Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс] Тучков Игорь Витальевич

Введение к работе

з

Актуальность проблемы В настоящее время сибирская язва продолжает представлять серьезную проблему для здравоохранения и сельского хозяйства многих стран мира, включая Россию Вспышки сибирской язвы у сельскохозяйственных животных наносят значительный экономический ущерб и представляют собой реальную угрозу заболевания людей На территории России учтено более 35 тыс стационарно-неблагополучных пунктов, где существуют почвенные очаги, обусловливающие эпидемический потенциал инфекции [Онищенко Г. Г. с соавт., 1999; Черкасский Б. Л, 2002]. Определенную опасность заноса инфекции представляет расширение импорта сельскохозяйственной продукции из неблагополучных по сибирской язве стран [Абакаримов С Г с соавт, 1997; Онищенко Г. Г. с соавт , 1999; Dragon D. С. et al, 1995; Xudong L. et a!., 1995].

Заболевания людей сибирской язвой на территории Российской Федерации регистрируются постоянно. С 1990 по 2000 год средний уровень составил 40 случаев в год или 0,026 на 100 тыс населения [Черкасский Б. Л., 2002]. При этом за период 1999-2003 г было зарегистрировано 76 случаев заболевания людей сибирской язвой в 8 субъектах Российской Федерации [Онищенко Г Г., 1999-2003 гг ], а за 9 месяцев 2004 года - 14 случаев [Здоровье населения и среда обитания, 2004].

По мнению ряда авторов эпидемиологическую обстановку в России по сибирской язве можно оценить как напряженную и не имеющую тенденции к стабилизации [Монисов А. Н с соавт, 1997; Черкасский Б. Л., 2002] Кроме того, Bacillus anthracis рассматривается в качестве одного из наиболее вероятных агентов бактериологического оружия и средств биологического терроризма, что подтвердили события в США в октябре-ноябре 2001 г. [Онищенко Г Г с соавт., 2000. Воробьев с соавт., 2002; Jemigan J.A et al., 2002; Онищенко Г Г.. Дроздов И.Г., 2004]

В обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия по сибирской язве особая роль отводится качественной и своевременной диагностике. Традиционная схема лабораторного анализа с использованием биопробных животных и выделением чистой культуры занимает до 10 дней [Вургасов П Н., Рожков Г И . 1984; Маринин Л И. с соавт, 1999] Для обнаружения В anthracis используются экспресс-методы, включающие иммунологические и генодиагностические тесты Общим для всех иммуносерологических

. fОС НАЦИОНАЛЬНАЯ і
I БИБЛИОТЕКА і

методов, направленных на выявление сибиреязвенного микроба, является их недостаточная чувствительность, составляющая 1х10⁴ - 1х10⁶ м к/мл [Буравцева Н П с соавт, 1989; Абалакин В.А., 1990].

В последнее время достигнуты значительные успехи в области познания структуры и функций генетического аппарата сибиреязвенного микроба [Strettons S , Joodman A F , 1998; Okinaka R Т et al, 1999; Dai L et al, 1995; Guidi-Rontani С et al, 1999; Qi Y et al, 2001; Wilson W J et al, 2002] Определена полная нуклеотидная последовательность двух собственных плазмид (pXOl и рХ02), проведена серия работ по генотипированию [Kaspar R L et al , 1987; Okinaka R.T. et al., 1999; Keim P et al., 2000] Это явилось предпосылкой разработки новых молекулярно-генетических методов детекции и идентификации В anthracis

Из генодиагностических методов наиболее широкое распространение получила полимеразная цепная реакция (ПЦР), ставшая в последние годы стандартной лабораторной методикой, регламентированной МУ 1.3.-1794-03 "Организация и проведение генодиагностических исследований биологического материала, пищевых продуктов и объектов окружающей среды, зараженных бактериями 1-ІI групп патогенности". ПЦР-анализ характеризуется высокой чувствительностью (100 - 1000 мк/мл), специфичностью и быстротой выполнения анализа, а также возможностью выявлять микроорганизмы с измененным фенотипом Специфичность ПЦР определяется подбором праймеров. В литературе описано достаточно много праймеров для амплификации разных областей генома сибиреязвенного микроба, что позволяет не только выявлять возбудителя сибирской язвы, но и дифференцировать штаммы по ряду признаков [Carl М. et al., 1992; Turnbull Р С. В et al., 1992; Reif Т С et al, 1994; Fellows P F , 1996; Bohm R et al, 1998; Robertson D L. et al., 1999; QiY.etal.,2001].

Однако этот эффективный метод индикации и диагностики сибирской язвы до недавнего времени не был внедрен в практику здравоохранения Российской Федерации из-за отсутствия стандартных алгоритмов ПЦР-анализа и тест-систем, прошедших государственную регистрацию.

Вышеуказанные обстоятельства делают актуальным создание и практическое внедрение тест-системы для детекции возбудителя сибирской язвы, разработки схем

» і. ' і

генодиагностического анализа при лабораторной диагностике сибирской язвы и индикации возбудителя инфекции в объектах окружающей среды.

Цель работы - конструирование тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы в биологическом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции и внедрение препарата в практику здравоохранения.

Основные задачи исследования :

1. Провести анализ генома возбудителя сибирской язвы с целью выбора
видоспецифичных праймеров.

1. Подобрать параметры ПЦР для детекции штаммов В anthracis.

2. Сконструировать тест-систему для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы в биологическом материале и объектах окружающей среды методом ПЦР. Определить ее диагностическую ценность (чувствительность, специфичность, воспроизводимость результатов).

3. Разработать нормативную документацию на созданную тест-систему для выявления ДНК В anthracis рХ01⁺ методом ПЦР Представить разработанную тест-систему для проведения Государственных приемочных испытаний в ГИСК им. Л.А. Тарасевича

5. Разработать универсальный способ подготовки проб, обеспечивающий
инактивацию спорообразующей культуры и последующую очистку ДНК-мишени.

6. Разработать параметры ПЦР с праймерами, выбранными на основе плазмид (pXOl,
рХ02) для детекции штаммов В. anthracis, с различным плазмидным профилем.

7. Провести апробацию тест-системы в очаге сибирской язвы при исследовании
клинического материала и объектов окружающей среды.

Научная новизна работы. Впервые сконструирована тест-система для выявления В anthracis pXOl* методом полимеразной цепной реакции На основании проведенного анализа генома возбудителя сибирской язвы определены видоспецифичные фрагменты ДНК, соответствующие нуклеотидным последовательностям генов pag (плазмида pXOl) и сарВ (плазмида рХ02) На их основе подобраны олигонуклеотидные затравки для ПЦР, обеспечивающие эффективную амплификацию ДНК-мишеней Определена диагностическая ценность разработанной тест-системы и показана возможность ее использования для

6 исследования биологического материала (кровь, суспензии органов) и объектов окружающей среды (почва, смывы).

Разработан универсальный способ подготовки проб, обеспечивающий обеззараживание спорообразуюшей культуры и последующую экстракцию ДНК, показана его высокая эффективность при работе с различными объектами (кровь, суспензии органов, почва).

Продемонстрирована эффективность использования разработанной тест-системы для диагностики кожной формы сибирской язвы у людей, сельскохозяйственных животных, а также детекции В anthracis в объектах окружающей среды при проведении эпидемиологического расследования вспышек инфекции в очаге сибирской язвы (Республика Мордовия, 1999 г.).

Показана возможность дифференциации штаммов В anthracis по плазмидному профилю методом мультилокусной ПЦР.

Практическая значимость работы. По результатам работы разработана нормативная документация (фармакопейная статья предприятия (ФСП), экспериментально-производственный регламент (ЭПР) и регламент производства (РП), инструкция по применению) на тест-систему для выявления ДНК В anthracis pXOl* методом ПЦР.

Разработанный способ подготовки проб для ПЦР-анализа при работе со спорообразующими штаммами сибирской язвы представлен в методических указаниях "Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV группы патогенносте, при работе методом ПЦР".

Проведены Государственные приемочные испытания "Тест-системы для выявления ДНК Bacillus anthracis рХ01⁺ методом полимеразной цепной реакции". Результаты Государственных испытаний одобрены на Ученом Совете ГИСК им. Л. А. Тарасевича (протокол № 8 от 25.05.98 г.). Получено разрешение комитета МИБП на внедрение "Тест-системы для выявления ДНК В anthracis рХ01⁺ методом полимеразной цепной реакции" в практику здравоохранения (протокол № 3 от 18.06.98 г.). ФСП на препарат (№ 42-0020178501) прошла экспертизу в Фармакологическом Комитете Российской Федерации и утверждена 12.11.2001 г., утверждены ЭПР №560-00 и РП № 1504-04. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 4.01 2004 г. утверждена

инструкция по применению "Тест-системы для выявления ДНК Bacillus anthracis pXOI ⁺ методом полимеразной цепной реакции".

Сконструированы и депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" моно- и бесплазмидные варианты вирулентных штаммов В anthracis 81/1 и М28, использованы при проведении Государственных приемочных испытаний

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Праймеры на основе нуклеотидной последовательности гена pag плазмиды рХО 1 обеспечивают видоспецифическую детекцию штаммов Bacillus anthracis методом ПЦР.

2. Сконструированная тест-система для выявления ДНК Bacillus anthracis рХ01 ⁺ методом ПЦР характеризуется чувствительностью - 10 - 1000 м. к./мл, специфичностью -100 %, позволяет обнаружить ДНК возбудителя сибирской язвы в биологическом материале и объектах окружающей среды.

3. Способ подготовки проб, включающий этап инактивации спорообразующей
культуры и последующую экстракцию ДНК с использованием в качестве лизирующего агента
гуанидинтиоциаиата, обеспечивает обеззараживание исследуемого материала и не влияет на
чувствительность ПЦР-анализа.

4. Метод ПЦР эффективен для лабораторной диагностики сибирской язвы у людей и сельскохозяйственных животных, индикации В anthracis в объектах окружающей среды, а также при эпидемиологическом расследовании вспышек инфекции.

5. Разработанный вариант ПЦР с праймерами на основе репликонов pXOl и рХ02 позволяет дифференцировать атипичные по плазмидному профилю штаммы В anthracis .

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Российских научных конференциях "Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций" (Волгоград, 1992) и "Актуальные вопросы дезинфекции, стерилизации, дезинсекции, дератизации" (Москва, 1992); Межгосударственной научно-практической конференции "Актуальные вопросы чумы и других инфекционных заболеваний", посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы (Ставрополь, 1994); научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (Саратов, 1997); Юбилейной научной конференции "Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария",

g
посвященной 70-летию НИИ микробиологии Минобороны России (Киров. 1998);
Международной научно-практической конференции "Проблемы санитарно-

эпидемиологической охраны территории СНГ" (Саратов, 1998); на 3-ей Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика в современной медицине" (Москва, 2000); 1-ой Всероссийской научно-практической конференции "Генная диагностика особо опасных инфекций" (Саратов, 2000); итоговых научных конференциях РосНИПЧИ "Микроб"; 4-ой Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний" (Москва, 2002); 4-ой Межгосударственной научно-практической конференции "Современные технологии в диагностике особо опасных болезней"(Саратов, 2003)

Публикации. Основное содержание работы отражено в 23 научных публикациях Структура и объём диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы Общий объем диссертации 147 страниц Текст иллюстрирован 11 таблицами и 17 рисунками

Похожие диссертации на Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс]

Конструирование тест-систем для выявления ДНК возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы методом мультилокусной ПЦРКуклев Василий Евгеньевич

Конструирование тест-системы для выявления возбудителя холеры методом полимеразной цепной реакцииДавыдова Наталия Александровна

Совершенствование тест-системы для выявления возбудителя бруцеллеза методом ПЦРШарова Ирина Николаевна

Разработка иммуноферментных тест-систем для выявления антигенов Mycoplasma pneumoniae и Mycoplasma hominisШершнёва Наталья Николаевна

Усовершенствование средств диагностики и идентификации возбудителя сибирской язвыБуерова Светлана Васильевна

Эффективность современных дезинфицирующих средств против спор возбудителя сибирской язвыЕлизаров Василий Владимирович

Разработка комплекса иммунодиагностических тест-систем для обнаружения возбудителя сибирской язвыХлынцева, Анна Евгеньевна

Диагностическая ценность сибиреязвенных иммуноглобулинов и бактериофага Гамма А-26 при выявлении и идентификации возбудителя сибирской язвыЛобач Роман Николаевич

Разработка питательных сред на основе сырья растительного происхождения для культивирования возбудителей чумы, холеры, сибирской язвыКурилова Анна Алексеевна

Экспериментальные подходы к изучению тонкой трехмерной морфологии клеток возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы и некоторые особенности их поверхностных ультраструктурКузнецов, Олег Святославович