Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 12
1.1. Пути совершенствования ГЩР-диагностики инфекционных болезней 12
1.2. Лабораторная диагностика бруцеллеза 20
Глава2 Материалы и методы 35
2.1. Объекты исследования 35
2.1.1. Штаммы микроорганизмов 35
2.2. Среды и условия культивирования 38
2.3. Лабораторные животные 38
2.4. Подготовка проб 38
2.5. Бактериологический анализ 41
2.6. Иммунологические методы лабораторной диагностики . 41
2.7. ПЦР-анализ 42
2.7.1. Выбор праймеров 42
2.7.2. Выделение ДНК г 43
2.7.3. Полимеразная цепная реакция 44
2.7.4. Гель-электрофорез 46
2.8. Статистическая обработка полученных данных 47
Глава 3. Совершенствование тест-системы для выявления возбудителя бруцеллеза методом ПЦР 48
3.1. Подбор эффективных праймеров для создания ПЦР-тест-системы и оптимизация условий реакции 49
3.2. Определение диагностической ценности ПЦР-тест-системы в комиссионных испытаниях 57
Глава 4 Сравнительная оценка пцр и бактериологического анализа при экспериментальном бруцеллезе 65
Глава 5 Использование ПЦР-анализа при обследовании контингентов риска по бруцеллезу 72
Глава 6 Применение ПЦР-анализа при исследовании молочных продуктов на бруцеллез 80
Заключение 90
Выводы 104
Список использованных источников 106
- Пути совершенствования ГЩР-диагностики инфекционных болезней
- Штаммы микроорганизмов
- Подбор эффективных праймеров для создания ПЦР-тест-системы и оптимизация условий реакции
- Использование ПЦР-анализа при обследовании контингентов риска по бруцеллезу
Введение к работе
Актуальность проблемы
Бруцеллез продолжает оставаться серьезной экономической и социальной проблемой как в здравоохранении, так и в сельском хозяйстве [Таран И.Ф. с соавт., 1996; Григорьева Г.И. с соавт., 1998; Калиновский А.И. с соавт., 1998; Шахани-на И.Л. с соавт., 1999; Оншценко Г.Г. с соавт., 1999]. Несмотря на сокращение количества неблагополучных пунктов по бруцеллезу крупного и мелкого рогатого скота, уровень заболеваемости, связанный с профессиональным фактором в общественном секторе, остается высоким (до 90 %). Только в 2000 г. в Российской Федерации зарегистрировано 423 впервые выявленных случая заболевания людей бруцеллезом, что на 20,8 % выше аналогичного показателя 1999 г. Этому способствует несвоевременное оздоровление бруцеллезных хозяйств, позднее выявление и изоляция больных животных, неудовлетворительные условия труда в хозяйствах и на перерабатьшающих предприятиях. Кроме того, отсутствие надлежащего сани^ тарно-ветёрйнарного контроля за реализацией среди населения продукции животноводства и животноводческого сырья может привести к попаданию в торговую сеть зараженных возбудителем бруцеллеза продуктов, среди которых молоко и молочные продукты как факторы передачи инфекции имеют большое значение.
Важное место в системе эпидемиологического надзора за бруцеллезом отводится качественной и своевременной диагностике этого заболевания. Для лабораторной диагностики бруцеллеза у людей и животных используют бактериологический анализ, достаточно трудоемкий и длительный метод. Применяемые иммунологические реакции также имеют ряд существенных недостатков: невысокую чувствительность (1x10 -10 м.к./мл), возможность перекрестных реакций с Yersinia
6 enterocolitica, Francisella tularensis, Vibrio cholerae, кроме того, эффективность методов во многом зависит от качества иммуноглобулинов и диагностикумов [Соколова Е.Е., 1986; Загоскина Т.Ю. с соавт., 1998; Кулаков Ю.К. с соавт., 1997].
В последнее десятилетие для диагностики бруцеллеза активно разрабатывается полимеразная цепная реакция (ПЦР) [Fekete A. et al, 1990; Baily G.G. et al, 1992; Bricker B.J. et al, 1994; Leal- Klevezas D.S. et al, 1995; Romero С et al, 1995; Куличенко A.H., 1995; Rijpens N.P. et al, 1996; Гаранина СБ., 1996; Шумилов K.B. с соавт., 1996, 1998]. К достоинствам этой реакции относится ее высокая чувствительность и специфичность, быстрота получения результата, возможность выявления низких концентраций возбудителя инфекции в различном материале. ПЦР незаменима в изучении хронических инфекций, обусловленных персистирующими или труднокультивируемыми формами микроорганизмов, в том числе и бруцелла-ми. ПЦР соответствует всем основным требованиям, предъявляемым к современным методам лабораторной диагностики, и перспективна для широкого практического использования.
Однако до настоящего времени место ПЦР-анализа в общей схеме исследований при диагностике бруцеллеза до конца не определено. Это, прежде всего, связано с отсутствием стандартных препаратов, разрешенных к применению Минздравом России. Как показали наши исследования, используемые рядом отечественных авторов тест-системы, с разработанными ранее праймерами Brul-Bru2 при работе с биологическим материалом не обеспечивают 100 % специфичность и воспроизводимость результатов, что является обязательным для широкого практического внедрения препарата. Несмотря на отдельные публикации по применению ПЦР-анализа для диагностики бруцеллеза у людей [Шестопалов М.Ю. с соавт.,
1997; Шестопалов М.Ю., 1999; Дентовская СВ., 2000], окончательно не определена диагностическая значимость этого метода при обследовании контингентов риска по бруцеллезу. До сих пор не решен вопрос об эффективности использования ПЦР-анализа при исследовании на бруцеллез продуктов питания. С учетом изложенного очевидна актуальность создания и внедрения в практику ПЦР-тест-систем для детекции ДНК бруцелл, разработка оптимальных схем ПЦР-анализа.
Цель работы - разработка специфичных праймеров и совершенствование ПЦР-тест-системы для выявления возбудителя бруцеллеза, оценка ее диагностической эффективности при генной диагностике бруцеллеза у людей и детекции бруцелл в молоке и молочных продуктах.
Основные задачи исследования
Подобрать праймеры на основе нуклеотидной последовательности гена, кодирующего синтез белка молекулярной массой 31 кДа внешней мембраны бруцелл, и определить основные параметры ПЦР, обеспечивающие высокую чувствительность и специфичность реакции.
Разработать на основе оптимальных праймеров диагностическую тест-систему, позволяющую выявлять все виды бруцелл в биологическом материале, объектах внешней среды и молочных продуктах.
Изучить диагностическую информативность разработанной тест-системы при работе с материалом, полученным от зараженных животных/Сравнить эффективность бактериологического метода и ПЦР при исследовании материала, искусственно инфицированного возбудителем бруцеллеза, а также органов, тканей и биологических жидкостей морских свинок, зараженных различными видами бруцелл.
4. Определить возможность использования ПЦР-анализа в комплексе с тра
диционными методами лабораторной диагностики для обследования контингентов
риска по бруцеллезу.
5. Сравнить эффективность различных способов выделения и очистки ДНК,
основанных на применении лизирующих агентов, фенольной экстракции, нуклео-
сорбции для подготовки проб при ПЦР-анализе молока, и молочных продуктов.
Оценить чувствительность и специфичность разработанной тест-системы при ис
следовании молочных продуктов, искусственно инфицированных возбудителем
бруцеллеза.
Научная новизна работы
Разработана тест-система с праймерами ВгиЗ 1-Вги32 и Bru3-Bru4 на основе нуклеотидной последовательности гена, кодирующего синтез белка молекулярной массой 31 кДа внешней мембраны бруцелл, для исследования биологического материала и объектов внешней среды на наличие возбудителя бруцеллеза методом двухстадийной ("гнездовой") ~ПЦР. Доказана ее высокая специфичность и чувствительность при работе с чистыми культурами возбудителя бруцеллеза (1x102- 1x103 м.к./мл) и объектами, искусственно инфицированными бруцеллами (1х103 м.к./мл).
Показано преимущество ПЦР-анализа с использованием разработанной тест-системы при исследовании органов, тканей и биологических жидкостей морских свинок, экспериментально зараженных бруцеллезом, и материала, искусственно контаминированного бруцеллами, по сравнению с бактериологическим методом.
Продемонстрирована эффективность использования ПЦР-анализа в комплексе с серологическими тестами для обследования контингентов риска по бруцеллезу (животноводов неблагополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота
хозяйств и работников мясоперерабатывающего комбината).
Определены наиболее эффективные способы подготовки проб, обеспечивающие высокую степень экстракции и очистки ДНК при исследовании молочных продуктов методом ПНР.
Впервые показана возможность выявления ДНК возбудителя бруцеллеза методом ПЦР с предложенной тест-системой в молочных продуктах (сливках, сыре, масле) с чувствительностью 1х103 - 1х104 м.к./мл (г).
Практическая значимость работы
На диагностический набор "Тест-система для выявления Brucella spp. методом полимеразной цепной реакции" разработана нормативно-техническая документация (экспериментально производственный регламент, фармакопейная статья, фармакопейная статья предприятия, инструкция по применению).
По программе, утвержденной комитетом МИБП, проведены Государственные приемочные испытания (протокол № 2 от 30.05.96 г.). Результаты Государственных испытаний одобрены ученым советом ГИСК им. Л.А. Тарасевича (протокол № 7 от 16.05.00 г.).
Получено разрешение комитета МИБП на внедрение препарата в практику здравоохранения (протокол №.7 от 05.07.00 г.).
Материалы диссертации используются при чтении лекций на курсах повышения квалификации специалистов по ПЦР-диагностике при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб".
Основные положения, выносимые на защиту
1. ПЦР-тест-система на основе праймеров Вга31-Вга32 и ВшЗ-Вш4 обеспечивает специфичную детекцию всех видов бруцелл с чувствительностью 1х102 -
lxlO3 м.к./мл при анализе чистых культур и 1х103 м.к./мл при исследовании биологического материала, объектов внешней среды и молочных продуктов, искусственно контаминированных Brucella spp.
По эффективности, чувствительности и быстроте выполнения ПЦР-анализ с использованием разработанной тест-системы превосходит бактериологический метод как при исследовании объектов, искусственно контаминированных возбудителем бруцеллеза, так и биологического материала от экспериментально зараженных животных.
При обследовании контингентов риска по бруцеллезу (животноводов хозяйств неблагополучных по бруцеллезу КРС и работников мясокомбината) ПЦР-анализ обладает большей диагностической точностью по сравнению с традиционными серологическими методами лабораторной диагностики.
4. Использование разработанной схемы ПЦР-анализа позволяет выявлять
возбудитель бруцеллеза в молоке и молочных продуктах с чувствительностью
lxlO3- 1х104м.к./мл(г).
Апробация работы
Материалы диссертации доложены и представлены на научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (Саратов, 1997); П Всероссийской конференции "Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний" (Москва, 1998); II Всероссийской конференции "Гомеостаз и инфекционный процесс" (Саратов, 1998); Международной научно-практической конференции "Проблемы санитарно-эпидемиологической охраны территорий стран СНГ" (Саратов, 1998); VI Республиканской научно-практической конференции "Зоонозы: актуальные вопросы в
11 клинике и эксперименте" (Махачкала, 2000); I Всероссийской научно-практической
конференции "Генная диагностика особо опасных инфекций" (Саратов, 2000).
Публикации
Основное содержание работы отражено в 12 научных публикациях.
Структура и объем диссертации
Работа состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 181 цитируемую работу. Общий объем диссертации 128 страниц. Текст иллюстрирован 12 таблицами и 10 рисунками.
Пути совершенствования ГЩР-диагностики инфекционных болезней
В обзорах отечественных и зарубежных авторов неоднократно проводилось подробное описание ПЦР и возможности ее использования в лабораторной диагностике инфекционных болезней [Rolfs A. et al, 1992; Вартапетян А.Б., 1991; Федоров Н.А. с соавт., 1996; Дубинина И.Г. с соавт., 1998]. Однако общепринятая процедура ПЦР не всегда удовлетворяет требованиям конкретных научных и практических задач, особенно при проведении массовых диагностических исследований. В последние годы в схему проведения ПЦР-анализа вносится много дополнений и изменений, что повышает надежность метода и расширяет область применения. Большое внимание уделяется подбору праймеров, уникальность которых определяет эффективность и специфичность амплификации; разрабатываются простые и доступные способы выделения и очистки ДНК, а также методы детекции ПЦР-продукта. Только продуманное сочетание этих основных этапов ПЦР-анализа позволит увеличить производительность, снизить себестоимость и повысить качество ПЦР-диагностики [Момыналиев К.Т., Говорун В.М., 2000].
В настоящее время созданы мощные базы данных, в которых систематизируется и хранится вся имеющаяся информация о генах и целых геномах различных организмов (GenBank, созданный Национальным центром биотехнологической информации; EMBL - Европейским институтом биоинформатики; DDBJ - Японским национальным институтом генетики и Центром биологической информатики). При разработке ПЦР-тест-систем для диагностики бактериальных и вирусных инфекций использование этих данных и возможностей компьютерных программ OLIGO, Gene Ranner, BLAST позволяет осуществлять поиск консервативных нук леотидных последовательностей генома изучаемого микроорганизма, быстро и качественно проводить подбор специфичных или универсальных праймеров с учетом профиля плавления ДНК и отсутствия комплементарных взаимодействий, а также получать ценную информацию о наличии участков неспецифичного связывания с нуклеотидньми последовательностями других видов бактерий и вирусов, включая ДНК человека.
Значительные изменения в настоящее время претерпевает метод «классической» полимеразной цепной реакции, что связано с разработкой и внедрением различных модификаций ПЦР, позволяющих повысить чувствительность реакции и снизить возможность получения ложноположительных результатов.
Наиболее широкое распространение получила количественная ПЦР, а именно две ее разновидности: конкурирующая ПЦР и Taq- man ПЦР [Jallibella J. et al., 1997; Clementi M. et al., 1993; Jelmini S. et al., 1997]. Принцип конкурирующей ПЦР заключается в том, что в реакционную смесь, одновременно с исследуемым образцом, вносится внутренний контроль (стандарт) с известным количеством копий. Он, как и определяемая ДНК, участвует в ПЦР, но детектируется при этом в виде отдельных сигналов. По интенсивности сигнала от внутреннего контроля и сигнала от определяемого ампликона можно судить о количестве копий матрицы [Ferre F., 1992; Silbert P.D., Аляпкина Ю.С. с соавт., 1994; Cross N.C.H., 1995]. Кроме того, внутренний контроль позволяет выявлять возможное ингибирование реакции, а, следовательно, исключает регистрацию ложноотрицательных ответов.
Более точно определить количество возбудителя в пробе с использованием внутреннего стандарта возможно при титровании продукта амплификации (метод конечных разведений) [Ferre F., 1992; Picard С. et al., 1992; Clementi M. et al., 1993; Foley K.P. et al, 1993; Recorbet Y. et al, 1993; Myrold D.D. et al, 1994]. При этом устанавливается предельное разведение образца ДНК, дающее положительный результат ГЩР. В каждом определении используется набор стандартов, необходимый для контроля чувствительности тест-системы. Однако такая ПЦР не учитывает возможное ингибирование амплификации в каждой исследуемой пробе.
В настоящее время разработана еще одна модификация количественного определения наработанных ампликонов, которая, как и конкурирующая ГЩР позволяет контролировать процесс, проходящий в каждой конкретной пробирке - Taq-тап ПЦР. В основе метода лежит способность Год-полимеразы гидролизовать по-следовательность ДНК в направлении 5 -3. В ходе реакции к образцу добавляют специальный зонд, содержащий две флуоресцирующие метки, одна из которых способна поглощать квант света, испускаемый другой меткой, расположенной на 5 - конце зонда. Возбуждаемое в результате свечение, регистрируется в более длинноволновой области спектра. При наличии специфичной матрицы в процессе амплификации из-за 5 эндонуклеазной активности Тад-полимеразы происходит деградация олигонуклеотидного зонда в этой области и перенос энергии от одного флуорофора к другому не происходит. Наблюдается смещение максимума флуоресценции, регистрация которой позволяет рассчитать количество исходной матрицы, используемой в реакции [Каїіпіпа О. et al, 1997; Lang R. et al, 1997].
Значительно повысить чувствительность анализа, а также без использования других методов подтвердить специфичность реакции позволяет двухстадийная или «гнездовая» (nested) ПЦР, осуществляемая с использованием двух пар праймеров. На первом этапе амплифицируется участок ДНК, фланкированный внешними праймерами, после чего вторая пара праймеров, комплементарных внутреннему участку, наработанного на первом этапе ампликона, осуществляет амплификацию фрагмента ДНК меньшего размера [Waage A.S. et al., 1999; Albert J. et al, 1990]. Праймеры можно использовать в реакции раздельно и проводить амплификацию дважды, а можно использовать в одной реакционной смеси, но для этого температуру отжига внутренней пары подбирают с таким расчетом, чтобы на первом этапе, при проведении амплификации с внешними праймерами, они не участвовали в реакции. Последний подход позволяет устранить основной недостаток метода - необходимость переноса продуктов реакции из одной пробирки в другую, что может привести к контаминации проб и появлению ложноположительных результатов [Don R.Y. et al, 1991].
В настоящее время разработан метод, который позволяет одновременно выявлять несколько различных возбудителей инфекционных заболеваний или определять сразу комплекс факторов вирулентности и резистентности к антибактериальным или противовирусным препаратам - мультипраймерная или «множественная» ПЦР. Реакция осуществляется с использованием нескольких неперекрещи-вающихся праймеров [Hoshino К. et al, 1998; Ни Y. et al, 1999].
Штаммы микроорганизмов
В настоящее время все более широкое применение для индикации и идентификации бруцелл находит ПЦР, которая позволяет в короткие сроки (6-8 часов) с высокой чувствительностью обнаруживать низкие концентрации возбудителей инфекций в различном биологическом материале и объектах внешней среды, в том числе контаминированных посторонней микрофлорой. Существенным достоинством метода является возможность обнаружения атипичных форм микроорганизмов.
В 1990 г Fekete A. et al. впервые применили ПНР для детШции ДНК бруцелл. Праймеры на основе нуклеотидной последовательности гена, отвечающего за синтез одного из поверхностных белков бруцелл с молекулярной массой 43 кДа, обеспечивали специфичную амлификацию фрагмента ДНК размером 635 п.н. С помощью данных праймеров при работе с очищенной ДНК бьша показана возможность детекции всех видов рода Brucella с чувствительностью 100 м.к./мл.
Позднее L. Herman и Н. De Rider [1993] использовали ПЦР для быстрой, специфичной и чувствительной индикации различных видов бруцелл. Авторы использовали праймеры на основе 16S рРНК бруцелл, позволяющие амлифицировать специфичный фрагмент ДНК размером 800 п.н. Праймеры на основе той же последовательности (16S рРНК), разработаные С. Romero et al. [1995] обеспечивали амплификацию в ПЦР фрагмента ДНК размером 905 п.н. со штаммами всех видов и биоваров рода Brucella. При использовании образцов гетерогенных микроорганизмов положительный результат зарегистрирован только с Ochrobactrum anthropi. Аналогичные результаты были получены М. Da Costa et al. [1996] при проведении ПЦР с использованием праймеров на основе нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих синтез различных белков: молекулярной массой 31 кДа, белков теплового шока (DnaJ, DnaK, HtrA, GroEL), a также последовательности 16S рРНК бруцелл.
K.F. Fox et al. [1998] для конструирования праймеров использовали спейсер 16S-23S рРНК. Путем амплификации в ПЦР промежутка 16S-23S рибосомальной области, авторы попытались установить внутривидовые различия у штаммов В. melitensis, В. abortus, В. suis, В. canis. Однако полиморфизм у данных видов бруцелл выявить не удалось.
B.J. Bricker, S.M. Hailing [1994] при исследовании 107 изолятов бруцелл методом ПЦР с праймерами на основе нуклеотиднои последовательности инсерцион-ного элемента IS 77 і в 100% случаев подтвердили результаты, полученные при использовании традиционных методов лабораторной диагностики бруцеллеза.
Высокая чувствительность и специфичность ПЦР с праймерами, синтезированными на основе нуклеотиднои последовательность гена, кодирующего белок внешней мембраны бруцелл молекулярной массой 31 кДа, была показана в работах G. Baily et al. [1992], А.Н. Куличенко с соавт. [1994, 1995], СБ. Гараниной [1996], G. М. Matar et al. [1996] и др. При исследовании чистых культур бруцелл различных видов, чувствительность ПЦР с данными праймерами составила 1х103 м.к./мл [Куличенко А.Н., 1995, Гаранина СБ., 1996]. Использование двухстадийной "гнез довой" ПЦР позволило повысить разрешающую способность метода до 1x10 м.к./мл, а последующая гибридизации с нерадиоактивномеченным внутренним зондом до 10 м.к./мл бруцелл [Куличенко А.Н., 1995]. Полимеразная цепная реакция в настоящее время широко внедряется в медицинскую практику. G. М. Matar et al. [1996] применили ПЦР для быстрого и специфичного подтверждения диагноза бруцеллеза у людей. В качестве диагностического материала была использована кровь. Методом ПЦР ДНК бруцелл была обнаружена в крови у 17 больных с острым серопозитивным и хроническим рецидивирующим бруцеллезом. СБ. Гаранина [1996] показала возможность обнаружения бруцелл методом ПЦР при исследовании образцов крови больных хроническим бруцеллезом. СВ Дентовская, А.Н Куличенко [1999], используя праймеры на ген, кодирующий синтез белка молекулярной массой 31-кДа В. abortus, исследовали методом ПЦР кровь, мочу и слюну 17 больных с диагнозом хронический бруцеллез в стадии де- или субкомпенсации, поставленным на основании клинико-эпидемиологических данных, результатов серологических реакций (Райта, Хеддль-сона, РНГА) и аллергической пробы Бюрне. Образование специфичного ПЦР-продукта выявлено в образцах ДНК из крови шестнадцати больных (93 %), из мочи у десяти (58,8 %) и из слюны у шести (35 %). М.Ю. Шестопалов [1999], СВ. Балахонов [2000] применили ПЦР для диагностики бруцеллеза у людей с использованием в качестве диагностического материала образцы сыворотки крови. Тестирование в ПЦР образцов нативных сывороток, полученных от животноводов неблагополучных хозяйств, позволило выявить ДНК бруцелл в 77,6 % случаев, в тоже время в серологических тестах (РА, РХ, РИГА) противобруцеллезные антитела были обнаружены в 30,3 %. D.S. Leal-Klevezas et al. [1995] показали принципиальную возможность обнаружения возбудителя бруцеллеза с помощью ПЦР в крови и молоке животных, инфицированных в естественных условиях. При сравнении полученных данных с результатами общепринятых методов лабораторной диагностики (серологические тесты, бактериологический анализ), из всех обследованных животных только у трех все используемые методы дали положительный ответ. В группе из 22 самок коз, среди которых 14 имели положительные серологические реакции (63,6 %), ДНК бруцелл удалось обнаружить в крови 19 (86 %). Бактериологически же был подтвержден лишь один случай заболевания (4,5 %). Из 15 животных с отрицательными результатами серологических реакций и бактериологического исследования, применяя ГЩР-анализ, авторы выявили ДНК бруцелл в крови двух (1,3 %) коз.
Подбор эффективных праймеров для создания ПЦР-тест-системы и оптимизация условий реакции
Образцы ДНК в количестве 10 мкл вносили в реакционную смесь, содержащую: 10х буфер (70 мМ Трис-HCl, рН 8,5, 20 мМ (NH4)2S04, 20 мкг/мл ВСА, 0,01 % Твин-20) 2 мМ MgCb, 0,2 мМ дНТФ, 12 пмоль каждого праймера, 1 ед. фермента Тод-полимеразы. Конечный объем реакционной смеси составил 25 мкл. Сверху для предотвращения испарения наслаивали минеральное масло (около 25 мкл). Проводили 35 циклов амплификации по следующей программе: денатурация - (94± 0,1) С - 1 мин, отжиг праймеров - (расчетная температура, средняя для каждой пары праймеров) - 1 мин, синтез комплементарной цепи - (72±0,1)С -1 мин. После последнего цикла пробирки прогревали в течение 3 мин при температуре (72 ±0,1) С. Для снижения вероятности образования вторичных структур и неспецифичного связывания праймеров пробирки помещали в гнездо термоцикле-ра только после достижения температуры денатурации. Результаты исследования показали, что все три пары праймеров амшшфицировали специфичный фрагмент ДНК, соответствующего размера, что свидетельствует о возможности их использования в качестве затравок для проведения ПЦР. Однако положительные результаты ПЦР были зарегистрированы и с гетерогенными микроорганизмами.
Известно, что чувствительность реакции и специфичность получаемого ПЦР-продукта в значительной степени определяется температурой отжига прайме-ров, при которой происходит комплементарное связывание их с соответствующим участком ДНК-мишени. Существующие формулы для расчета температуры лишь ориентировочно определяют ее значение. Более точно данный параметр следует подбирать экспериментально [Rolfs A. etal, 1993].
В нашу задачу входило определение оптимального значения температуры отжига для постановки ПЦР с тестируемыми праймерами. Для этого отжиг ампли-меров проводили в интервале температур от 50 С до 60 С с шагом в 2 С. Специфичную амплификацию фрагментов ДНК бруцелл праймеры Bra 11-Bra 12 обеспечивали при температуре 57 С, что на 8 С выше расчетной. Для праймеров Вга21-Вга22 значения расчетной и оптимальной температур совпали (56-С). При более низких температурах наблюдалось комплементарное связывание праймеров Brail-Вга12 с ДНК Y. enterocolitica, a Bru21-Bru22 с ДНК Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, V. cholerae и эукариотических клеток с образованием фрагментов ДНК равных по размеру специфичным ампликонам, т.е. 571 и 462 п.н. соответственно. Для пары Вга31-Вга32 оптимальная температура отжига составила 60 С. Снижение величины данного параметра на 4 С приводило к неспецифичной амплификации фрагмента большего размера с ДНК Y. pseudotuberculosis. Сравнение чувствительности ПЦР с тестируемыми праймерами показало, что только две пары Brull-Brul2 и Вга31-Вга32 при оптимальных температурных условиях обеспечивали чувствительность метода ІхЮ4 м.к./мл. Однако уровень амплификации с праймерами Bra 11-Bra 12 был настолько мал, что специфичные полосы практически не визуализировались в окрашенном агарозном геле. Это могло быть обусловлено низкой концентрацией или недостаточной активностью фермента Taq-полимеразы, вносимого в реакционную смесь. Изменение концентрации фермента от 1 до 2,5 ед. не дало ожидаемого результата. С учетом влияния на влияния на ПЦР ионов Mg2+, мы изменяли концентрацию магния хлорида в реакционной смеси от 1,5 до 4 мМ. Оптимальное значение концентрации MgCl2 составило 2 мМ. Увеличение его содержания, хотя и позволило повысить интенсивность сигнала, в тоже время приводило к появлению неспецифичных продуктов амплификации. Таким образом, наиболее высокую чувствительность и специфичность в ПЦР обеспечивали праймеры, обозначенные как ВгаЗІ и Вга32, которые амшшфицировали фрагмент ДНК размером 299 п.н. Эти амплимеры были выбраны нами для дальнейшего исследования и создания на их основе ПЦР-тест-системы. В серии экспе-риментов были оптимизированы параметры реакции для ггоаймёров ВгаЗ 1-Вга32: температура отжига составила - 60 С, концентрация MgC - 2 мМ, концентрация фермента - 1 ед.
Известно, что повысить разрешающую способность анализа возможно при проведении второго этапа ПЦР с праймерами, комплементарными внутреннему участку первичных амшшконов [DutilhB et ai, 1989, Bej A.K., 1991]. Это позволяет не только выявлять минимальные количества микроорганизмов в пробах, но и подтвердить специфичность амплифицированных фрагментов ДНК. Кроме того, перенос части продуктов реакции из одной пробирки в другую существенно снижает концентрацию ингибиторов реакции, которые могут присутствовать в образце поеле этапа выделения нуклеиновых кислот [Момыналиев К.Т., Говорун В.М., 2000]. Для проведения второго этапа ПЦР мы использовали праймеры ВгиЗ и Bru4, предложенные СБ. Гараниной [1996], амплифицирующие фрагмент ДНК размером 175 п.н., внутреннего участка первичной ДНК-мишени. Первый этап двухстадийной ПЦР с праймерами Вга31-Вга32 проводили в предварительно оптимизированных нами для данных амплимеров условиях. Нара ботанный на первом этапе ПЦР-продукт в объеме 1 мкл переносили в реакционную смесь того же состава, что и для праймеров Вт 31, Bra 32, содержащую по 12 пмоль каждого из внутренних праймеров. Проводили 25 циклов амплификации в следующем температурном режиме: (94±0,1) С - 1 мин, (55±0,1)С - 1 мин, (72±0,1) С - 1 мин. После последнего цикла пробы прогревали в течение 3 мин при температуре (72±0,1) С, при необходимости вводили дополнительный этап: (4±0,1) С - в течение 18 ч. Чувствительность метода при постановке двухстадий ной ПЦР составила 1x10-1x10 м.к./мл. Но проведение 35 циклов амплификации с внешними праймерами и 25 - с внутренними привело к наработке значительного количества ПЦР-продукта. При просмотре агарозного геля мы наблюдали широкую полосу с размытыми границами, что сильно затрудняло учет результатов реакции (рис. 3). В связи с этим количество циклов на первом этапе бьшо уменьшено до 25. Кроме того, мы сократили продолжительность каждого шага реакции с 1 мин до 40 сек на первом и до 30 сек на втором этапах. Это позволило нам значительно сократить время проведения ПЦР без снижения чувствительности метода.
Использование ПЦР-анализа при обследовании контингентов риска по бруцеллезу
Известно что, выделение культуры бруцелл из исследуемых объектов является трудоемкой и длительной процедурой (для выдачи отрицательного ответа посевы выдерживают до 30 дней). В связи с этим первостепенное значение приобретают ускоренные методы диагностики, к которьм относится полимеразная цепная реакция. Высокая специфичность и чувствительность ПЦР при работе с чистыми культурами возбудителя бруцеллеза показана многими авторами [Куличенко А.Н., 1995; Гаранина СБ., 1996; Fekete A. et al, 1990; Leal- Klevezas D.S. et al., 1995: Romero С et al., 1995]. Об этом свидетельствуют и результаты наших исследований, представленные в гл.З. Однако вопрос об эффективности применения метода для обнаружения ДНК бруцелл в продуктах животноводства и других биологических объектах окончательно не решен. Особый интерес представляет адаптация условий ПЦР-анализа для работы с материалом от больных животных.
Обычно для оценки чувствительности лабораторных тестов при работе с биологическими материалами инфекционные агенты искусственно вносят в исследуемые пробы. Но при таком подходе невозможно воссоздать истинную картину инфицирования тканей возбудителем бруцеллеза, в частности из-за его внутриклеточной локализации.
Целью данного этапа работы была оценка диагностической точности ПЦР-анализа по сравнению с бактериологическим методом при моделировании бруцеллезной инфекции на лабораторных животных.
Эксперименты выполнены на 15 морских свинках, которых заражали подкожно культурами вирулентных штаммов В. abortus 63/75, В. melitensis 565 и В. suis 1330 в дозе 1000 м.к. Трех животных не инфицировали и использовали в качестве отрицательного контроля. Через 25 дней животных вскрывали. Готовили суспензии печени, селезенки, легких, почек, мьппечной ткани, паховых и парааор-тальньгх лимфатических узлов, забирали кровь и мочу. Контролем служил материал от интактных морских свинок. Метод выделения ДНК, проведение ПЦР по оптимизированной нами схеме, бактериологический метод исследования органов описаны в главе "Материалы и методы" разд. 2.5., 2.7.3. и 2.7.4.
Время поведения ПЦР-анализа составило 5-6 часов от начала исследования. Учет результатов высева органов на эритрит агар проводили через 3-7 суток инкубирования. Для получения окончательного ответа посевы выдерживали в термостате при 37 С в течение 30 дней.
При исследовании методом ПЦР 135 образцов (суспензий органов, крови, мочи) от 15 морских свинок ДНК бруцелл выявлена в 66 пробах (48,8 %). Причем, положительные результаты реакции были получены при исследовании всех зараженных животных (100 %) (табл. 7). При ПЦР анализе суспензии печени ДНК бруцелл обнаружена в 46,6 % случаев, селезенки - в 66,6 %, легких - в 53 %, почек - в 40 %, паховых лимфатических узлов- в 60 %, парааортальных лимфатических уз лов - в 46,6 %, мьппечной ткани - в 53 %; в крови - в 53 %, в моче - 30 % (рис. 4). В ПЦР с суспензиями органов контрольных (интактных) морских свинок специфичный фрагмент ДНК выявлен не был (отрицательный результат). Более высокая диагностическая эффективность ПЦР-анализа достигалась при исследовании селезенки и паховых лимфатических узлов морских свинок, в то время как в мьппечной ткани и других органах, крови, моче ДНК бруцелл выявлена в меньшем проценте случаев.
При бактериологическом исследовании органов и тканей зараженных морских свинок, проводившемся одновременно с ПЦР, бруцеллы обнаружены только в 12 из 135 взятых для анализа биологических образцов (8,9 %) и только у восьми из 15-ти животных (в 53 % случаев). Культуры возбудителя бруцеллеза на 3-7 сутки от начала исследования выделены из паховых, парааортальных лимфатических узлов и селезенки (в 33,3 %, 20 % и 26,6 % случаев соответственно), что также указывает на преимущественную локализацию бруцелл в этих органах. Следовательно, полученные с помощью ГЩР и бактериологического метода данные согласуются с результатами вышеуказанных работ по изучению патогенеза бруцеллезной инфекции. В то же время с помощью ГЩР в нашем эксперименте возбудитель бруцеллеза из селезенки и лимфатических узлов удавалось выявлять, соответственно, в 2,5 и 2 раза чаще, чем при бактериологическом исследовании. Кроме того, специфичная ДНК, при отрицательных результатах бактериологического анализа, обнаружена в моче, крови и мышечной ткани, почках и легких, что свидетельствует о более высокой эффективности полимеразной цепной реакции по сравнению с культураль-ным методом.
Сравнительное изучение данных по выявлению бруцелл при заражений; морских свинок различными видами возбудителя показало, что больше всего положительных ответов получено при исследовании в ГЩР суспензий органов животных, зараженных вирулентными штаммами В. melitensis и В. suis (табл. 7). Индекс выявляемое (ИВ) для используемых штаммов, составил (0,53±0,074) и (0,58±0,073) соответственно. Несколько ниже этот показатель оказался для штаммов В. abortus (0,4±0,073). Следует отметить, что и культуры бруцелл в большем проценте случаев были выделены от животных, зараженных видами В. suis и В.melitensis.
![Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс]](/i/i/4289/212277.png "Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс] Тучков Игорь Витальевич")
