Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 5
Глава 1. СОВРЕМЕННЫЕ АСПЕКТЫ ЦИРКУЛЯЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЛАЙМ-БОРРЕЛИОЗА
(Обзор литературы) 12
1.1. Характеристика возбудителя Лайм-боррелиоза и
его распространение 12
1.2. Лабораторная диагностика Лайм-боррелиоза 19
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 33
2.1. Материалы 33
Клинический и полевой материал 33
Штаммы и антигены микроорганизмов 33
Биологическое сырье 33
Диагностические тест-системы, использованные
при проведении лабораторных исследований 33
2.1.5. Оборудование и аппаратура 34
2.2. Методы исследования 35
Подготовка клещей для исследования методом ОТ-ПЦР 35
Подготовка суспензий клещей для исследования методом ИФА 36
Выделение иммуноглобулинов 36
Методы контроля специфичности и активности антигенов и сывороток 37
Получение и контроль иммуноферментных конъюгатов 37
Физико-химические методы 37
Лиофилизация биологического материала 38
Методы математической и статистической обработки полученных результатов 38
Глава 3. ИЗУЧЕНИЕ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ВОЗБУ
ДИТЕЛЯ ЛАЙМ-БОРРЕЛИОЗА В
СТАВРОЛЬСКОМ КРАЕ 40
3.1. Ландшафтно-географическая и природно-
климатическая характеристика Ставропольского
края 40
Видовой состав, распространение и численность
3.2. иксодовых клещей 44
Зараженность возбудителем Лайм-боррелиоза ик-
3.3. содовых клещей на территории Ставропольского
края 48
Клещевые микст-инфекции (Лайм-боррелиоз и
3.4. клещевой энцефалит) в Ставропольском
крае, 55
Зараженность возбудителем Лайм-боррелиоза диких и сельскохозяйственных животных 58
Инфицированность боррелиями людей в Ставропольском крае 61
Глава 4. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЭКСПРЕССНЫХ
МЕТОДОВ ИНДИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ
ЛАЙМ-БОРРЕЛИОЗА ПУТЕМ РАЗРАБОТКИ
ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ С
МАГНИТНЫМИ СВОЙСТВАМИ И КОНСТ
РУИРОВАНИЯ ТЕСТ-СИСТЕМ 69
Получение боррелиозного лигнинсодержащего алюмосиликатного магноиммуносорбента и его характеристика 69
Разработка метода селективного концентрирования возбудителя Лайм-боррелиоза на магноим-муносорбенте с последующей постановкой ИФА 76
4.2.1. Разработка биотехнологии изготовления экспе
риментальной диагностической иммунофермент-
ной тест-системы для выявления антигена возбу
дителя Лайм-боррелиоза 19
4.3. Разработка и проведение сочетанного метода
МИС + ОТ-ПЦР для индикации возбудителя
Лайм-боррелиоза 90
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 96
ВЫВОДЫ 112
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 114
ПРИЛОЖЕНИЯ
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ
Введение к работе
Актуальность проблемы. Лайм-боррелиоз или иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ), является наиболее распространенной зоонозной природно-очаговой инфекцией, связанной с клещами рода Ixodes. Возбудителями Лайм-боррелиоза (ЛБ) являются спирохеты, входящие в комплекс Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.) (Караваев B.C., Иванов И.Д., Рябченко A.B., Беклемишев А.Б., 2008).
Лайм-боррелиозы широко распространены в Скандинавии и странах центральной Европы (Berglund J., Eitrem R., Ornstein К. et al., 1995; Golde W.T., Robinson-Dunn В., Stobierski M.G. et al., 1998; Huppertz H.I., Schmidt H., KarchH., 1993).
На территории Российской Федерации располагается большая часть мирового ареала иксодовых клещевых боррелиозов (Горелова Н.Б., Корен-берг Э.И. и др., 2001; Коренберг Э.И., 2002; Коренберг Э.И., 2003; Скачков М.В., Яковлев А.Г., Плотникова О.А. и др., 2007; Алешковская Е.С., Благов Н.А., Дружинина Т.А., Шалепо Е.В., 2008; Гапонов СП., Транквилевский Д.В., 2008; Семенкова Л.О., Буренкова Л.А., Лопатина Ю.В., Наумов Р.Л., 2008).
Исключением не является и Южный федеральный округ Российской Федерации (Пашанина Т.П., Смелянский В.П., Ткаченко Г.А. и др., 2008; Кормиленко И.В., Москвитина Э.А., Пичурина Н.Л., Бабич М.А., 2008; Котти Б.К., Заикина И.Н., 2008).
Как указано в Государственном докладе «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2005 г.», заболеваемость болезнью Лайма возросла в Российской Федерации в 2005 г. по сравнению с предыдущим годом на 16,8 %.
В 2007 году в 65 субъектах Российской Федерации зарегистрированы
2359 случаев заболеваний ЛБ (показатель заболеваемости составил 1,65 на 100 тыс. населения), что на 4, 47% больше, чем в 2006 году (2258 случаев).
В России ЛБ связан, в основном, с двумя геновидами боррелий — В. ga-rinii и В. afzelii, которые являются основными сочленами боррелиозных пара-
6 зитарных систем (Иванов И.Д., Беклемишев А.Б., 2002; Кулябина И.Б., Коренберг Э.И., 2007).
Попытка изучения зараженности иксодовых клещей возбудителем Лайм-боррелиоза на территории Ставропольского края была предпринята в 1996 г. (Котти Б.К., Гудиев О.Ю., 1997). С тех пор исследования в данном направлении не проводились.
Однако, многообразие ландшафтно-географических зон, климатические условия, а также широкое распространение и высокая численность иксодовых клещей и их прокормителей способствуют возможности регистрации Лайм-боррелиоза на территории Ставропольского края.
Поскольку болезнь Лайма протекает с поражением различных органов и систем человека, характеризуется склонностью к хроническому и латентному течению, её называют «великим имитатором» различных человеческих болезней (Деконенко Е.П., Уманский А.Г., Вирич И.Е. и др., 1995). В связи с этим, лабораторные исследования являются весьма важным звеном в диагностике этой инфекции. Однако главной проблемой при этом является большое количество ложноотрицательных и ложноположительных результатов, обусловленных часто ничтожно малым количеством Borrelia burgdorferi s.l. в исследуемом материале и присутствием загрязнений различного характера, мешающих протеканию индикационных реакций (Тихвинский М.С., Воробьев А.А., Яснов С.Н. и др., 1997; Нефедова В.В., Коренберг Э.И., Нестеренко Л.Н. и др., 2001; Goodman J.L., Jurkovich P., Kramber J.M. et al., 1991 и др.). По оценкам ряда специалистов, значительная часть случаев заболевания ЛБ остается не выявленной, что связано с наличием региональных различий боррелиозных паразитарных систем, с особенностями эпидемического проявления и клинико-патогенетическим своеобразием инфекции (Коренберг Э.И., 1997). В связи с этим, решение задач, связанных с изучением распространения возбудителя ЛБ на территории Ставропольского края, разработкой диагностических тест-систем и совершенствованием экспрессных методов
его индикации с целью повышения их чувствительности и специфичности, являются своевременными и актуальными.
Цель работы: изучение распространения возбудителя Лайм-боррелиоза Borrelia burgdorferi sensu lato на территории Ставропольского края и совершенствование лабораторных экспрессных методов его индикации в полевом материале.
Основные задачи исследования:
Определить зараженность иксодовых клещей, диких и домашних животных возбудителем Лайм-боррелиоза на территории Ставропольского края.
Провести серологическое исследование сывороток крови населения Ставропольского края на наличие специфических антител к возбудителю Лайм-боррелиоза.
Провести исследования, направленные на выявление микст-зараженности иксодовых клещей возбудителями Лайм-боррелиоза и клещевого энцефалита.
Разработать биотехнологию изготовления экспериментальной диагностической иммуноферментной тест-системы для обнаружения антигена возбудителя Лайм-боррелиоза.
Разработать метод селективного концентрирования возбудителя Лайм-боррелиоза на сконструированном магноиммуносорбенте с последующим проведением ИФА и ПЦР.
Изучить диагностическую ценность разработанных экспрессных лабораторных методов при исследовании на Лайм-боррелиоз полевого материала, собранного на территории Ставропольского края.
Научная новизна работы.
На территории Ставропольского края впервые обнаружена инфициро-ванность возбудителем Лайм-боррелиоза иксодового клеща D. marginatus, диких и сельскохозяйственных животных; установлена микст - инфициро-ванность лесного клеща I. ricinus возбудителями Лайм-боррелиоза и клеще-
вого энцефалита; у населения края выявлены специфические антитела к возбудителю ЛБ, что свидетельствует о его распространении на данной территории.
Разработана биотехнология изготовления экспериментальной диагностической иммуноферментной тест-системы для обнаружения антигена возбудителя ЛБ.
Научно-методические разработки использования МИС с последующим проведением ИФА и ГЩР дополняют новыми научными данными сведения о возможности применения иммобилизованных систем, способствующих стабильности, повышению чувствительности методов и проведению эффективной индикации возбудителя ЛБ в биологическом материале.
Практическая значимость работы. Установление распространения возбудителя Лайм-боррелиоза на территории Ставропольского края является основой для разработки комплекса мероприятий по эпидемиологическому и эпизоотологическому мониторингу, диагностике и профилактике ЛБ.
Полученные данные ориентируют клиницистов Ставропольского края на выявление случаев заболевания населения этой инфекцией.
Применение высокочувствительных МИС в сочетании с экспрессными лабораторными методами (ИФА и ПЦР) позволяет сократить время проведения исследований с 20-21 часа до 1-3 часов за счет ускорения манипуляций и исключения ряда этапов в ходе анализов, повысить выявляемость возбудителя ЛБ в полевом материале более чем в два раза.
Показаны преимущества сочетанных методов МИС+ИФА и МИС+ПЦР перед традиционными методами индикации возбудителя ЛБ при апробации в лабораторных и полевых условиях.
Материалы научных разработок легли в основу двух методических рекомендаций «Применение магнитных иммуносорбентов для селективного концентрирования возбудителя Лайм-боррелиоза с последующей постановкой иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией», утвержденных директором СтавНИПЧИ (протокол Ученого
совета СтавНИПЧИ №4 от 30.05. 2008 г.); «Выявление возбудителя Лайм-боррелиоза в полевом материале с применением магноиммуносорбентов», утвержденных директором СтавНИПЧИ (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ №7 от 31.10. 2008 г.).
Материалы диссертации используются на курсах специализации врачей по экспресс-диагностике Лайм-боррелиоза в ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотреб-надзора.
Основные положения, выносимые на защиту:
Зараженность возбудителем Лайм-боррелиоза иксодовых клещей, инфицированность диких и сельскохозяйственных животных, заболеваемость людей и наличие иммунной прослойки среди населения свидетельствуют о распространении возбудителя ЛБ на территории Ставропольского края.
Разработанная биотехнология изготовления экспериментальной диагностической иммуноферментной тест-системы позволяет выявлять антиген возбудителя Лайм-боррелиоза в полевом материале.
Селективное концентрирование возбудителя ЛБ путем применения сконструированных микрогранулированных лигнинсодержащих сорбентов с магнитными свойствами позволяет максимально сконцентрировать патоген в исследуемом материале, что позволяет увеличить чувствительность методов на несколько порядков по сравнению с традиционными ИФА и ПЦР.
Разработанные сочетанные методы МИС+ИФА и МИС+ПЦР могут использоваться при проведении микробиологического мониторинга природного очага с целью изучения распространения возбудителя ЛБ.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на VII Межгосударственной научно-практической конференции государств — участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств - участников содружества Независимых Государств» (Оболенск,
3-5 октября, 2006); научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (Ставрополь, 2007); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); IX Межгосударственной научно-практической конференции государств - участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств — участников содружества Независимых Государств» (Волгоград, 30 сентября — 2 октября, 2008); научной конференции лабораторий и отделов Ставропольского научно-исследовательского противочумного института Роспотребнадзора (Ставрополь, 2008).
Публикации. Основное содержание диссертации, выполненной в рамках НИР «Совершенствование эпидемиологического и эпизоотологиче-ского мониторинга за лихорадкой Западного Нила, геморрагической лихорадкой с почечным синдромом и клещевым боррелиозом в Ставропольском крае (№ Госрегистрации 01.200.7.00925)» и научной школы: Обеспечение эпидемиологической безопасности населения страны за счет создания различных иммобилизованных систем нового поколения (магнитоуправляемые диагностикумы и липосомальные лекарственные препараты направленного действия) по гранту Президента Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ Российской Федерации, НШ-2486.2008.7 в рамках научной темы «Создание твердофазных магнитоуправляемых тест-систем, обеспечивающих эффективный мониторинг за возбудителями опасных бактериальных и вирусных заболеваний», отражено в 16 опубликованных научных работах, в том числе 3 работы - в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 140 страницах компьютерного текста; состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, приложения; иллюстрирована 12 таблицами и 18 рисунками. Список литературы включает 202 источника, из них 145 - отечественных и 57 - зарубежных.
Похожие диссертации на Распространение возбудителя Лайм-боррелиоза в Ставропольском крае и совершенствование методов его индикации
