Содержание к диссертации
Введение
Глава1. Обзор литературы .12
1.1.Биологическая характеристика хламидий 12
1.2. Таксономическое положение хламидий 13
1.3. Генетические особенности C.trachomatis .14
1.4. Жизненный цикл хламидий 16
1.4.1. Образование хламидийных включений 18
1.4.2. Секретируемые факторыхламидий .23
1.5. Протеасомный белок C.trachomatis 28
1.5.1 Субстратная специфичность белка CPAF 28
1.5.2. Структурная характеристика белка CPAF 31
1.5.3. Секреция белка CPAF через Sec-зависимый путь .35
1.6. Ингибирование белка CPAF .39
1.7. Разработка антихламидийных препаратов на основе подавления протеасомного белка .42
Заключение 44
Глава 2. Материалы и методы 46
2.1. Материалы 46
2.1.1. Штаммы, клеточные линии и плазмидные вектора .46
2.1.2. Реактивы для синтеза и модификации ДНК .46
2.1.3. Общелабораторные реагенты .46
2.1.4. Питательные среды .47
2.1.5.Буферные растворы .48
2.1.6. Лабораторное оборудование 49
2.1.7. Предоставляемые материалы .50
2.2. Методы .50
2.2.1. Культивирование микроорганизмов 50
2.2.2. Выделение плазмидной ДНК 51
2.2.3.Постановка полимеразной цепной реакции .51
2.2.3.1. Метод горизонтального электрофореза в агарозном геле 53
2.2.4. Молекулярное клонирование гена cpaf в Escherichia coli 53
2.2.5. Делетирование сигнальной последовательности в гене cpaf 55
2.2.6. Мутагенез гена Cpaf 54
2.2.7. Трансформация клеток Escherichia coli .55
2.2.7.1. Выделение и очистка белка из культуры E.coli 56
2.2.8. Трансформация клеток S. cerevisiae .57
2.2.8. 1. Выделение белка CPAF из культуры S. cerevisiae .58
2.2.9. Определение токсического фенотипа у дрожжей «drop test» методом .58
2.2.10. Получение моноспецифичной сыворотки к рекомбинантному белку CPAF 59
2.2.11. Электрофорез в SDS-полиакриламидном геле 59
2.2.11.1. Окрашивание SDS-полиакриламидного геля серебром 59
2.2.12. Определение ферментативной активности белка CPAF .60
2.2. 13. Выбор мишеней и поиск их ингибиторов методами компьютерного моделирования .62
2.2.14. Определение цитотоксического эффекта химических соединений методом окрашивания клеток метиленовым синим 63
2.2.15. Определение цитотоксического эффекта химических соединений в МТТ-тесте 64
2.2.16. Метод суспензионного заражения эукариотических клеток 64
2.2.17. Определение влияния химических соединений на внутриклеточное размножение хламидий .65
2.2.18. Определение ингибирующей активности низкомолекулярных соединений методом иммуноблоттинга .66
2.2.19. Статистическая обработка результатов 67
Глава 3. Результаты собственных исследований 68
3.1. Клонирование гена cpaf в штаммы E. coli и выделение активного белка CPAF .68
3.2. Получение моноспецифичной сыворотки к рекомбинантному белку CPAF 74
3.3. Получение рекомбинантного белка CPAF в биологически активной форме 74
3.4. Оценка ферментативной активности белка CPAF .77
3.5. Клонирование гена cpaf в Saccharomyces cerevisiae 81
3.5.1. Изучение токсического эффекта CPAF с использованием S.cerevisiae .83
3.5.2. Получение вариантов дрожжей с повышенной устойчивостью к действию CPAF .85
3.6. Выбор химических соединений – ингибиторов CPAF на основе виртуального скрининга 88
3.6.1. Изучение токсичности химических соединений на основе стандартных токсикологических тестов 89
3.6.2. Изучение влияния химических соединений на развитие хламидийной инфекции в культуре клеток .94
3.6.3. Изучение влияния химических соединений на протеолитическую активность белка CPAF .98
3.7. Выбор новых низкомолекулярных соединений, являющихся структурными аналогами выбранных «лидерных» химических соединений 101
3.7.1. Оценка токсичности для эукариотических клеток новых синтезированных соединений 106
3.7.2.Изучение влияния новых синтезированных соединений на внутриклеточное развитие хламидий в культуре клеток 108
3.7.3. Оценка влияния отобранных низкомолекулярных соединений на протеолитическую активность белка CPAF 111
Глава 4. Обсуждение результатов .113
ВЫВОДЫ .123
Список использованной литературы .124
- Таксономическое положение хламидий
- Штаммы, клеточные линии и плазмидные вектора
- Получение моноспецифичной сыворотки к рекомбинантному белку CPAF
- Выбор новых низкомолекулярных соединений, являющихся структурными аналогами выбранных «лидерных» химических соединений
Введение к работе
Актуальность работы.
Одним из самых распространенных возбудителей инфекций, передающихся половым путем, является Chlamydia trachomatis (Malhotra M., Sood S., et al., 2013). Хламидии вызывают широкий спектр заболеваний, связанных с тяжелыми осложнениями, трахому, урогенитальный хламидиоз, бесплодие, патологию беременности, артриты. В настоящее время для лечения хламидиоза применяют этиотропную терапию, основанную на чувствительности хламидий к некоторым антибиотикам. Однако лечение хламидийных инфекций, особенно при хроническом течении, по-прежнему остается нерешенной проблемой, что во многом обусловлено низкой чувствительностью внутриклеточно персистирующих хламидий к используемым антибиотикам (Шипицына Е.В., Савичева А.М., и др.,2004). Отсутствие эффективных и безопасных препаратов для лечения разных форм хламидийных инфекций определяет необходимость разработки нового подхода для поиска лекарственных средств, основанного на выявлении принципиально новых мишеней у бактериальных патогенов.
Основная стратегия внутриклеточного выживания патогена направлена на инактивацию защитных механизмов хозяина и модуляцию клеточных сигнальных путей, ответственных за контроль развития инфекции. При разработке новых антибактериальных препаратов, эффективных в отношении внутриклеточных патогенов, в том числе и хламидий, перспективными мишенями могут служить ключевые бактериальные молекулы, подавление активности которых позволит «разоружить» патоген, и в дальнейшем он может быть элиминирован иммунной системой организма (Зигангирова Н.А., Федина Е.Д., и др., 2009). Поэтому действие новых препаратов должно быть направлено на ингибирование специфических механизмов, которые способствуют развитию инфекции и принципиально важны для подавления защитных механизмов хозяина.
Реализация такого подхода возможна на основе технологии «мишень-направленного поиска», предусматривающая полный цикл разработки новых кандидатных препаратов для антимикробной терапии. Этот цикл включает в себя: выбор биомишени, виртуальный скрининг библиотек химических соединений для поиска потенциальных ингибиторов выбранной мишени, синтез и химическую оптимизацию низкомолекулярных соединений, создание бесклеточных и клеточных систем скрининга, экспериментальный скрининг, использование экспериментальных моделей инфекции in vitro и in vivo. Применение такой технологии позволяет существенно сократить время разработки нового препарата с предсказанным механизмом действия.
Ведущую роль в патогенезе хламидийной инфекции играет белок CPAF (Chlamydial Protease/proteasome-like Activity Factor), подавляющий множественные сигнальные пути клетки-хозяина, и благодаря этому обеспечивающий возможность установления инфекции и длительного выживания патогена в организме хозяина. Белок CPAF расщепляет многие транскрипционные факторы (Zhong G., Liu L.,et al., 2000), проапоптозные белки (Dong F., Pirbhai M. et al., 2005), и компоненты системы промежуточных филаментов клетки-хозяина (Kumar Y., Valdivia R.H., et al., 2008), препятствуя презентации антигенов хламидий на поверхности зараженной клетки, блокируя индукцию апоптоза хозяйской клетки и способствуя росту хламидийных включений. Кроме того, протеасомный белок CPAF имеет не только эукариотические мишени, но также способен расщеплять и некоторые белки самого патогена, выполняя функцию регуляторного белка и координируя активность хламидийных белков (Jorgensen I., Bednar M.M., et al., 2011). Однако до сих пор не проводились исследования, направленные на изучение биологической активности белка и ее взаимосвязи с протеолитической активностью.
Таким образом, белок CPAF является ключевым фактором патогенности, что делает его перспективной бактериальной мишенью для создания нового антихламидийного препарата.
Цель работы: характеристика функциональной активности фактора патогенности хламидий белка CPAF и поиск специфических ингибиторов протеолитической активности белка.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
-
Клонировать ген cpaf в E. coli, оптимизировать условия его экспрессии и разработать схему получения белка в биологически активной форме.
-
Осуществить генетический анализ цитотоксического действия CPAF с использованием дрожжей S. cerevisiae.
-
Разработать системы тестирования биологической активности белка CPAF in vitro, необходимые для скрининга низкомолекулярных химических соединений.
-
Провести экспериментальное тестирование выбранных на основе компьютерного моделирования потенциальных ингибиторов белка CPAF c целью получения эффективного низкомолекулярного ингибитора хламидийной протеазы.
Научная новизна работы.
Впервые созданы генетические конструкции, позволяющие целенаправленно получать препаративные количества очищенного белка CPAF как в денатурированной, высокоиммуногенной, так и в растворимой, ферментативно-активной формах. Впервые создана биологическая модель с использованием дрожжей S. cerevisiae, пригодная для изучения генетических особенностей и механизма цитотоксического действия белка CPAF. Показана высокая токсичность протеиназы хламидий на дрожжевых клеток.
Впервые обнаружены ингибиторы протеолитической активности белка CPAF среди низкомолекулярных соединений класса индол-3-ил-глиоксиламидов и 6-оксо-1,6-дигидро-пиримидинов.
Практическое значение работы. Разработаны технологии получения высокоочищенного белка CPAF в препаративных количествах. Очищенный белок может быть использован для приготовления моноспецифических сывороток и разработки на их основе диагностических тест-систем. Разработана модель для исследования токсических факторов бактериального происхождения с использованием дрожжей S. cerevisiae.
Отобраны низкомолекулярные соединения, подавляющие хламидийную инфекцию в культуре клеток и блокирующие протеолитическую активность белка CPAF in vitro. Данные ингибиторы могут послужить прототипом лекарственного препарата против инфекций, вызываемых C. trachomatis.
По результатам работы подготовлены методические рекомендации «Определение токсичности факторов патогенности бактерий с использованием дрожжей Saccharomyces cerevisiae», утвержденные советом по внедрению научных достижений в практику ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России 25 января 2013 г, протокол № 23.
Основные положения, выносимые на защиту. Методами генной инженерии получен высокоиммуногенный и ферментативно активный рекомбинантный белок CPAF, фактор патогенности C.trachomatis.
Впервые создана экспрессирующая рекомбинантный белок CPAF модель на основе его клонирования в S. cerevisiae, позволяющая оценивать биологическую активность хламидийной протеазы в отношении эукариотических клеток.
Получены два ранее неизвестных ингибитора протеазы C.trachomatis, подавляющие внутриклеточное размножение патогена in vitro.
Выбранные ингибиторы - низкомолекулярные соединения, нетоксичные для эукариотических клеток, блокирующие протеолитическую активность белка CPAF в отношении эукариотических мишеней и подавляющие хламидийную пролиферацию, могут рассматриваться как перспективные соединения для разработки лекарственного средства против инфекций, вызываемых C. trachomatis.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на 22-ом съезде Европейского Общества клинической микробиологии и инфекционных заболеваний (Лондон, 2012), на Седьмом заседании Европейского общества исследования хламидиоза (Амстердам, 2012), международной конференции «Биология – наука XXI века» (Москва, 2012), на Ежегодном конгрессе британского общества иммунологов (Ливерпуль, 2013).
Апробация работы состоялась 19 декабря 2013 года на научной конференции отдела медицинской микробиологии и ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 141 страницах машинописного текста и включает в себя следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы и список использованной литературы, содержащий ссылки на 155 источников. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 32 рисунками.
Таксономическое положение хламидий
Ранее систематика хламидий основывалась на фенотипических и серологических критериях. Но в 1999 году Кэрин Эверетт предложила новую классификацию, основанную на филогенетическом анализе генов 16S и 23S рРНК, а также на генетических и фенотипических характеристиках хламидий (Everett K.D.,Bush R.M.,1999). На 4-м Европейском конгрессе «Хламидия-2000» была принята новая международная классификация хламидий. Согласно предложенной классификации, порядок Chlamydiales включает 4 отдельные семейства: Chlamydiaceae, а также представленные единичными видами семейства Simkaniaceae, Parachlamydiaceae и Waddliaceae (рис.1). Согласно этой классификации, семейство Chlamydiaceae предложено разделять на два рода: род Chlamydia и род Chlamydophila. Род Chlamydia представленный видами C.trachomatis, C.muridarum и C.suis. Важнейшей фенотипической особенностью представителей этого рода является способность накапливать гликоген во включениях. При этом разные штаммы рода Chlamydia могут образовывать различные по морфологии включения и отличаются по уровню резистентности к сульфадиазину (Garett A.J.,1975). Изоляты C.trachomatis дифференцируются в серовары по серологическому ответу на основной белок внешней мембраны MOMP, который кодируетя геном оmpA. Cеровары попадают в биологические группы, ассоциированные с трахомой (А, В, Ва, С), с урогенитальной хламидийной инфекцией (D, Da, E, F, G, Ga, H, I, Ia, J, K) и с венерической лимфогранулемой (L1-L3) (Schachter J., 1999; Stock I., Henrichfreise B., 2012). Исследования сероваров хламидий позволили ученым выявить частичную корреляцию между определенным сероваром и различным клиническим течением хламидийной инфекции (Brunelle G.W., Sensabough G.F., 2006). Род Chlamydophila включает в себя виды C.pneumoniae, C.psittaci, C.pecorum, C.abortus, C.felis, C.caviae. Вид C.pneumoniae включает биовары TWAR, вызывающий пневмонию, ОРЗ, атеросклероз, саркоидоз, бронхиальную астму, а также биовары Koala и Equine (Kutlin A., Roblin P.M., et al., 2007).
Геном C.trachomatis был расшифрован группой ученых под руководством Stephens в 1998 году (Stephens R.S., Kalman S., 1998). Так было установлено, что геном хламидий является относительно небольшим по сравнению с другими бактериями и составляет не более 22% генома кишечной палочки (Плахова К.И., Кожушная О.С., 2012). Последовательность генома C.trachomatis состоит из 1 042 519 пар оснований хромосомы (58,7% А+Т) и 7493 пар оснований плазмиды (Stephens R.S., Kalman S., 1998). При этом геном хламидий кодирует 318 Chlamydia-специфичных открытых рамок считывания (ОРС), а также ОРС, гомологичные другим бактериям, но для которых функции до сих пор не установлены. Внехромосомные факторы наследственности впервые были расшифрованы в 1988 году Comanducci и соавторами (Comanducci M., Ricci S., 1988). Плазмида кодирует 8 открытых рамок считывания (Thomas N. S., Clarke I. N., 1994). Предполагается, что некоторые гены, расположенные на плазмиде, обладают транскрипционной активностью и регулируют экспрессию хламидийных генов, а также могут кодировать факторы вирулентности хламидий (Carlson J.H., Whitmire W.M., 2008). Анализ генома позволил выделить 894 гена, которые кодируют различные белки. Сходство с ранее исследованными белками других бактерий помогло определить функциональное назначение 604 (68%) кодируемых белков. Так, 35 (4%) белков были схожи с белками, имеющимися у других бактерий. Остальные 255 белков (28%) последовательности белков не давали сходства с аминокислотными последовательностями, хранящимися в GeneBank. Кластеризация по сходным последовательностям показала, что 256 (29%) хламидийных белков в пределах одного генома группируются в 58 семейств (Stephens R.S., Kalman S., 1998). Исследования генетического материала хламидий показали, что они имеют все потенциальные возможности систем репарации ДНК и рекомбинации. Однако ген, кодирующий MutH, необходимый для Dam-направленной репарации неспаренных оснований, так и не был найден. Множество генов, кодирующих ферменты биосинтеза жирных кислот и фосфолипидов, подтверждают тот факт, что Chlamydiae синтезируют жирные кислоты, фосфатидилэтаноламин и фосфатидилглицерол de novo (Wylie J.L., Hatch G.M., 1997). Также, на основании изучения хламидийного генома, были найдены гены, отвечающие за неполный биосинтез некоторых аминокислот, которые синтезируются не de novo C.trachomatis. Следовательно, существуют другие пути получения аминокислот этим внутриклеточным патогеном. Например, известно, что две аминотрансферазы (AspC, TyrB) и сериновая гидроксиметилтрансфераза (GlyA) могут обеспечивать перенос групп для аспартата, фенилаланина, тирозина и глицина, но они не способны образовывать непосредственного предшественника субстратов. У хламидий также имеется оперон биосинтеза триптофана (trpA, trpB, trpR), однако гены trpD и trpE отсутствуют. Возможно, хламидии продуцируют функциональные эквиваленты TrpD и TrpE, которые не были обнаружены в результаете первичного исследования (Stephens R.S., Kalman S., 1998). Анализ генома показал, что гликолитический цикл редуцирован, поскольку не обнаружены некоторые ферменты пентофосфатного и гексозофосфатного путей. Некоторые особенности генома хламидий так и не нашли своего объяснения в связи с тем, что патоген в ходе приспособления к внутриклеточному паразитированию выработал уникальные механизмы биосинтеза. Так, например, у хламидий присутствуют все гены, кодирующие аминоацил-тРНК-синтетазы, за исключением ферментов для аспарагина и глутамина. У хламидий есть оперон, кодирующий три субъединицы глутамил-тРНК амидотрансферазы, который консервативен среди всех бактерий, за исключением E.coli и H. infuenzae. У патогена были обнаружены гены двух одинаковых рибосомальных РНК, полный набор рибосомальных белков, консервативные гены факторов трансляции, ферменты для модификации РНК. Кроме того, следует отметить, что у хламидий не был обнаружен высоконсервативный ген, кодирующий белок FtsZ, который играет ключевую роль в делении клеток бактерий (Stephens R.S., Kalman S., 1998).
Штаммы, клеточные линии и плазмидные вектора
В диссертационной работе были использованы: референс-штамм Chlamydia traсhomatis биовара лимфогранулемы (LGV) серовар L2 штамм Bu 434 (АТСС VR 902B), Escherichia сoli DH10B, E. сoli BL21 (DE3), (Life Technologies, США), Saccharomyces cerevisiae MH272, (Stratagene, США).
Для моделирования острой хламидийной инфекции была использована клеточная линия McCoy, представляющая собой гибридные клеточные линии из человеческих синовиальных клеток и мышиных фибробластов, а также чувствительная к хламидиям культура клеток HeLa, изначально выделенная из раковой опухоли шейки матки, и поэтому способная делиться бесконечное число раз, в отличие от обычных клеток.
Амфотерицин (Синтез, Россия); гентамицин (Дальхимфарм, Россия); метиленовый синий (Диаэм, Россия); MTT (Sigma, Италия), изопропил--D-тиогалактопиранозид (ИПТГ) (Sigma, Италия); ампициллин (AppliChem, Германия); канамицин (AppliChem, Германия); глюкоза (Panreac, Испания); галактоза (Fluka, Германия); агар-агар (AppliChem, Германия); L-лейцин (Sigma, Италия), L-триптофан (Sigma, Италия), L-гистидин (Sigma, Италия), урацил (Sigma, Италия), аденин (Sigma, Италия); дрожжевой экстракт (Difco, США); бакто-пептон (Difco, США); ацетат лития LiAc (Panreac, Испания); хлорид калия KCl (Panreac, Испания); хлорид магния МgCl2 (Panreac, Испания); хлорид марганца MnCl2 (Panreac, Испания); дигидрофосфат натрия ( Panreac, Испания); хлорид натрия NaCl (Panreac, Испания); Tris (Trizma base, Sigma, Италия); ЭДТА двунатриевая соль (Serva, Герания); додецилсульфат натрия (SDS) (Sigma, Италия); глицерин (Fluka, Германия); глицин (GE Healthcare, Германия); бромфеноловый синий (Panreac, Испания); - меркаптоэтанол (Serva, Германия); фенилметилсульфонил флуорид (PMSF, Sigma, Италия); дитиотреитол DTT (Fermentas, Литва); HEPES (AppliChem, Германия); метанол; этанол; ацетон ; гидроксид натрия NaOH (Panreac, Испания); фосфоенолпируват (Sigma, Италия); пируваткиназа (Sigma, Италия); сорбитол (Sigma, Италия); мочевина (Panreac, Испания); трихлоруксусная кислота (ТХУ, AppliChem, Германия); бромистый этидий (Applichem, Германия); вода ASC (Panreac, Испания); полиэтиленгликоль PEG 4000 (Fluka, Германия); зимолиаза (AMS Biotechnology, Англия); имидазол (Panreac, Испания); восстановленный глутатион (AppliChem, Германия); уксусная кислота; бис-акриламид (AppliChem, Германия); персульфат аммония (AppliChem, Германия); N,N,N-,N-тетраметилэтилендиамин (TEMED, Serva, Германия); Tween-20 (Bio-Rad, США); агароза (Sigma, Италия); сорбент Glutation – Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, Германия); сорбент Nickel - Sepharose Fast Flow ( GE Healthcare, Германия); краситель Ponceau S (Carl Roth, Германия); сухое обезжиренное молоко (Carl Roth, Германия). 2.1.4. Питательные среды
В работе с клеточными линиями HеLа и McCoy использовали питательную среду Dulbecco modified Eagle s medium (DMEM) (Пан Эко, Россия). Клеточные линии культивировались в среде культивирования, в состав которой входил DMEM с 10% фетальной сывороткой. Транспортная среда для заражения клеток содержала: DMEM с 5% фетальной сывороткой, 25 мМ раствор глюкозы, 5 мкг/мл амфотерицина и 4 мкг/мл гентамицина.
В работе с бактериальной экспрессирующей системой E. coli брали среду Luria-Bertani (LB) (Difco, США). Для приготовления агаризованной LB среды в жидкую питательную LB среду вносили 2% агар. Кроме того, в питательную среду LB вносили антибиотики: канамицин в концентрации 50 мкг/мл и ампицилин в концентрации 200 мкг/мл. Питательная среда, используемая для культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae, содержала 0.67% Yeast Nitrogen Base (Difco, США). К питательной среде при работе с дрожжевой системой вносили: L-лейцин 40 мг/мл, L-триптофан 40 мг/мл, L-гистидин 40 мг/мл, урацил 2мг/мл, аденин 5 мг/мл (Sigma, Италия), а также 2% глюкозу/галактозу (SD/SGal).
В ходе данной работы использовались: автоматические микропипетки «Eppendorf» (Германия), СО2–инкубатор «Sanyo» (Япония), термостаты на 30С и 37С «New Brunswick Scientific» (США), термостат 5320 «Eppendorf» (Германия), термостат Гном «ДНК-технология» (Россия), инкубатор-шейкер Innova 40 «New Brunswick Scientific» (США), шейкер Rotamax 120 «Heidolph» (Германия), ламинарный бокс «Lan system» (Австралия), ламинарный бокс ЛШ-1 «Biocom» (Россия), центрифуга «Hettich Rotanta 460R» (Германия), центрифуги «Hermle, Jouan» (Германия), центрифуга с охлаждением «Hermle» (Германия), центрифуга MiniSpin «Eppendorf» (Германия), центрифуга-вортекс СМ-70М «ELMI» (Латвия), вортекс Real top «Heidolph» (Германия), шуттель-аппарат Multi reax «Heidolph» (Германия), шуттель-аппарат Vibramax 110 «Heidolph» (Германия), флуориметр Muktiscan EX «Thermo Scientific» (Германия), флуориметр VICTOR2 «PerkinElmer» (США), спектрофотометр Genesys 10 Uv «Thermo Scientific» (Германия), световой микроскоп «Nikon eclipse 50i» (Япония), камера для постановки электрофореза PowerPac Basic «Bio-Rad» (США), ДНК-амплификатор Mastercycler «Eppendorf» (Германия), спектрофотометры NanoVue Plus «GE Healthcare» (Германия), электрофорезные ячейки серии Sub Cell «Bio-Rad» (США), фотокамера для съемки гелей «Vilber Lourmat» (Франция), нитроцеллюлозная мембрана «Whatman» (Англия), прибор для переноса белков Amersham Biosciences TE 70 PWR «GE Healthcare» (Германия), трансиллюминатор «Vilber lourmat» (Франция), фотокамера для детекции белка при постановки Вестерн-блот анализа «GE Healthcare» (Германия), водяная баня «Thermo scientific» (Германия), электропоратор 2510 «Eppendorf» (Германия), УЗ прибор «Labsonic, Sartorius» (Германия), гомогенизатор высокого давления French Press «Heinemann» (Германия), магнитная мешалка «мм-5» (Россия), аналитические весы Pioneer и Adventurer «OHAUS» (Китай), автоклав «Tuttnauer 2540 MК» (Израиль), аквадистиллятор «ДЭ-25» (Россия), сухожарный шкаф «Apparatebau» (Германия), генератор льда «Scotsman» (Италия), хроматографическая система FPLC AKTA «GE Healthcare» (Германия), колонка HisTrap HP «GE Healthcare» (Германия), оборудование для сушки геля «Bio-Rad Gel Dryer» (США), сканер для радиоактивных гелей Storm 820 «Molecular Dynamics» (Австриия), хемилюминисцентный детектор «Fujifilm» (Германия), холодильник на -70С Ultra low «Sanyo» (Япония), холодильники «Sanyo» (Япония) и «Атлант» (Россия), персональный компьютер.
Олигонуклеотиды были синтезированы фирмой «Литех» (Москва). Секвенирование выполнялось на секвенаторе ABI Prism 3100 Avant (ЦКП «Геном», ИМБ им. В.А.Энгельгардта РАН).
Бактериальные штаммы E. coli выращивали в жидкой или агаризованной среде LB (Difco, США) с добавлением селективного антибиотика в течение ночи при температуре 37С. Рекомбинантные штаммы, содержащие плазмиды pUC19 и pGEX-4T1, культивировали в присутствии ампицилина (200 мкг/мл). Штаммы E. coli, содержащие плазмиду pET28a и pET28c, культивировали в присутствии канамицина (50 мкг/мл). Для индукции экспрессии гена в культуру вносили 0,2 мМ ИПТГ.
Эукариотические штаммы S. cerevisiae культивировали в жидкой питательной SD среде с добавлением соответствующих компонентов (гистидин, аденин, лейцин, триптофан, урацил) в течение ночи при температуре 30оС с шутелированием. Кроме того, дрожжевые штаммы выращивали на агаризованной SD среде в течение 48-72 ч в термостате при температуре 30оС. Все среды для культивирования микроорганизмов перед работой стерилизовались автоклавированием при температуре 121С в течение 25 мин.
Получение моноспецифичной сыворотки к рекомбинантному белку CPAF
Получение очищенного CPAF в препаративных количествах позволило приступить к приготовлению моноспецифичной сыворотки, необходимой для последующих исследований по разработке методики тестирования ферментативной активности. В процессе получения мышиной сыворотки к исследуемому белку была произведена трехкратная иммунизации животных в дозе 50 мкг/животное. Полученная сыворотка реагировала с гомологичным белком в разведении 1:50000 (рис. 15А). Получение кроличьей гипериммунной сыворотки к белку CPAF проводили путем пятикратных инъекций препарата в подмышечные, паховые лимфатические узлы и в холку в объеме 0,2 мл в каждую точку с интервалом 2 недели. Все инъекции проводились в смеси, содержащей 100 мкг белка в адъюванте Фрейнда. Выделенная сыворотка реагировала с белком CPAF в разведении 1:250000 и выше (рис. 16Б).
Исследование активности мышиной сыворотки с очищенным белком CPAF (p712) методом вестерн блоттинг. А. Реакция с мышиной сывороткой. Представлены разведения сыворотки 1:50000, 1:100000, 1:200000, соответственно. Б. Реакция с кроличьей сывороткой. Представлены разведения сыворотки 1:500000, 1:100000, 1:250000.
Для последующей разработки систем анализа ингибирующей активности низкомолекулярных соединения необходимо получить белок CPAF в растворимой форме. Первоначально мы сделали попытку осуществить ренатурацию белков из телец включения методом иммобилизации на сорбенте с последующей заменой мочевины на TBS. Однако попытки осуществить перевод исследуемого белка в водорастворимое состояние данным методом были безуспешны.
В связи с этим следующим этапом работы было клонирование гена cpaf в одной рамке считывания с последовательностью глютатион-S-трансферазы в плазмидном векторе серии pGEX-4T. По данным литературы известно, что особенностями подобных векторов является преимущественное водорастворимое состояние получаемого рекомбинантного белка, а также его хорошая продукция штаммами E. coli. Для этого кодирующая последовательность cpaf была переклонирована в вектор pUC19 по сайтам рестрикции BamHI/SalI, а затем – в вектор pGEX-4T1 по сайтам SmaI/XhoI. В результате была получена плазмида р750, содержащая ген глютатион-С-трансферазы в одной рамке считывания с геном «зрелого» CPAF (рис. 17).
Дальнейшее выращивание штамма-продуцента и очистка белка на колонке с восстановленным глютатионом позволили выделить белок CPAF в растворимой форме (рис.17 А). Изучение полученного белка методами электрофореза и иммуноблотинга выявило компоненты с молекулярными массами 28 кД, 40 кД, 55 кД и 110 кД, где белок на уровне 28 кД представляет собой отщепленную от гибридного белка молекулу глютатион-S-трансферазы. Белки размером 40 кД, 55 кД и 110 кД содержат в своем составе как фрагменты глютатион-S-трансферазы, так и фрагменты CPAF (рис.18 Б, В).
А. Анализ продукции белка GST-CPAF, выделенного из «растворимой фракции» в полиакриламидном геле. Окраска нитратом серебра. Дорожка 1, маркеры молекулярных масс; дорожка 2, очищенный CPAF Б. Вестерн блоттинг препаратов CPAF, полученных с использованием конструкций p712 (дорожка 1) и р750 (дорожка 2). Реакция с сывороткой к глютатион-S-трансферазе. В. Вестерн блоттинг препаратов CPAF, полученных с использованием конструкций p712 (дорожка 1) и р750 (дорожка 2). Реакция с мышиной сывороткой к белку CPAF. 3.4. Оценка ферментативной активности белка CPAF
Для изучения протеолитической активности полученного белка CPAF нами были использованы метод вестерн-блоттинг и FRET-анализ. Исследуемый белок CPAF расщепляет достаточно широкий спектр белков. Поэтому в качестве мишеней был выбран транскрипционный фактор RFX5, а также белок промежуточных филаментов - виментин. Белок RFX5 содержится в ядерном экстракте эукариотических клеток и определяется специфической комерчески доступной антисывороткой в разведении 1:1000 полосой с молекулярной массой около 75кД. Для определения оптимального времени инкубации реакционной смеси были выбраны временные точки: 0, 30, 60 и 120 минут. Реакционные смеси состояли из TBS, 11 мкг ядерного экстракта и 4 мкг белка CPAF. Анализ расщепления RFX5 белком CPAF (р750) методом вестерн-блоттинг. В дальнейших исследованиях количество ядерного экстракта было уменьшено, поскольку специфичные анти-RFX5 антитела демонстрировали высокую чувствительность в методе и детектировали значительное количество антигена в смеси. На следующем этапе работы мы установили наименьшую концентрацию CPAF, проявляющую активность в отношении субстрата в наших условиях.
Фрагмент другого субстрата исследуемого белка, виментин, был синтезирован в виде короткого пептида (D-VK-F), содержащего на одном конце флуоресцентную метку, а на другом конце - гаситель флуоресценции. В норме гаситель предотвращает флуоресценцию. Но в результате реакции расщепления субстрата под действием активного белка метка и гаситель отделяются друг от друга и возникает флуоресцентный сигнал, который может быть определен с помощью флуориметра. В первоначальных исследованиях нами было установлено, что субстрат в концентрациях 1 и 5 мМ не растворялся в водных буферах, а кривая отношения флуоресценции пептида в концентрациях 0,2, 0,04 и 0,08 мМ к отрицательному контролю формировала плато значений. Поэтому для определения рабочей концентрации флуоресцентного пептида были выбраны следующие значения: 40, 8, 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 мкМ. В качестве протеиназы первоначально был использован коммерческий препарат протеиназы К. FRET-анализ проводили в формате 96-луночной плашки в объеме 100 мкл. В лунки плашки вносили различные разведения флуоресцентного пептида D-VK-F с протеиназой К или с тем же количеством воды. Далее плашки выдерживали в течение 1 часа при 37C и анализировали во флуориметре. По результатам исследования была определена рабочая концентрация пептида виментина - 8мкМ, – при которой детектировалась высокая флуоресценция (рис.21А).
А. Б. Рис.21. Флуоресцентный анализ реакции расщепления пептида D-VK-F. Уровень флуоресценции представлен как соотношение уровня флуоресценции в пробе к уровню флуоресценции нерасщепленного пептида. А. Зависимость флуоресценции от концентрации пептида D-VK-F в реакции с протеиназой К. Б. Зависимость флуоресценции от концентрации белка CPAF в реакционной смеси.
После успешного определения рабочей концентрации флуоресцентного пептида мы приступили к отработке условий реакции в присутствии в качестве протеолитического фактора фермента CPAF. Были приготовлены различные разведения очищенного белка CPAF и добавлены к раствору 0,008 мМ флуоресцентного пептида. В качестве отрицательного контроля была использована вода. Плашки инкубировались в течение 1 часа при 37C. По результатам проведенного FRET-анализа была отмечена высокая протеолитическая активность белка CPAF, который расщеплял субстрат в дозе 0,16 мкг и выше (рис.21Б).
Таким образом, нами были разработаны 2 метода для определения протеолитической активности CPAF – с использованием вестерн-блоттинга и с использованием FRET-анализа. Метод с использованием вестерн-блоттинга отличался высокой чувствительностью, тогда как FRET-анализ характеризовался простотой постановки и быстрым получением результата.
Выбор новых низкомолекулярных соединений, являющихся структурными аналогами выбранных «лидерных» химических соединений
На предшествующем этапе исследования нами были отобраны два ингибитора белка CPAF - химические соединения из разных классов: 2394809 и 0877783. Оба соединения характеризовались низкой токсичностью, подавляли хламидийную инфекцию в дозе 100 мкМ на 90% и ингибировали преолитическую активность белка-мишени CPAF. На следующем этапе работы были выбраны направления химического синтеза структурных аналогов 2-х ингибиторов и разработаны схемы синтеза. Для этих соединений провели компьютерное тестирование методом молекулярного докинга с целью предсказания энергии связывания с активным центром белка CPAF. Всего было синтезировано 34 химических соединения, которые являлись аналогами соединения 2394809 и 4 соединения, которые являлись аналогами 0877783. Ниже приведена таблица со структурами новых синтезированных соединений.
Анализ токсичности выбранных низкомолекулярных соединений проводился методом окрашивания метиленовым синим, позволяющим определить количество живых клеток после добавления тестируемых образцов. Результаты по тестированию токсичности производных соединений 2394809 и 0877783 представлены в таблице 8 и таблице 9 соответственно.
При анализе токсичности, проводимой в рамках скрининга, среди структурных аналогов соединения 2394809, было выбрано 27 химических соединений, которые при добавлении в культуру клеток в концентрации 100 мкМ вызывали гибель не более чем на 30%. Среди протестированных образцов 7 химических соединений (CL-110, CL-111, CL-112, CL-113, CL-139, CL-145) были достаточно токсичными для эукариотических клеток и снижали количество живых клеток более чем на 25%. А одно соединение было высокотоксичным (CL-150), подавляя число живых клеток в монослое на 75% в концентрации 100мкМ.
Среди структурных аналогов соединения 0877783 одно соединение было токсичным (CL-137), а три других соединения (CL-142, CL-143, CL-144) не проявляли выраженную токсичность для эукариотических клеток. Таким образом, для оценки эффективности нетоксичных низкомолекулярных соединений в отношении подавления хламидийной инфекции было отобрано 30 химических соединений.
Анализ эффективности новых нетоксичных соединений проводился в формате 24 луночного планшета с добавлением химических соединений в трех концентрациях: 25, 50, 100 мкМ к инфицированным хламидиями клеткам линии McCoy. В результате было обнаружено, что среди 27 нетоксичных соединений, структурных аналогов 2394809, 17 оказывали выраженный ингибирующий эффект в дозе 50 и 100 мкМ, подавляя инфекцию более чем на 50%, и приводя к уменьшению размеров хламидийных включений. Однако наилучшим ингибирующим эффектом обладало соединение CL-69, которое подавляло жизнеспособность патогена в дозе 100 мкМ на 87%. Пять соединений, среди которых: CL-62, CL- 63, CL-66, CL-68, CL-134, CL-139 в дозе 100 мкМ подавляли внутриклеточное развитие C.trachomatis на 70-83%. Остальные анализируемые вещества снижали количество хламидийных включений только на 50-67%. При действии всех потенциальных ингибиторов морфология хламидийных включений изменялась по сравнению с контролем, что свидетельствует об антихламидийной активности тестируемых соединений. При добавлении 100 мкМ соединения CL-69 к инфицированной хламидиями культуре клеток образовывались единичные разрушенные, средние и мелкие включения. Для химических соединений: CL-64, CL-70, CL-84, CL-90, CL-92, CL-138, CL-140 было характерно подавление инфекционного процесса в дозе 100 мкМ менее, чем на 50 %. При этом характер хламидийных включений также изменялся относительно контроля. Следует отметить, что четыре соединения: CL-109, CL-135, CL-146, CL-147 проявляли выраженную токсичность в отношении зараженных хламидиями эукариотических клеток.
Среди химических соединений, производных 877783, наилучшим ингибирующим эффектом на развитие хламидийной инфекции оказывали соединения CL-142 и CL-144, снижающие количество хламидийных инфекций в дозе 100 мкМ на 73 и 100% соответственно. Соединение CL-143 не обладало выраженной ингибирующей активностью.
Важной характеристикой для анализируемых соединений является величина IC50, обозначающая концентрацию вещества, приводящую к подавлению хламидийной инфекции на 50% (табл. 10,11).
Таким образом, в условиях добавления соединений в транспортную среду одновременно с инфекционным материалом (C.trachomatis L2) и последующего культивирования в течение 48 часов, наилучший подавляющий эффект оказывало соединение CL-69. Использование разных концентраций всех соединений показало дозозависимый эффект подавления хламидийной инфекции в культуре клеток. Химические соединения CL-62, CL-63, CL-66, CL-68, CL-134, CL-139 также оказывали видимое подавление инфекции в концентрации 100мкМ (более чем на 70%). Таким образом, на данном этапе проведенного скрининга были отобраны низкомолекулярные соединения, являющиеся производными 2394809: CL-62, CL-63, CL-66, CL-68, CL-134, CL-139 и CL-69, приводящие к выраженному дозозависимому подавлению хламидийной инфекции. Среди структурных аналогов 0877783 было отобрано соединение CL-142,снижающее количество инфицированных клеток на 73%, и CL-144, полностью подавляющее развитие хламидий in vitro при концентрации 100 мкМ.
