Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 9
1.1. Сальмонеллез. Распространение и лабораторная диагностика II
1.2. Колибактериоз 20
1.3. Таксономия кишечных бактерий 27
Глава 2. Материал и методи исслещования 35
Глава 3, Пути конструирования эритровдтарных антителъных диашостикумов . 41
Глава 4 . Диашостияеские возможности серологических реакций с эритроцитарными иммунореагентами 54
4.1. Сравнительная оценка реакций, основанных на феномене пассивной агглютинации, для индикации антигенов 54
4.2. Применение эритроцитарных диагностикумов при серологическом обследовании животных 69
Глава 5. Совершенствование методов таксоюмическ0іо изучения энтеробактерий 79
5.1. Идентификация энтеробактерий с помощью перфо-картного определителя 79
5.2. Серологическое типирование эшерихий 91
5.3. Подборка оптимального варианта составления поливалентных сывороточных препаратов с целью конструирования диагностической рапид-системы сальмонелл редких групп 93
5.4. Составление алфавитного указателя рода salmonella 102
Заключение 104
Выводы 116
Литература 118
- Сальмонеллез. Распространение и лабораторная диагностика
- Таксономия кишечных бактерий
- Сравнительная оценка реакций, основанных на феномене пассивной агглютинации, для индикации антигенов
- Идентификация энтеробактерий с помощью перфо-картного определителя
Введение к работе
Единство экологической системы, представленной цепью человек - животное - окружающая среда, диктует настоятельную необходимость объединения усилий ветеринарных и медицинских служб при разработке ряда мероприятий общебиологического профиля. Для решения этой актуальной задачи Министерством здравоохранения, Министерством сельского хозяйства и Восточным отделением ВАСХНИЛ от 22 мая 1981 года был издан приказ, предусматривающий дальнейшее улучшение эффективности сотрудничества между данными ведомствами, с целью реализации широкой Международной программы, разработанной ВОЗ, по охране здоровья населения от заболеваний, в первую очередь от зоонозов.
Следует отметить, что в настоящее время насчитывается около 190 заболеваний, общих для человека и животных. Среди возбудителей данных заболеваний немаловажное значение принадлежит Представителям семейства Enterobacteriaceae , объединяющим микроорганизмы, которые обладают, как правило, широкой видовой патогенностью, вызывают у животных и человека самые разнообразные патологические процессы. Заболевания, обусловленные этими видами бактерий, в ряде случаев характеризуются тяжелым течением, высокой летальностью и наносят ощутимый ущерб народному хозяйству страны.
Особенностью представителей кишечных бактерий является общность ряда морфологических, культуральных и биохимических признаков. В составе их клеточной оболочки выявлен гаптен, входящий в антигенную структуру всех кишечных бактерий. Вследствии этого номенклатура, таксономия и индикация энтеро-бактерий представляет значительные трудности.
Среди всего семейства кишечных бактерий особо следует выделить представителей рода salmonella . Продолжающийся рост сальмонеллезных заболеваний.привлекает в последние годы все более пристальное внимание специалистов во многих странах мира. Так, Г.Зейдель (1969) рассматривает сальмонел-лезы, как проблему мирового здравоохранения. По его данным, опасность этой инфекции усугубляется для человека тем обстоятельством, что многие бактерии этой группы не вызывают у животных остропротекающих инфекций. Последние переболевают латентно, без существенных изменений в паренхиматозных органах и продукты, получаемые от них, поступают в реализацию без ограничения. Этому способствует и то обстоятельство, что в производственных лабораториях не проводится серологическая идентификация сальмонелл редких групп, способных вызывать в отдельных случаях заболевания у животных и представляющих реальную угрозу для здоровья людей.
Немаловажная роль в патогенезе заболеваний отводится и эшерихиозным бактериям. В настоящее время известно значительное число идентичных для человека и животных патогенных серо типов Е. coli. диагностика сальмонеллезной и колибактериозной инфекции сопряжена с рядом трудностей из-за высокой вариабельности культурально-биохшичбских признаков этих бактерий. В настоящее время индикация кишечных бактерий у животных, как правило, ограничивается использованием бактериологического метода. Поэтому совершенствование известных методов лабораторной диагностики и изыскание новых эффективных способов, позволяющих в короткие сроки проводить индикацию и таксономическое изучение кишечной группы бактерий, является весьма актуальной задачей. Одним из важных путей совершенствования индикации энтеробактерий является разработка перспективных способов экспресс-диагностики, основанных на применении эрит-роцитарных иммунореагентов, а также оптимизация таксономического изучения выделенных микроорганизмов,
В соответствии с изложенным целью настоящего исследования явилась разработка рациональных путей серологической экспресс-диагностики и оптимизация приемов таксономического изучения энтеробактерий.
При этом, теоретическими задачами явились:
1. Научное обоснование оптимальной схемы экспресс-индикации кишечных инфекций на основе эритроцитарных иммунореагентов.
2. Оптимизация системы таксономического изучения энтеробактерий, путем совершенствования как самого процесса, так и способов обработки полученных данных.
Задачи практического характера, поставленные в работе сводились к следующему:
1. Изучить возможности приготовления эффективных эритроцитарных антительных диагностикумов для серологической экспресс-индикации сальмонелл и эшерихий.
2. Изыскать рациональные схемы экспресс-индикации сальмонелл и эшерихий с помощью эритроцитарных антительных и антигенных иммунореагентов.
3. Изучить и рекомендовать оптимальный способ ручной обработки данных таксономического изучения энтеробактерий с помощью перфокартного определителя.
4. Дать сравнительную оценку различных диагностических рапид-систем, предназначенных для серотипизапди энтеробактерий, и на основе оптимального варианта составить О-сывороточную рапид-систему сальмонелл редких групп.
Особенностями методического подхода являются комплексный характер экспериментов, позволяющий оценить диагностические возможности различных методов экспресс-индикации; широкий набор реакций, применяемых для экспресс-индикации, что позволяет определить и рекомендовать оптимальные пути серологической диагностики; использование нового приема экспресс-индикации, позволяющего проводить поиск энтеробактерий без применения эрит-ропитарных диагностикумов, а также ускорить идентификацию возбудителя инфекции.
Научная новизна:
1. Впервые дана комплексная оценка диагностических возможностей различных вариантов реакций, используемых для экспресс-индикации сальмонелл и эшерихий, с применением антигенных и антительных эритроцитарных иммунореагентов.
2. Разработан новый принцип экспресс-индикации сальмонелл и эшерихий при использовании комплексных антительных диагностикумов с помощью многокомпонентной реакции - подавления пассивной гемагглютинации.
3. Разработаны оптимальные варианты ручной обработки данных при таксономическом изучении энтеробактерий с помощью перфокартного определителя и серологической идентификации редких групп с помощью рапид-систем.
4. Апробировано использование сывороточных рапид-систем в многокомпонентных серологических реакциях с применением поливалентных эритроцитарных иммунореагентов.
В работе защищаются следующие основные положения:
1. При индикации сальмонелл и эшерихий у животных наибольшая результативность (частота получения положительного анализа) отмечена при использовании РПГА с антитедьными ди-агностикумами и РШГА с антигенными, по сравнению с бактериологическим методом.
2. При обследовании животных на сальмонеллез и эшерихиоз необходимо комплексное использование методов экспресс-индикации антигенов (РПГА и РТПГА) в сочетании с определением уровня гомологичных антител.
3. Новый принцип использования комплексных антительных диагностикумов повышает чувствительность многокомпонентных реакций, основанных на нейтрализации, до уровня РПГА и способствует большей специфичности при исследовании, благодаря взаимному одновременному контролю результатов реакции в нес-колькох рядах.
4. Применение перфокартного определителя энтеробактерий облегчает работу бактериологов и способствует сокращению сроков постановки бактериологического диагноза.
5. Применение рапид-системы позволяет ускорить идентификацию энтеробактерий. При сопоставлении различных вариантов составления рапид-систем, наиболее перспективными являются биномные комплексные диагностические сыворотки.
Практическая ценность:
1. Модификация второго варианта торможения пассивной геммагглютинации значительно повышает диагностические возможности антигенных эритрощтаршх диагностикумов.
2. Разработанный новый принцип использования комплексных антительных диагностикумов в многокомпонентной реакции, повышает чувствительность и специфичность индикации антигенов.
3. В результате широкой сравнительной оценки диагностической ценности различных серологических реакций (три варианта РИГА, ШГА, РОСА и РШЗГ) рекомендованы оптимальные схемы применения эритроцитарных диагностических иммунореагентов при индикации сальмонелл и эшерихий.
4. Усовершенствованный перфокартный определитель энтеро-бактерий, предназначенный для широкого круга бактериологов, позволяет значительно ускорить и упростить постановку бактериологического диагноза.
5. С помощью феномена пассивной гемагглютинации усовершенствован способ серотипирования эшерихиозных культур, сокращающий продолжительность типирования и способствующий более экономному расходованию диагностических препаратов.
6. Разработанная оптимальная сывороточная рапид-система для индикации сальмонелл редких групп, создает благоприятные условия для ее внедрения в биофабричное производство.
7. Составленный алфавитный указатель антигенной диагностической схемы Кауфмана-Уайта (рода Salmonella), является дополнением к определителю Bergey (1974) и предназначен для облегчения работы с литературными источниками.
Сальмонеллез. Распространение и лабораторная диагностика
Род salmonella известен как самый представительный В Обширном семействе Enterobacteriaceae . ИНТврвС К СаЛЬМО неллезам обусловлен их значительной ролью в этиологии заболеваний людей и сельскохозяйственных животных, широким распространением среди объектов окружающей среды (А.М.Ахмедов, 1971; И.С.Загаевский, А.ЛЛрницкий, 1977; В.А.Арбузова, 1978; Б.А. Матвиенко, 1982; Р.КовН С COaBT., 1980; L.Le Minor, 1980).
Следует отметить, что число заболеваний сальмонеллезами людей, домашних животных и птщ за последние 25 лет возросло в 7-9 раз (Г.К.Ковалев, 1982). Большое значение в распространении сальмонеллезной инфекции принадлежит животным-бактерионосителям (Й.А.Бакулов, М.ГЛаршис, 1971; E.Hess , 1979), которые могут явиться носителями серо типов, имеющих важное эпидемическое значение (В.М.Жцанов, 1964; Г.Зейдель, 1969; К.Д. Пяткин, 1971; П.В.Каймакан с соавт., 1974; H.Pivnick, 1978).
Рост сальмонеллеза среди людей в экономически развитых странах связан с переводом животноводства на промышленную основу (И.В.Іфгр, 1970; АіА.Сидорчук, 1978; w.Thiel, 1969; L.Le Minor, 1980). По наблюдениям H.Pivnick 1978), частота обнаружения сальмонелл в тушках птиц достигает 35-40$, при этом инфицирование людей серотипами сальмонелл, которые выделены и у птиц, составляет 85-90$. Обследование поголовья птиц, выращенных в условиях промышленных комплексов, а также обслуживающего персонала показало, что зараженность сальмонеллезом кур составила 17,5$, уток - 13,0$, а персонала - до 10,5$ (Й.М.Ясутис, 1980).
При обследовании животноводческих хозяйств отмечена значительная обсемененность сальмонеллами свиней - от 6,6 до 21,5$ (А.С.Маркявичус, И.Ф.Кяушас, 1972; c.Berbinschi, 1982), овец - до 8С$ при инфекционных абортах и около 4,7$убоЙНЫХ ОВЄЦ ( D.Kane, 1979;J.Nicolas,1980 ). ВЫСОКИЙ Процентвыделения сальмонелл установлен среди птиц (И.С.Загаевский, 1980; G.Muller,1965;Y.Lecerf, 1979 ), Лошадей ( D.Geblons, 1980), пушных зверей ( A.Kopczewski,,et ai., 1981 ). Показана значительная обсемененность бактериями рода сальмонелла разнообразных насекомых, моллюсков, рыб, черепах, лягушек, ящериц, змей (В.М.Йданов, 1964; И.В.Щур, 1970; Г.П.Калина, 1978). Обнаружение от I до 12$ проб, инфицированных сальмонеллами, при исследовании в очагах чумы различных грызунов, блох и клещей с этих животных (А.Алимходжаев, И.Борисов, 1980), а также циркуляция возбудителя среди диких зверей и птиц позволяет рассматривать сальмонеллез как природно-очаго-вуга инфекцию (А.А.Волкова, Ф.М.Шимиев, 1979).
Широкое распространение сальмонеллеза среди людей отмечено в многочисленных работах отечественных и зарубежных авторов (В.М.Дцанов, 1964; А.Ф.Блюгер с соавт., 1975; К.А.Костина, М.А.Црй, 1980; Н.й,Лебедев, 1980; b.Le Minor, 198О; Bull. World., 1980).
Особенностью сальмонеллеза является возможность его возникновения в виде вторичной инфекции, развивающейся на фоне какого-либо патологического процесса (Б.М;Емельянов с соавт., 1975, 1976), осложняющего этот процесс (А.А.Поляков, И.Г.Уса-чева, 1972; М.Н.Никонорова, П.Н.Никоноров, 1976; В.Н.Щеглова, 1980) и представляющего наибольшую опасность для людей, так как мясная продукция от животных с вторичными сальмонел-лезами, при отсутствии типичной клинической картины, допускается К ИСПОЛЬЗОВаНИЮ без ограничений (W.Thiel, 1969; J.Rankin, R.Taylor, 1970).
Сальмонеллбзная инфекция среди различных экологических групп животных распространена повсеместно, зачастую проявляясь в виде эпизоотии с большим процентом гибели животных, которая среди крупного рогатого скота достигает 15,6-27, , а у птиц - до 7С$ (Н.1.1анузаков с соавт., 1981).
Сальмонеллез у животных может вызывать преимущественное поражение желудочно-кишечного или респираторного тракта (A.M. Ахмедов, 1971), при этом экономический ущерб от переболевания одного теленка в раннем возрасте желудочно-кишечными болезнями составляет 133 руб. 20 коп., а респираторными - 143 руб. 80 коп. (П.И.Гончаров с соавт., 1981).
Сальмонеллезная инфекция наносит значительные социально-экономические потери. Так, средняя стоимость одного случая заболевания человека составляет 224 руб. 48 коп. (Эпидемиология и профилактика сальмонеллезов, 1977), а социально-экономический ущерб от сальмонеллеза только по одной Карагандинской области за 10 лет составил 8 млн. руб. (Н.І.Іанузаков с соавт., 1981).
Развитие эпидемиологического процесса при многих этиологических формах сальмонеллеза характеризуется определенной последовательностью - инфицирование и бактерионосительство у животных с последующим распространением заболевания среди людей (В.А.Арбузова, 1978а).
Клинические формы инфекции у каждого вида животных, как правило, вызываются единичными сероварами, подавляющее же большинство сальмонелл обуславливает у животных бессимптомное течение (Г.Зейдель, 1969). Наряду с этим бактерии данной группы способны вызывать у людей самые разнообразные патологические процессы (Бюллетень ВОЗ, 1980). В последние годы также участились случаи обнаружения у животных тех сероваров сальмонелл, в отношении которых до недавнего времени существовало убеждение, как о строго адаптированных лишь к организму человека (А. И. Алешин, 1978).
Рост заболеваемости сальмонеллезами способствовал увеличению числа изученных сероваров возбудителей. Так, из известных в мире около 2200 сероваров в СССР выявлено более 700, а в Казахстане более 100 (К.А.Костина, М.А.Цой , 1980), немаловажное значение среди которых принадлежит и сальмонеллам редких групп (А.Б.Любашевский с соавт., 1980).
Так, на долю сальмонелл редких групп, изолированных от человека, животных, птиц и объектов окружающей среды по отдельным регионам Казахстана, приходится от 2,2 до 14,9$ (Л.И.Носова с соавт., 1980; Й.М.Ясутис, 1980), а среди саль-монеллезных заболеваний у людей в Карагандинской области, в среднем, 7,3$ обусловлено сальмонеллами редких групп (А.Б. Любашевский с соавт., 1980). Установлена общность сероваров сальмонелл, выделяемых от людей и животных (А.Г.малявин с соавт. , 1974), в том числе и сальмонелл редких групп (Л.И.Носова с соавт., 1980). Сальмонеллы редких групд способны поражать внутренние органы, провоцировать аборты и приводить к недополучению ЖИВОТНОВОДЧеСКОЙ ПРОДУКЦИИ (P.Gaspar, 1979; Y.Lecerf, 1979; J.Harp, 1981).
Таксономия кишечных бактерий
В международном издании определителя бактерий Bergey (1974) Семейство Enterobacte-riaceae подразделено на 5 трибов и 12 родов, что явилось результатом накопленных в последние годы более полных сведений о биологических свойствах энтеробактерий (И.Н.Блохина, Г.Ф. Ливанова, 1976; А.П.Пехов, 1977; В.А.Арбузова, 1978; ь.т. Cocks, A.C.Wilson, 1973).
Число биохимических тестов, используемых для определения биохимической активности микроорганизмов непрерывно увеличивается (Н.А.Красильников, 1949; Н.С.Агре, Л.В.Калауцкий, 1972;R.R.Sokal, P.H.A.Sneath, 1963; V.B.D.Skerman, 1967; S.T.Williams et al., 1968; K.Yamada, K.Komagata, 1968; A.J.Cole, 1969; H.A. Lechevalier et al., 1970; I.Piotrowska-Plujska, 1971; Bergey, 1974), но несмотря на это дифференциация энтеробактерий, даже на крупные классификационные еденицы, представляет определенные трудности из-за большой их биологической близости (Ф.Кауфман, 1959; Е.Б.Ершова, 1970; И.В.Голубева с соавт., 1972; Г.П.Калина, 1973; Комплексные методы... , 1975; В.А.Арбузова, 1978).
Для облегчения идентификации энтеробактерий ранее были предложены многочисленные способы, основанные на использовании культурально-биохимических тестов. К способам первичной дифференцировки популяций микроорганизмов можно отнести трех-утлеводную среду с мочевиной, трехсахарный агар с железом, а также некоторые другие 2-4-компонентные среды (И.В.Голубе 28ва с соавт., 1972; Лабораторные исследования ... 1971; M.H.Finlayson, B.Gibbs, 1974; E.Engelbrecht, 1975)» G увеличением количества входящих в данные системы биохимических тестов возможность достижения уровня достоверности возросла до 95% (M.H.Finlayson, B.Gibbs, 1974).Наиболее часто в описанных системах используются следующие тесты: газообразование на глгокозе, окисление лактозы, продуцирование сероводорода, желатиназная и лизиндекарбоксилазная активность, окисление инозита, арабинозы и утилизация цитратов; несколько реже - продуцирование индола, реакция с метилрот, уреаз-ная активность и тест на подвижность (Г.П.Калина, 1978; В.Н. Савельев, 1978; Г.Константинов с соавт., 1982; F.J.s.Garsia et al., 1975; D.Branson, 1976; J.Reis, 1976; R.Gallien, M. Westphal, 1976).
Технические приемы, используемые для облегчения таксономического изучения микроорганизмов в свою очередь подразделяются на приемы с использованием числового кода (Н.М.Надиро-ва, 1970; Г.Шдєгель, 1972; Г.П.Калина, 1973; В.Курылович, А. Пашкевич, 1974; В.Г.Финн, В.И.Чаус, 1976; В.А.Романовская, 1981, 1981а), основанные на принципах классификации Адансона (M.Adanson, 1757, 1763); на приемы с использованием вспомогательных средств для ручной обработки информации (В.Рарр, 1973; В.Рарр, B.Lanyi, 1975), а также компьютеров и ЭВМ (Н.Н. Айзенберг с соавт., 1974; С.В.Ковалиу, 1976; В.Г.Финн, В.И. Чаус, 1976; В.А.Романовская, 1981; R.W.Wilcox et al., 1980; D.Iones, M.I.Sackin, 1980). Самым доступным из описанных методов является использование вспомогательных средств, предназначенных для ручной обработки информации. Однако предложенная для этих целей система логических карт С В.Рарр, 1973; В.Рарр, B.Lanyi, 1975 ) содержит в себе ряд отрицательных моментов, ограничивающих ее применение. К ним относится использование нестандартных перфокарт со специальной перфорацией, многоэтапность поиска, который поочередно следует проводить на нескольких картах: моделирующих переменные, запоминающих и специальных картах. Кроме того, при работе с ними необходимо знать элементы высшей математики (минтеры, конъюкции, дизюкции, булевые функции и др.). Все это диктует необходимость поиска более простых рациональных способов, предназначенных для таксономического изучения кишечных бактерий, доступных для широкого практического использования.
Основным методом внутривидовой дифференциации эшерихий является серологический (Я.Е.Коляков, 1970). Серологическое типирование эшерихий основано на анализе трех антигенов: 0-со МатИЧесКОГО, К-КаПСуЛЬНОГО И Н-ЖГУТИКОВОГО ( S.Tzxpori,1981 )У кишечной палочки распознано более 150 вариантов О-антигена, 90 - К-антигена, 50 - Н-антигена, что позволяет разделить вид на сотни разновидностей и тысячи серологических типов, содержащих различные сочетания 0-, К-, Н-аНТИГеНОВ (Bergey, 1974).
Возбудителями эшерихиозов являются энтеропатогенные серо-группы эшерихий, которых выявлено более 40 (Д.А.Якобсон с со-авт., 1979). В практических лабораториях бактериологическая диагностика эшерихиозов осуществляется с помшцью коммерческих агглютинирующих 0-сывороток к энтеропатогенным кишечным палоч зокам 20-28 серогругаї (Наставление по применению... , 1974; Д.А.Якобсон с соавт., 1979).
Серотипирование инактивированных кипячением в течении I ч культур эшерихий проводят в два этапа - посредством РА на стекле для ориентировочного определения положительно реагирующих иммунных сывороток, а затем - развернутой пробирочной РА с типоспецифическими О-колисыворотками (Наставление по применению... , 1974). Причем, если для получения результатов на первом этапе серотипирования требуется 1,5-2,0 ч (включая кипячение культур, их центрифугирование и постановку РА на стекле), то на второй этап уходит в общей сложности 30-40 ч. При постановке пробирочной РА требуется повышенный расход сыворотки, а для учета пробирочной РА рекомендуется использование лупы или агглютиноскопа, так как почти бесцветный агглютинат плохо различим (Наставление по применению... , 1974).
Поэтому, поиск методов, позволяющих в более ранние сроки оеротипировать эшерихиозные культуры, снижающих расход иммунных сывороток и значительно улучшающих визуализацию реакции при учете результатов, является важным для практики.
Сравнительная оценка реакций, основанных на феномене пассивной агглютинации, для индикации антигенов
Сравнительная оценка реакций, основанных на феномене пассивной гемагглютинации, для индикации антигенов Известно несколько методов индикации антигенов с помощью эритроцитарных диагностикумов. Наиболее распространенными среди них являются реакция пассивной гемагглютинации (с антительными диагностикумами) и первый вариант реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА-І), иногда называемый реакцией нейтрализации антител. Кроме того, разработана реакция угнетения пассивной гемагглютинации с антительными диагностикумами (Б.В.Каральник с соавт., 1975), реакция расклеивания эритроцитов и реакция определения гаптена (Ю.В.Канатов,1974а,б). Однако эти методы не получили большого распространения ввиду значительных технических трудностей, а чувствительность их, по мнению авторов, соответствует таковой РТПГА-І.
В условиях производственного выпуска медицинской промышленностью антигенных сальмонеллезных диагностикумов и отсутствия антительных, реакция торможения пассивной гамагглютина-ции, выполняемая по первому варріанту, приобрела большое значение для индикации сальмонелл основных серогрупп у людей. Индикация антигенов возможна также с помощью еще одного варианта реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТЛГА-2). В связи с отсутствием до настоящего времени сравнительной оценки пригодности этих вариантов РТПГА для индикации сальмонелл и эшерихии, нами изучена в комплексных опытах чувствительность данных методов в сравнении с таковой, получаемой при использовании РПГА с антительными диагностикумами.
Для решения этой задачи в качестве антигенов использовали бактериальные диагностикумы производства Ташкенского ИВС с известной исходной концентрацией клеток, а для нейтрализации применяли гомологичные сальмонеллезные или эшерихиозные неадсорбированные сыворотки того же производства.
Результаты опытов (табл. 8) показали наибольшую эффективность индикации с помощью РПГА при использовании антительных диагностикумов. Минимальная определяемая доза бактериальных клеток с помощью реакции торможения пассивной гемагглютинации была в 3-Ю раз больше (Р 0,02), чем с использованием антительных диагностикумов.
Известна модификация РТПГА-2 (О.С.Гришина, 1967), которая заключается в следующем. Последовательные разведения иммунных сывороток готовят с помощью водно-солевого экстракта Таблица 8
Чувствительность индикации бактериальных антигенов с помощью РПГА и РТПГА Эритроцитарные диагностикумы Минимальная выявляемая доза бактериаль- клеток (млн/мл) с помощью методовисследуемого на антиген материала, а не 0,85#-ным раствором хлористого натрия, как обычно, и после экспозиции 30-40 мин вносят антигенный диагностшсум. Сравнительная чувствительность индикации антигенов, на примере бактериальных диагностикумов, с помощью трех вариантов РТПГА показала незначительное снижение (не более, чем в 1,5 раза) минимальных выявляемых доз бактериальных антигенов некоторых специфичностей. Недостатком этой модификации является необходимость разведения сыворотки отдельно для каждой испытуемой пробы материала. При этом могут появляться ложноположителыше результаты анализа - снижение титра РПГА по сравнению с контролем, не за счет присутствия в исследуемой пробе искомого антигена, а за счет возможных погрешностей при последовательных разведениях сывороток.
Следует отметить, что второй вариант РТПГА заключает в себе больше возможности модификаций, например, применение не двукратных разведений сывороток, а в соотношении 4:5 (В.И. Левенсон, А,П,Аллилуев, 1965). Однако такой способ разведения удлиняет обычный ряд в 3 раза. Нами разработана следующая модификация РШГА-2: разведения иммунных сывороток делают не двукратные, а только в 1,5 раза; при постановке в микротитрагорах к 0,025 мл иммунных сывороток следует добавлять двойную дозу исследуемого на антиген материала (0,05 мл). При этом серийные разведения иммунных сывороток необходимо делать одномоментно (в больших объемах), а затем каждое разведение закапывать микропипеткой в соответствующие ряды лунок. Это позволяет избежать погрешности в процессе приготовления идентичных разведений сывороток в нескольких рядах и значительно экономит время.
Проведенная широкая сравнительная оценка чувствительности индикации сальмонеллезных и эшерихиозных антигенов с помощью РИГА, а также обычных вариантов и модифицированной РШГА показала значительную эффективность антительных диагнос-тикумов (табл. 9). В РИГА определяется от 50 до 800 тыс. бактериальных клеток/мл (в зависимости от специфичности), что в 5 и более раз чувствительнее, чем с помощью РШГА,
Наиболее эффективным путем использования антигенных ди-агностикумов с целью индикации бактериальных клеток сальмонелл и эшерихий была модификация второго варианта РШГА. С помощью таких диагностикумов определяли от I до 5 млн микробных клеток/мл. Ни в одном случае использования РШГА-І чувствительность индикации сальмонелл и эшерихий не была выше, чем по второму варианту, и тем более по модифицированной РШГА-2
Идентификация энтеробактерий с помощью перфо-картного определителя
Попытки усовершенствовать идентификацию кишечных бактерий предпринимались и ранее, но из-за сложности подходов (использование машинной техники, числового кода и др.) они не нашли широкого применения. Вместе с тем многие из предложенних ранее методов морально устарели ввиду постоянного выявления новых признаков энтеробактерий и введения соответствующих диагностических тестов, а также уточнения ранее известных культурально-биологических характеристик. И, наконец, за последнее время произошли существенные изменения, связанные с систематикой кишечных бактерий. Все это послужило основанием для поиска методов, облегчающих работу по идентификации энтеробактерий.
С целью унификации таксономического изучения кишечных бактерий мы использовали перфокартами метод, предназначенный для ручной обработки информации. Благодаря дешевым рабочим инструментам и простому принципу работы картотеки из перфокарт позволяют за счет небольших материальных затрат и при значительной экономии времени обрабатывать, хранить, группировать и анализировать разнообразную информацию.
Перфокартный определитель позволяет по культурально-био-химическим признакам проводить идентификацию 31 представителя кишечных бактерий, в том числе у 4 энтеробактерий - до подрода, у 23 - до вида и у 4 - до подвида. Кроме того, в тексте содержится дополнительная информация о 13 видах эрви-ний, включенных в семейство кишечных бактерий впервые и выделяющихся преимущественно из растений. В таблице 18 отражено современное состояние систематики семейства энтеробактерий.
Идентификация выделенных штаммов основана на данных изучения культурально-биохимических признаков, которые в производственных лабораториях целесообразно проводить по минимальному набору тестов, позволяющему в болыпенетве случаев типи-ровать культурі до вида Эти тесты можно подразделить на 8 основных и 4 дополнительных. К основным тестам относятся газообразование на глюкозе, окисление лактозы, продуцирование сероводорода на трех-сахарном агаре с железом, желатиназная и лизиндекарбокеилаз-ная активность, окисление инозита, арабинозы и утилизация цитратов; к дополнительным - продуцирование индола, реакция с метилрот, уреазная активность и подвижность.
Обычно, проведение уже первых восьми тестов бывает достаточно, чтобы идентифицировать культуры до вида. В случав, когда выделенная культура после проведения минимального набора тестов не поддается типированию, необходимо на оставшихся после поиска перфокартах выявить несовпадающие признаки и по ним продолжить типирование штамма (подробнее об этом изложено ниже).
В научных учреждениях, где требуется более детальное таксономическое изучение культур, их типирование необходимо проводить по максимальному набору тестов, рекомендованных для семейства кишечных бактерий и обозначенных на кодовой карте определителя. При этом идентификацию микроорганизмов по предлагаемому определителю можно начинать с любого признака (теста).
Подготовка определителя к работе. Предварительно на всех перфокартах (за исключением кодовой, рис. I) необходимо аккуратно вырезать заштрихованные участки, по которым в дальнейшем будет производиться поиск информации описываемых видов бактерий. Края вырезов должны быть ровными с небольшим расширением в верхней части (рис. 2).
В определителе использовано два типа вырезов, позволяю ГЧ После того, как все вырезы сделаны, перфокарты в любой последовательности складывают в один массив. Ориентиром их правильного расположения является стандартный угловой срез. Поверх перфокартою массива помещается кодовая карта, на которой в алфавитном порядке расположены 50 культурально-биохи-мических признаков, используемых для таксономического изучения кишечных бактерий.
Принцип работы с определителем. После совпадения стандартного углового среза на всех перфокартах, определитель с наложенной поверх массива кодовой картой поворачивают вверх той стороной, по которой будет проводиться поиск информации.
Принцип, положенный в основу идентификации, заключается в следующем: если по исследуемому тесту получен положительный результат, то спица в перфокартном массиве вставляется в отверстие внешнего ряда (по периметру) напротив соответствующей записи в кодовой карте. При этом выпадают перфокарт ты, закодированные по данному тесту положительно и вариабельно, и дальнейшую идентификацию проводят с выпавшими перфокартами. При отрицательном результате спица вставляется в отверстие внутреннего ряда и все положительно закодированные по данному тесту перфокарты выпадают, а с отрицательными и вариабельными признаками остаются, и дальнейшую идентификацию проводят с перфокартами, оставшимися на спице. В результате проведения поиска остается только одна перфокарта, на которой приводится название типируемого штамма и дается его краткая характеристика.
Похожие диссертации на Совершенствование методов индикации и таксономии семейства Enterobacteriaceae
