью
лечения и медицинского обслуживания страдающих этой патологией людей.
Экономические потери от урогенитальных хламидиозов в США оценены в 1
млрд долларов в год, а потери от не леченой хламидийной инфекции достигают
4 млрд долларов ежегодно [29]. Для решения проблемы урогенитальной
хламидийной инфекции ВОЗ рекомендует создание федеральных программ по
предупреждению инфекций, передаваемых половым путем, в том числе
хламидиоза, при интеграции специалистов различных сфер медицинской
деятельности, в частности, дерматологов и венерологов, акушеров-гинекологов
и офтальмологов, артрологов и бактериологов, иммунологов; проведение
научного поиска во всех аспектах проблемы хламидийных инфекций, особенно
направленных на предупреждение развития постхламидийных осложнений [89].
Успех в лечении хламидийной инфекции и в предупреждении осложнений во многом обеспечивается своевременной и адекватной диагностикой. Характерной чертой клинических проявлений урогенитальных хламидиозов является отсутствие опорных симптомов, что значительно осложняет их клиническое распознавание. В силу указанных причин решающее значение в выявлении урогенитальной хламидийной инфекции имеют методы лабораторной диагностики [29, 35, 89]. В настоящее время в мире разработаны достаточно чувствительные и специфичные методы лабораторной диагностики хламидиозов, которые можно подразделить на две большие группы:
- методы, основанные на обнаружении в исследуемых образцах хламидий
и их антигенов или фрагментов хламидийной ДНК;
- методы, основанные на определении специфических антител к С.
trachomatis в сыворотках больных.
Методы первой группы при условии высокого качества их исполнения являются, несомненно, наиболее убедительными для постановки диагноза текущей хламидийной инфекции. Однако при хронических и генерализованных формах хламидиозов, сопровождающихся воспалительными процессами в малом тазе, при развитии постхламидийных осложнений обнаружение хламидий или их антигенов возможно далеко не всегда [4, 75, 77]. В подобных случаях успешно применяются методы определения противохламидийных антител (серодиагностика).
Учитывая, что до настоящего времени в мировой практике нет абсолютно надежного метода диагностики урогенитальной хламидийной инфекции, лабораторная диагностика хламидиозов должна носить комплексный характер [29, 89]. Использование методов серодиагностики в сочетании с методами
определения возбудителя в биосубстратах обеспечивает врача более достоверной информацией об этиологической природе инфекции у больного [77].
В последние годы в серодиагностике хламидиозов широкое распространение получил метод непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. Указанный метод является достаточно надежным и позволяет с высокой степенью достоверности выявлять противохламидийные антитела в сыворотках больных [15, 77]. При этом для диагностики урогенитальных хламидиозов используются как родоспецифические, так и видоспецифические иммуноферментные тест-системы. В родоспецифических тест-системах сенситином для твердой фазы, как правило, служит хламидийный родоспецифический антиген - липополисахарид [77]. Родоспецифические иммуноферментные тест-системы позволяют констатировать факт наличия или отсутствия противохламидийных антител в сыворотках больных. В то же время, учитывая возможность перекрестных реакций, связанных с присутствием в сыворотках больных специфических антител к различным видам хламидий, для определения этиологической обусловленности заболевания возникает необходимость видоспецифической дифференциации иммунного ответа [15, 87]. В силу этих причин для диагностики урогенитальной хламидийной инфекции целесообразно использовать не только родо-, но и видоспецифические тест-системы. При разработке последних в качестве сенситина твердой фазы обычно используют различные синтетические или рекомбинантные варианты видоспецифических хламидийных антигенов. Однако искусственно полученные видоспецифические антигены, по-видимому, не могут содержать в полной мере весь спектр видоспецифических антигенных детерминант хламидий [194, 215]. Данное обстоятельство, несомненно, неблагоприятно отражается на диагностической эффективности таких тест-систем. В связи с этим, исследования по созданию иммуноферментной тест-
системы на основе природного хламидийного видоспецифического антигена, полученного из нативных С. trachomatis, представляются актуальными и перспективными.
Цель настоящего исследования - конструирование и оценка видоспецифической иммуноферментной тест-системы для определения иммуноглобулинов класса G к С. trachomatis на основе природного видоспецифического антигена С. trachomatis.
Основные задачи исследования:
Разработать метод получения природного видоспецифического антигена из овокультуры С. trachomatis.
Изучить специфическую активность выделенного антигена и выяснить его химическую природу.
Сконструировать видоспецифическую иммуноферментную тест-систему на основе альтернативного варианта природного видоспецифического антигена С. trachomatis.
Изучить чувствительность, специфичность, диагностическую ценность иммуноферментной тест-системы, сконструированной на основе альтернативного варианта природного хламидийного видоспецифического антигена.
Научная новизна. Разработан способ получения природного видоспецифического антигена из овокультуры С. trachomatis с помощью обработки инактивированной очищенной овокультуры хламидий анионными детергентами и простым эфиром моносахарида. Показано, что приготовленный антиген С. trachomatis представлен основным белком наружной мембраны хламидий с молекулярной массой 39,5 кДа и двумя минорными фракциями с молекулярной массой 67-70 кДа, а также фосфолипидами -фосфатидилинозитом, фосфатидилэтаноламином и фосфатидилсерином. Установлено, что полученный по разработанному способу антиген С.
10 trachomatis как сенситин в иммуноферментной тест-системе обладает
выраженными сенсибилизирующей активностью и видоспецифическими
свойствами. Впервые на основе полученного природного видоспецифического
антигена С. trachomatis сконструирована иммуноферментная тест-система для
выявления видоспецифических иммуноглобулинов класса G к С. trachomatis,
характеризующаяся высокой специфичностью и чувствительностью.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о методологических подходах к изучению антигенной структуры С. trachomatis, выделению видоспецифических антигенов хламидий и использованию их для видоспецифической диагностики хламидийных инфекций. Сконструирована иммуноферментная тест-система «Хламивид», являющаяся эффективным тестом для выявления видоспецифических иммуноглобулинов класса G к С. trachomatis в сыворотках больных. На иммуноферментную тест-систему «Хламивид» разработана Нормативно-техническая документация, одобренная Научно-техническим советом ФГУП «Пермское НПО «Биомед». Материалы диссертации внедрены в практику ФГУП «Пермское НПО «Биомед» для оценки уровня хламидийных антител в нормальном донорском иммуноглобулине, а также в учебный процесс на кафедре микробиологии и факультете усовершенствования подготовки врачей Пермской медицинской академии.
Основные положения, выносимые на защиту
Метод обработки анионными детергентами и простым эфиром моносахарида инактивированной очищенной взвеси овокультуры С. trachomatis обеспечивает получение хламидийного антигена, обладающего высокой сенсибилизирующей и серологической активностью, а также выраженными видоспецифическими свойствами.
Приготовленный антиген С. trachomatis представлен доминирующей белковой фракцией основного белка наружной мембраны хламидий с
11 молекулярной массой 39,5 кДа и двумя минорными белковыми фракциями с
молекулярной массой 67-70 кДа, а также фосфолипидами -
фосфатидилинозитом, фосфатидилэтаноламином и фосфатидилсерином.
3. Иммуноферментная тест-система «Хламивид» для определения иммуноглобулинов класса G, созданная на основе полученного природного видоспецифического антигена С. trachomatis, характеризуется высокой специфичностью и чувствительностью.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийской научной конференции, посвященной 95-летию Уфимского НИИВС им. И.И. Мечникова ГУП «Иммунопрепарат», 2000; Пленарном заседании Пермского филиала Всероссийского общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов, 2001; Международной научной конференции «Перспективы развития естественных наук в высшей школе», Пермь, 2001. Диссертация апробирована на расширенном заседании Научно-технического совета ФГУП «Пермское НПО «Биомед».
По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 131 страницах машинописного текста, содержит 18 таблиц и 7 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора данных литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав экспериментальных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 221 литературный источник, из них 128 отечественных и 93 иностранных авторов.
Диссертационная работа выполнена лично автором (номер государственной регистрации 01.200.1.08827) в соответствии с планом НИР НИИ вакцин и сывороток ФГУП МЗ РФ «Пермское НПО Биомед», на базе научно производственной лаборатории хламидийных препаратов (зав. лаб. -д.м.н. О.А. Тимашева). Иммунохимический раздел работы выполнен при
содействии лаборатории биохимии микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (зав. лаб - к.м.н., с.н.с. В.П. Коробов).
Автор выражает искреннюю благодарность всем участником совместных исследований, которые отражены в соответствующих публикациях.
Классификации хламидий
Первые сведения о хламидиях относятся к 1907 г, когда Л. Гальберштедтер и С. Провачек доказали инфекционную природу трахомы, описав цитоплазмотические включения возбудителя в эпителиальных клетках мазков-отпечатков с конъюнктивы больного, а затем и выделив возбудитель. К настоящему времени выделено, описано и систематизировано более 10 видов хламидий [29, 57, 81, 88].
Согласно традиционной классификации, хламидий относили к классу Introcytobiotes порядку Chlamydiales, который включал в себя единственное семейство Chlamydiaceae, содержащее 1 род - Chlamydia. Род Chlamydia был представлен четырьмя видами [25, 125, 182]:
С. trachomatis - возбудитель антропонозов, вызывает конъюнктивиты, артриты, урогенитальные хламидиозы (УХ), венерическую паховую лимфогранулему и пневмонии новорожденных [33, 39, 57, 81, 88, 126];
С. psittaci - возбудитель зооантропонозных инфекций, орнитоза/пситтакоза птиц и различных нозологических форм инфекций у млекопитающих [16, 21, 29, 33, 58, 95, 108, 110, 112, 126];
С. pneumoniae - возбудитель пневмонии и острых респираторных заболеваний человека [57, 81, 88];
С. ресогит - возбудитель зоонозов различных видов животных, проявляющихся в виде полиартритов, кератоконъюнктивитов, пневмоний, гастроэнтеритов, маститов, абортов, энцефалитов и пр. [33, 57].
Однако, традиционная классификация имела ряд недостатков. В частности, к виду С. trachomatis - возбудителю антропонозных инфекций, был отнесен биовар МоРп - возбудитель заболеваний грызунов [25, 125, 126, 182], а к виду С. psittaci - некоторые биовары, существенно отличающиеся друг от друга по ряду фенотипических признаков и по характеру вызываемых ими заболеваний.
Основным недостатком указанной системы классификации хламидии являлось то, что в ней не были учтены недавно открытые хламидиоподобные микроорганизмы, поражающие рыб, амфибий, моллюсков, членистоногих и некоторые высшие растения [25, 125, 126, 182].
В конце XX века была разработана новая система классификации хламидии, основанная не только на систематизации культуральных, фенотипических, морфологических признаков хламидии, но и учитывающая принципы геносистематики, то есть анализ гомологии генов, кодирующих хламидийные 16S и 23 S рРНК. Основные критерии геносистематики зиждятся на 95%-ной гомологии указанных генов у представителей рода, 90%-ной - у представителей семейств и 80%-ной - у представителей порядка/класса микроорганизмов [25, 125, 126, 155, 156, 157, 182].
Новая система классификации хламидии была официально принята летом 1999 года, согласно ей хламидии также относятся к классу Intracytobiotes, порядку Chlamydiales. Однако, порядок Chlamydiales теперь включает в себя четыре семейства: Chlamydiaceae, Parachlamydiaceae, Simkaniaceae, Waddliaceae [25, 125, 126, 155, 156, 157, 182].
В семействе Chlamydiaceae выделено два рода: Chlamydia и Chlamydophila. Род Chlamydia включает 3 вида: С. trachomatis - возбудители антропонозных заболеваний представлены 18 сероварами [133]; С. muridarum - возбудитель заболеваний грызунов семейства Muridae, ранее рассматривался как биовар С. trachomatis — возбудитель мышиной пневмонии (МоРп) [159, 189, 210]; С. suis - новый вид, выделенный от свиней Suis scrofa с конъюнктивитами, пневмониями и энтеритами [201, 212, 220]. Род Chlamydophila представлен 6 видами:
С. pneumoniae - возбудители респираторных инфекций у человека и некоторых млекопитающих представлены 3 биоварами: биовар TWAR -поражает человека, биовар Equine - коней, биовар Koal - сумчатых животных [130, 140, 152];
С. ресогит - вызывает, как правило, зоонозные инфекции у свиней, жвачных и сумчатых, но может также поражать и людей [125, 126]; С. psittaci - возбудители орнитоза (пситтакоза), представлены 8 сероварами [209]. Из С. psittaci в самостоятельные виды выделены: С. abortus - поражающие плаценту жвачных животных, обуславливает спорадические аборты у домашнего скота, возможно также заражение людей, находящихся в контакте с больными животными [167, 171]. С. caviae - возбудитель конъюнктивитов и болезней репродуктивных органов у морских свинок [221]. С. felis - возбудитель конъюнктивитов и ринитов у домашних кошек и людей, находящихся в контакте с больными животными [200].
Семейство Parachlamydiaceae представленно одним родом -Parachlamydia и одним видом - P. acanthamoebae, который является паразитом амеб, но способен поражать и людей. Хламидии указанного вида вариабельно окрашиваются по Граму и способны культивироваться в линии клеток Vero. Для них характерна негативная реакция с моноклональными антителами против липополисахаридного (LPS) комплекса семейства Chlamydiaceae [129, 136].
Биологические методы
В экспериментальных исследованиях использован возбудитель венерической лимфогранулемы С. trachomatis L2 (особое название «343») [60]. Штамм получен из Музея культур хламидий Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН от проф. А.А. Шаткина.
Антигены В серологических исследованиях применяли рекомбинантный видоспецифический антиген С. trachomatis, полученный из ООО "Биоагромед", г. Боровск; природный видоспецифический антиген С. trachomatis, полученный по разработанному нами методу, родоспецифический хламидийный антиген «Хламисен» (производства ФГУП «Пермское НПО «Биомед»); тест-антигены С. trachomatis и С. psittaci для РНИФ (производства ФГУП «Пермское НПО «Биомед»).
Сыворотки В серологических исследованиях использовали сыворотки, полученные от больных, находившихся в условиях поликлинического и клинического лечения в ЛПУ г. Перми, а также стандартную панель сывороток, содержащих и не содержащих видоспецифические антитела к С. trachomatis (ЗАО МБС, Новосибирск, серия № 002).
С. trachomatis (штамм L2) культивировали в 7-суточных куриных эмбрионах. Заражение куриных эмбрионов проводили в желточный мешок овокультурой С. trachomatis в дозе 100 LD50. Инкубирование зараженных куриных эмбрионов вели при температуре 37,0+0,5 С и относительной влажности воздуха 62±2 %. Максимальная специфическая гибель эмбрионов наступала на 5-6 сутки после заражения. Выход желточных мешков с высоким накоплением хламидий составлял 38 - 40%.
Для определения сенсибилизирующего разведения исследуемых антигенов проводили их сорбцию в различных разведениях на полистироловые планшеты для ИФА. Готовили разведения антигена 1/100; 1/200; 1/400; 1/800 на фосфатном солевом буферном растворе рН 7,2±0,2 (ФСБ). В лунки планшета (А1-Н1) вносили по 100 мкл антигена в разведении 1/100, в лунки (А2-Н2) - по 100 мкл антигена в разведении 1/200, в лунки (АЗ-НЗ) - по 100 мкл антигена в разведении 1/400, в лунки (А4-Н4) - по 100 мкл антигена в разведении 1/800. Планшет помещали в полиэтиленовый пакет и оставляли на (18±2) ч при температуре 10 С.
По истечении указанного времени планшет с иммобилизованным антигеном однократно промывали фосфатным солевым буферным раствором, содержащим Твин-20, рН - 7,2±0,2 (ФСБ-Т). Перед этим антиген из планшета удаляли и в каждую лунку вносили не менее 200 мкл ФСБ-Т. Промывочный раствор сливали, остатки жидкости удаляли, энергично постукивая перевернутым планшетом по сложенной в несколько раз фильтровальной бумаге.
В лунки (А1-А4, В1-В4, С1-С4) вносили по 100 мкл положительной контрольной сыворотки (К+), в лунки (D1-D4, Е1-Е4, F1-F4) вносили по 100 мкл отрицательной контрольной сыворотки (К-), в лунки G1-G4 и Н1-Н4, предназначенные для контроля конъюгата, вносили по 100 мкл ФСБ-Т. Планшет помещали в полиэтиленовый пакет и инкубировали в течение 40 мин при температуре (37±1) С. По окончании инкубации планшет промывали ФСБ-Т 5 раз, как описано выше.
После промывки и удаления влаги в каждую лунку планшета вносили пероксидазный антивидовой конъюгат против IgG человека (производства АО «Капель», Москва) в рабочем разведении объемом по 100 мкл. Планшет закрывали и инкубировали 30 мин при температуре 37±1 С. По окончании инкубации планшет промывали ФСБ-Т пять раз и удаляли остатки влаги из планшета.
Затем в каждую лунку планшета вносили раствор ОФД объемом по 100 мкл. Планшет помещали на 15 мин в защищенное от света место при температуре 22+2 С. Реакцию останавливали внесением в каждую лунку по 50 мкл серной кислоты с концентрацией 0,9 моль/л.
Результаты ИФА регистрировали на анализаторе для иммуноферментного анализа «Sanofi». Оптическую плотность (ОП) измеряли при длине волны 492 нм. Нулевой уровень ("бланк") задавали по лунке с субстрат-индикаторным раствором. Для каждого разведения антигена определяли разницу между средними значениями оптической плотности положительной и отрицательной контрольной сыворотки (ОПк+ - ОПк-). В качестве рабочего выбирали разведение, которое обеспечивало максимальное значение показателя ОПк+ -ОПк- при среднем значении ОП контроля конъюгата не выше 0,15 и значении ОПк- не выше 0,2.
После определения рабочего сенсибилизирующего разведения антигена для дальнейших исследований проводили его сорбцию по методу, описанному ранее, с той лишь разницей, что во все лунки планшета вносили по 100 мкл антигена в его рабочем разведении.
Изучение фосфолипидного состава природного видоспецифического антигена С trachomatis
Изучение фосфолипидного состава природного видоспецифического хламидииного антигена проводили в соответствии с методическими рекомендациями Kates (1972) [174] на базе лаборатории биохимии микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.
В качестве препаратов сравнения использовали контрольный антиген, выделенный из интактных желточных мешков куриных эмбрионов, родоспецифический антиген для ИФА «Хламисен» и антиген, приготовленный по методу H.D. Caldwell из овокультуры С. trachomatis.
При определении состава фосфолипидов методом одномерной тонкослойной хроматографии на пластинках «Silufol» в системе растворителей хлороформ-метанол-вода при соотношении 65:25:4 выявлены различные фосфолипидные фракции, представленные на рис. 4.
Из данных, представленных на рис. 4 и в табл. 8, видно, что антиген, приготовленный по модифицированному методу H.D. Caldwell, содержит в своем составе 3 фосфолипидные фракции, представленные фосфатидилинозитом, фосфатидилсерином и минорной фосфатидилэтаноламина. Фракция фосфатидилэтаноламина встречается во всех хламидийных антигенах, но определяется также и в составе контрольного антигена, из чего можно сделать вывод, что указанный фосфолипид, скорее всего, содержится и в хламидийных клетках, и в тканях куриных эмбрионов. Причем следует отметить, что в видоспецифическом хламидийном антигене эта фракция регистрируется в следовом количестве, что подтверждает высокую степень очистки препарата.
Определение содержания редуцирующих Сахаров в составе природного видоспецифического антигена С. trachomatis проводили на базе Центра инструментальных методов исследования Биологического центра РАН, (Пущино, Московская обл.) по методу, изложенному в главе 2. В качестве антигенов сравнения использовали родоспецифический хламидийный антиген («Хламисен»), а также контрольный антиген, полученный из интактных желточных мешков куриных эмбрионов. Данные о содержании редуцирующих Сахаров в исследуемых антигенах представлены в табл. 9.
Из данных представленных в табл. 9 видно, что концентрация редуцирующих Сахаров в видоспецифическом антигене более, чем в 80 раз меньше, концентрации Сахаров в родоспецифическом хламидийном антигене. Это свидетельствует в пользу разработанного нами метода выделения видоспецифического антигена, так как известно, что родоспецифическая активность хламидийных антигенов связана, в основном, липополисахаридом и, следовательно, видоспецифический антиген С. trachomatis должен быть максимально очищен от углеводов. Помимо этого, наблюдается большое сходство в качественном и количественном составе Сахаров контрольного и родоспецифического антигенов. По-видимому, редуцирующие сахара, обнаруженные в составе родоспецифического антигена, происходят как из компонентов хламидийной оболочки, так и из компонентов среды культивирования хламидий - желточных мешков. В отличие от родоспецифического антигена, качественный и количественный состав редуцирующих Сахаров видоспецифического антигена резко отличается от такового у контрольного антигена. В частности, видоспецифический антиген содержит галактозу, которая не определяется ни в контрольном, ни в родоспецифическом антигенах. Для объяснения указанного обстоятельства можно предположить, что, во-первых, видоспецифический антиген лучше очищен от компонентов среды культивирования по сравнению с родоспецифическим антигеном и, во-вторых, тем, что галактоза, обнаруженная в составе видоспецифического антигена, является компонентом хламидийной клетки.
Таким образом, данные исследования углеводного состава видоспецифического антигена С. trachomatis показывают, что разработанный нами метод обеспечивает получение антигена, очищенного от углеводов, которые происходят как из среды культивирования хламидий, так и из компонентов хламидийной оболочки.
Количественное определение аминокислот в видоспецифическом антигене, полученном из овокультуры С. trachomatis, также проводили на базе Центра инструментальных методов исследования Биологического центра РАН (Пущино, Московская обл.) с помощью ионообменной хроматографии по методу, изложенному в главе 2. В качестве антигена сравнения использовали контрольный антиген, приготовленный из неинфицированных куриных эмбрионов. Результаты определения количественного содержания аминокислот в видоспецифическом антигене представлены в табл. 10.
Изучение специфичности разрабатываемой иммуноферментной тест-системы
Разработав альтернативный вариант природного видоспецифического антигена С. trachomatis и экспериментально убедившись в возможности сенсибилизации им полистироловых планшетов для ИФА, мы приступили к конструированию на его основе и всестороннему изучению ИФТС для определения видоспецифических антител к С. trachomatis.
На первых этапах этой работы в состав ИФТС был включен традиционный набор компонентов, используемых при проведении ИФА: сорбент - планшет, сенсибилизированный природным видоспецифическим антигеном С. trachomatis; контрольные сыворотки - положительная и отрицательная; конъюгат - моноклональные антитела против IgG человека, меченые пероксидазой хрена; хромоген - ортофенилендиамин; буферные растворы для разведения компонентов реакции и промывания планшета, останавливающий раствор. О наличии или отсутствии специфических антител в исследуемых сыворотках судили на основании показателя критической оптической плотности (ОПкрит), значение которого на данном этапе работы вычисляли по формуле: ОПкрит = ОПк- + 0,2 где: ОПкрит - критическая оптическая плотность, ОПк- - оптическая плотность отрицательной контрольной сыворотки.
В случае, если значение оптической плотности исследуемой сыворотки (ОПис) было больше или равнялось ОПкрит, то ее считали положительной, если значение оптической плотности исследуемой сыворотки было меньше ОПкрит, то исследуемую сыворотку считали отрицательной.
В ходе дальнейшей работы предстояло:
1. Изучить специфичность тест-системы путем исследования сывороток людей, содержащих и не содержащих антитела к С. trachomatis, в конструируемой ИФТС и в аналогичных коммерческих тест - системах.
2. Оценить чувствительность и специфичность ИФТС с помощью стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих видоспецифические антитела к С. trachomatis.
3. Разработать критерии полуколичественной оценки активности исследуемых сывороток на основании результатов параллельного исследования сывороток в РНИФ и в разработанной ИФТС.
4. Оценить диагностическую эффективность разработанной ИФТС при исследовании сывороток людей.
С целью изучения специфичности разрабатываемой видоспецифической ИФТС были проведены параллельные исследования сывороток людей на указанной тест-системе и в других хламидийных ИФТС: в родоспецифической тест-системе «ХламИм-G» (производства Пермского НПО Биомед) и в рекомбинантной ИФТС, приготовленной нами на основе видоспецифического рекомбинантного антигена С. trachomatis. Образцы сывороток получали от больных, находящихся на лечении в медицинских учреждениях г. Перми.
Всего в видоспецифической и рекомбинантной тест-системах было параллельно исследовано 206 сывороток, на видоспецифической и родоспецифической - 416 сывороток. Постановку ИФА сопровождали положительным и отрицательным контролями, при этом во всех тест-системах использовали одни и те же образцы положительной и отрицательной контрольных сывороток. Результаты исследования сывороток, полученные при использовании различных тест-систем, оценивались на основании показателя ОПкрит.
![Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс]](/i/i/4289/212277.png "Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс] Тучков Игорь Витальевич")