Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Современное состояние лабораторной диагностики и пути расширения арсенала методов идентификации лептоспир 15
1.1 Распространение лептоспир, взаимодействие с факторами внешней среды и живыми организмами 15
1.2 Лабораторные методы выделения, культивирования и идентификации лептоспир 20
1.3 Методы получения и применения иммуносорбционных систем для выявления бактерий 34 Собственные исследования 42
Глава 2 Материалы и методы 42
2.1 Материалы 42
2.1.1 Штаммы микроорганизмов 42
2.1.2.Питательные среды и условия культивирования 42
2.1.3 Лабораторные животные 42
2.1.4 Клинический материал 47
2.1.5 Характеристика реагентов, используемых для получения иммуно-сорбентов 47
2.2 Методы исследования 47
2.2.1 Микроскопия лептоспир 47
2.2.2 Получение антигенных комплексов микроорганизмов 48
2.2.3 Иммунизация животных 48
2.2.4 Выделение иммуноглобулинов 49
2.2.5 Методы контроля специфичности и активности антигенов и сывороток 49
2.2.6 Получение иммунофлуоресцирующих конъюгатов 49
2.2.7 Экстракция фосфолипидов (ФЛ) 49
2.2.8 Получение и контроль липосом 50
2.2.9 Получение и контроль иммуноферментных конъюгатов 51
2.2.10 Физико-химические методы 51
2.2.11 Иммунохимические методы анализа 52
2.2.12 Лиофилизация биологического материала 52
2.2.13 Методы математической и статистической обработки материалов 52
Глава 3 Усовершенствование экспресс-диагностики лептоспирозной инфекции путем разработки иммобилизованных препаратов с магнитными свойствами и конструирования технических средств 54
3.1 Получение высокоспецифичной лептоспирозной сыворотки 54
3.2 Разработка лептоспирозных магноиммуносорбентных препаратов для выявления лептоспирозных антител, антигенов и компоновка тест-систем для выявления лептоспир 64
3.3 Мониторинг объектов внешней среды на наличие лептоспир с применением технических средств 74
Глава 4 Выявление лептоспир с использованием липосомально-иммунопероксидазного конъюгата и суспензионного диагностикума 79
4.1 Получение и тестирование лептоспирозного липосомально-иммунопероксидазного конъюгата 84
4.2 Получение суспензионного диагностикума и проведение анализа суспензионной агглютинации лептоспир 87
4.2.1 Получение суспензионного диагностикума 87
4.2.2 Проведение анализа суспензионной агглютинации лептоспир 92
Глава 5 Исследование клинического и полевого материала на наличие антител и антигена лептоспир 97
5.1 Изучение диагностической ценности предложенных тест-систем при исследовании клинического материала 97
5.2 Апробация разработанных тест-систем и технических устройств при исследовании полевого материала 105
Заключение
Выводы 126
Практические рекомендации 127
Список используемых источников 129
- Распространение лептоспир, взаимодействие с факторами внешней среды и живыми организмами
- Получение высокоспецифичной лептоспирозной сыворотки
- Получение и тестирование лептоспирозного липосомально-иммунопероксидазного конъюгата
- Изучение диагностической ценности предложенных тест-систем при исследовании клинического материала
Введение к работе
Наибольшую опасность в эпидемиологическом плане представляют, прежде всего, особо опасные и опасные инфекции, относящиеся преимущественно к карантинным и природно-очаговым болезням, такие как чума, сибирская язва, лептоспироз и др. [Онищенко Г.Г., 1999; 2001; 2002; 2006; 2007; Савченко СТ. с соавт., 2007].
Обстановка по лептоспирозу в мире продолжает оставаться неблагополучной, что обусловлено наличием природных и антропоургических очагов, а также формированием новых стойких очагов инфекции как в сельской местности, так и в городах [Ананьина Ю.В., 2001; Spenser L., 1992; Hansen G.R., Woodall J., Brown С, et al., 2001]. Ежегодно в России регистрируется до 2,5 тысяч заболеваний лептоспирозом [МУ 3.1.1128—02].
Проблема лептоспироза далека от своего окончательного решения, и нельзя исключить неожиданное обострение эпидемической обстановки на тех или иных внешне благополучных территориях. Лептоспирозы выделены комитетом экспертов ВОЗ из большого числа зоонозов как наиболее значимые в социально-экономическом отношении нозологические формы. Они наносят значительный материальный ущерб сельскому хозяйству и постоянно угрожают здоровью и жизни человека. Это связано с широкой распространенностью лептоспир на всех континентах, длительной выживаемостью их в абиотической среде и свойством поражать различные виды домашних и диких животных, которые затем служат источниками инфицирования людей.
Лептоспирозная инфекция занимает одно из первых мест среди зоонозов по тяжести клинического течения, частоте летальных исходов и отдаленных клинических последствий. При средних показателях летальности в стране 3-4,5 % на отдельных территориях, эндемичных по наиболее тяжелым формам, вызываемым лептоспирами серогрупп Icterohaemorrhagiae и Canicola, они достигают, а иногда и превышают 20 %.
Реальный уровень заболеваемости лептоспирозами значительно превышает регистрируемые показатели вследствие гиподиагностики, обусловленной низкой клинической выявляемостью больных и несовершенством методов и средств лабораторной диагностики [Онищенко Г.Г., 2006; Савченко СТ. с соавт., 2007].
Сохраняющаяся активность очагов лептоспирозов в Ставропольском крае [Ковалев Н.Г. с соавт., 2006] требует постоянного внимания со стороны санитарно-эпидемиологических служб и лечебно-профилактических учреждений, проведения комплекса профилактических и противоэпидемических мероприятий и обеспечения своевременной дифференциальной диагностики лептоспирозов у людей. В связи с тем, что клиническая дифференциальная диагностика лептоспирозов представляет значительные трудности из-за полиморфизма клинической картины, результаты лабораторного исследования являются решающими для подтверждения лептоспирозной этиологии заболевания.
В диагностике лептоспироза ведущее место принадлежит серологическим методам. Общепринятым стандартным тестом при исследовании сывороток крови является реакция микроагглютинации (РМА), использование которой связано с необходимостью поддержания большого количества штаммов лептоспир, относящихся к медленнорастущим и труднокультивируемым микроорганизмам. Выращивание лептоспир производится на дорогостоящих сывороточных средах.
Учет результатов реакции осуществляется путем микроскопии агглютинировавших живых культур в темном поле. Эти факторы ограничивают возможность внедрения РМА в широкую практику. С целью серологического скрининга и ранней диагностики лептоспирозов используется также реакция слайд-агглютинации, иммуноферментный анализ (ИФА) с родоспецифиче-скими антигенами лептоспир.
Существуют препараты для ПЦР-диагностики, но они отличаются значительной дороговизной и сложностью исполнения и поэтому широкого распространения не получили.
Среди способов диагностики инфекционных заболеваний особое место занимают иммуносорбционные, в основе которых лежит принцип аффинности, базирующийся на специфическом связывании антигенов с комплементарными антителами. Новым этапом усовершенствования общепринятых методов диагностики является разработка, освоение производства диагностических препаратов на основе магноиммуносорбентов [Саяпина Л.В. с соавт., 2007]. Их использование позволяет селективно концентрировать инфекционные агенты на поверхности сорбента, применять специальные технические средства, упрощающие проведение анализов, автоматизировать исследования.
В связи с этим, актуальным является совершенствование диагностических препаратов для быстрого выявления лептоспир, обладающих высокой специфической активностью, экспрессностью и информативностью. Внедрение в схему лабораторной диагностики и мониторинга природных очагов лептоспи-роза недорогих, чувствительных, специфичных препаратов и методов будет способствовать быстрой детекции возбудителя в биологическом и полевом материале, ранней постановке диагноза, организации и своевременному проведению адекватных противоэпидемических мероприятий.
Цель работы - повышение чувствительности и специфичности методов выявления лептоспир и антител к ним с использованием диагностических тест-систем на основе иммобилизованных препаратов.
Основные задачи исследования:
1. Усовершенствовать лабораторную диагностику лептоспироза путем использования высокоспецифичных сывороток крови, полученных методом иммуносорбции;
Разработать методы селективного концентрирования лептоспир на магноиммуносорбентах на основе полифепана, оксида железа с иммобилизованными антителами и технические средства для микробиологического мониторинга объектов внешней среды;
Усовершенствовать диагностические тест-системы для ИФА с использованием полученных липосомально-пероксидазных конъюгатов;
Разработать экспресс-методы и системы для выявления лептоспир с использованием суспензионного комплекса на основе алюмосиликата и флуоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ);
Изучить диагностическую ценность разработанных препаратов, технических средств и методов на экспериментальном, полевом и клиническом материале.
Научная новизна работы
Получены специфичные препараты путем проведения иммуносорбции неспецифических антител из иммунных лептоспирозных сывороток с использованием аффинных МИС, что позволило сохранить их первоначальную активность, упростить процесс сорбции. Усовершенствованы методы экспресс-диагностики (ИФА и количественного иммунофлуоресцентного анализа - КИФА) при выявлении лептоспир с применением разработанных высокочувствительных иммуносорбентных диагностикумов, превосходящих подобные препараты по доступности, экологической чистоте сырья, позволяющих сократить трудовые и материальные затраты при их изготовлении и постановке реакций.
Унифицированы методы исследования биологического материала, проб из объектов внешней среды большого объема (до 10 л), с высокой степенью загрязнения, низкой концентрацией возбудителя с применением разработанных технических средств и методических приемов по сочетанному применению селективного концентрирования лептоспир на МИС с после-
дующим проведением экспрессных методов (ИФА, КИФА). На установку для микробиологического мониторинга объектов водной среды получен патент РФ на полезную модель.
Осуществлена научная разработка получения липосомальных лептос-пирозных иммуноферментных конъюгатов, обладающих высокой чувствительностью и стабильностью. Впервые проведена научно-методическая разработка суспензионно-флуоресцентного диагностикума для выявления леп-тоспир в экспрессной реакции суспензионной агглютинации (РСА).
Научно-методические разработки сочетанных методов использования МИС с ИФА и КИФА дополняют новыми научными данными сведения о возможности применения иммобилизованных систем, способствующих стабильности, увеличению чувствительности методов и проведению эффективной детекции лептоспир в объектах внешней среды и биологическом материале.
Практическая значимость работы
Усовершенствованные ИФА и КИФА с применением полученных лептоспи-розных МИС в сочетании с разработанными техническими средствами позволяют выявить лептоспиры в объектах внешней среды, повысить чувствительность метода, сократить время анализа до 3 ч за счет ускорения манипуляций и исключения ряда этапов в ходе анализов, что в конечном итоге обеспечивает своевременное проведение адекватных противоэпидемических мероприятий. Применение разработанных аффинных сорбентов с магнитными свойствами обеспечивает эффективную иммуносорбцию неспецифических антител из сыворотки крови для получения высокоспецифичных препаратов.
Разработанные методологические подходы по ковалентной фиксации на поверхности мембраны липосом ферментов и лептоспирозных иммуноглобулинов позволяют повысить стабильность и в два раза увеличить срок годности диагностической системы без потери активности с сохранением каталитических свойств.
Предложен метод РСА на стекле с суспензионным диагностикумом, обладающий экономической эффективностью, экспрессностью и простотой, показано его преимущество перед традиционными методами детекции возбудителя при апробации в лабораторных и полевых условиях.
Материалы научных разработок легли в основу 3 методических документов, утвержденных на учрежденческом уровне внедрения: «Магноимму-носорбенты в микробиологических и клинических исследованиях» (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ № 9 от 27.10.05 г.); «Лабораторная детекция лептоспироза» (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ № 11 от 30.11.06 г.); «Конструирование липосом различного липидного состава для их направленной доставки в ткани и органы-мишени экспериментальных животных, оценка результатов с помощью радиоизотопного метода по удельной радиоактивности» (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ № 4 от 03.05.07 г.).
Утверждена нормативная документация (лабораторный регламент, инструкция по применению) на диагностикум суспензионный для выявления лептоспир в РСА (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ №1 от 25.01.07 г.). Материалы диссертации используются на курсах специализации врачей по экспресс-диагностике лептоспироза в ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора.
Основные положения, выносимые на защиту
Разработанные научно-методические подходы получения высокоспецифичных иммунных лептоспирозных сывороток для диагностических препаратов с применением аффинных МИС на основе полифепана и оксида железа обеспечивают сохранение их первоначальной активности, сокращение и упрощение всех этапов сорбции.
Селективное концентрирование лептоспир путем применения разработанных магноиммуносорбентных диагностических препаратов, тест-систем и технических средств увеличивает чувствительность методов на 2-3
порядка по сравнению с традиционными ИФА и реакцией иммунофлуорес-ценции (РИФ).
Метод ИФА с липосомально-иммунопероксидазным конъюгатом позволяет выявлять лептоспиры в концентрации 5х104-1хЮ5 микробных клеток (м.к.)/мл при отсутствии перекрестных реакций с гетерологичными штаммами. Стабильность и срок годности конъюгата увеличены в 2 раза по сравнению с традиционным иммунопероксидазным конъюгатом [Nakane Р.К., Kawaoi А., 1974] за счет иммобилизации на мембране липосом фермента и лептоспирозных иммуноглобулинов.
Высокая эффективность обнаружения антигена лептоспир в РСА достигнута при использовании суспензионно-флуоресцентного алюмосили-катного диагностикума. Разработанный диагностикум по чувствительности аналогичен традиционному методу РИГА, но превосходит по простоте изготовления и экспрессности (РСА 1-3 мин, а РИГА (макрометод) - 24 ч).
Разработанные диагностические тест-системы могут использоваться в ходе мониторинга объектов внешней среды с целью выявления и изучения циркуляции лептоспир, а также для лабораторной диагностики лептоспироза.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были представлены на III Российской конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (г. Новосибирск, 2006), на научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (г. Санкт-Петербург, 2006), на ежегодных научно-практических конференциях в ФГУЗ СтавНИПЧИ (2005-2007), на IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007), на VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные
правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах - участниках СНГ» (г. Саратов, 2007).
Публикации
Основные положения диссертации отражены в 17 опубликованных научных работах, в том числе одна работа - в издании, рекомендованном ВАК РФ, две - депонированы в ВИНИТИ.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованных источников. Работа изложена на 150 страницах компьютерного текста, содержит 16 таблиц и 17 рисунков. Список литературы включает 159 отечественных и 76 зарубежных источников.
Распространение лептоспир, взаимодействие с факторами внешней среды и живыми организмами
Контроль за инфекционными заболеваниями - стратегическая задача здравоохранения России в XXI веке [Онищенко Г. Г., 2002, 2003, 2004, 2006]. По определению ВОЗ [WHO Recommended Surveillance Standards, WHO, 2003], лептоспирозы относятся к зоонозам с мировым распространением; наиболее высокий уровень их эпидемического проявления отмечается в странах с влажным субтропическим и тропическим климатом. Заболеваемость характеризуется выраженной сезонностью и может проявляться в виде вспышек. Дикие и домашние животные многих видов служат источниками возбудителей лептоспир, относящихся к многочисленным сероварам [Леп-тоспироз животных, 2001; Spenser L., 1992]. Инфекция передается человеку посредством прямого контакта с мочой инфицированных животных или через объекты внешней среды, контаминированные мочой животных-лептоспироносителей (главным образом через воду, почву и растения). Тяжесть течения инфекции у человека варьирует от легких до летальных форм [Авдеева М.Г., Стриханова О.В., 2006]. Для лептоспироза одной из важнейших остается проблема гиподиагностики. Как показывает опыт, истинная заболеваемость многократно (до 10, а иногда и более раз) превышает регистрируемую. Одна из причин - низкий уровень обеспеченности лабораторной службы сертифицированными диагностическими препаратами нового поколения, в том числе предназначенных для ранней диагностики (ИФА, ПЦР и др.) [Калинин А. В. с соавт., 2002; Басель Б. с соавт., 2006]. Между тем, поздняя и тем более неверная постановка диагноза и, соответственно, несвоевременное и неадекватное лечение, могут привести к развитию хронических форм болезни и поздних осложнений [Лебедев В.В. с соавт., 2001].
Эпидемиологический надзор создает основу для разработки стратегии вмешательств, осуществляемых службами медицинского и ветеринарного здравоохранения. В последнее десятилетие в стране отмечается повышение эпидемической активности эпизоотических очагов, тенденция к росту забо леваемости людей лептоспирозами [Басель Б. с соавт., 2006]. В Российской Федерации ежегодно регистрируется в среднем от 1,5 до 2,5 тыс. заболеваний людей лептоспирозами. Более половины больных приходится на Северо ) Кавказский регион, преимущественно Краснодарский край [Калашни ков И.А. с соавт., 2006]. Высокий уровень заболеваемости отмечается также в Республиках Адыгея и Мордовия, Калининградской, Тульской, Вологодской, Ульяновской, Пермской, Ярославской областях, Алтайском крае и др. [Нафе-ев А.А., 2001, 2006; Салдан И. П. с соавт., 2001; Нагорнов Д. В. с соавт., 2002; Никишина Н. М. с соавт., 2002; Честнова Т. В., 2002; Савченко СТ. с соавт., 2007].
В.В. Бинатовой [1997] проведен эпидемиологический и эпизоотологи-ческий анализ заболеваемости лептоспирозом в Краснодарском и Ставропольском краях, выявивший тенденцию к многолетнему подъему заболеваемости, начиная с 1989 г. в Краснодарском и с 1994 г. в Ставропольском краях с преобладанием водного пути передачи инфекции.
В 2005 г были выявлены 74 больных в Ставропольском крае. В июле-августе в Красногвардейском районе развилась вспышка лептоспироза. Заболели 42 человека. Один случай заболевания у взрослого закончился летальным исходом. Вспышечная заболеваемость была обусловлена заражением реки Егорлык и левой ветви Право-Егорлыкского канала лептоспирами различных серогрупп при бесконтрольном водопое сельскохозяйственных животных, а также вследствие несанкционированного сброса населением биологических отходов, образующихся при жизнедеятельности животных (навоз и др.) [Ковалев Н.Г. с соавт., 2006]. Преимущественно реализовывался водный путь передачи инфекции при купании и рыбной ловле населения, в меньшей степени - контактный при уходе за домашним поголовьем сельскохозяйственных животных и собак.
Кроме того, в 2005 г были зарегистрированы 31 больной в Чеченской республике, 15 - в Ростовской области и единичные случаи в Республиках Северная Осетия - Алания (один) и Адыгея (восемь), в Карачаево-Черкесской (один) и Кабардино-Балкарской (восемь) республиках, а также в Волгоградской области (десять) [Самарина И.В, Надеина В.П. с соавт., 2007].
Помимо спорадических случаев ежегодно регистрируются эпидемические вспышки, чаще водного «купального» характера, в основном, связанные с нарушениями санитарно-ветеринарных правил при содержании сельскохозяйственных животных частного сектора. Зарегистрированы групповые заболевания, связанные с употреблением инфицированной лептоспирами питьевой воды [МУ 3.1.1128-02].
В последнее время отмечается заметная тенденция к урбанизации леп-тоспирозов. Прогрессирующее возрастание доли городского населения в общей структуре заболеваемости обусловлено ростом типично «городских» этиологических форм лептоспирозов {Icterohaemorrhagiae и Canicola), источником которых являются крысы и собаки [Рахманов А.И., 2002], расширением границ городов, освоением территорий природных очагов под лесопарки, садово-огороднические товарищества и другими факторами [Басель Б. с соавт., 2006].
Л.В. Родиной, В.В. Тимошковым, Л.А. Цвиль и др. [2006] представлены результаты десятилетних наблюдений за природными очагами лептоспирозов на территории г. Москвы, где содержатся сведения об очагах, основных видах мелких млекопитающих - резервуарах инфекции, этиологической структуре лептоспирозов, циркулирующих среди грызунов и насекомоядных. Согласно данным В.В. Тимошкова, Г.М. Маненкова, Л.В. Родины и др. [2004], только в г. Москве за период 1984-2004 гг. выявлено свыше 45 природных очагов лептоспирозов.
Непрерывность процесса циркуляции патогенных лептоспир в природе обеспечивается их способностью колонизировать извитые канальцы коркового слоя почек теплокровных хозяев, у которых формируется хроническое, часто пожизненное лептоспироносительство. Возбудители отдельных серогрупп также могут персистировать в слизистой оболочке генитального тракта (например, Hardjo - у коров, Australis - у свиней), тканях центральной нервной системы животных {Copenhagen! - у серых крыс), глаза (Grippotyphosa - периодическая офтальмия и рецидивирующие увеиты у лошадей). У грызунов и насекомоядных лептоспирозная инфекция протекает бессимптомно, сопровождаясь выделением лептоспир с мочой. Восприимчивы к лептоспирозам животные всех возрастов. Болезнь характеризуется кратковременной лихорадкой, гематурией, иногда желтушным окрашиванием и некрозами слизистых и отдельных участков кожи, а также нарушением функции желудочно-кишечного тракта [Малахов Ю.В. с соавт., 2001].
Получение высокоспецифичной лептоспирозной сыворотки
Условием получения качественных препаратов для выявления леп-тоспир является наличие высокоспецифичных сывороток, так как специфичность иммунологических реакций находится в прямой зависимости от специфичности антител, используемых для их приготовления. Как правило, сыворотки, полученные иммунизацией животных недостаточно специфичны, поэтому необходима сорбция антител, дающих перекрестные реакции с гете-рологичными антигенами. Для этих целей используется аффинная хроматография, которая осуществляется за счет биоспецифического взаимодействия между антигенами, закрепленными на матрице, и антителами, подлежащими удалению.
Успехи использования иммобилизованных препаратов в различных отраслях медицины в значительной мере обусловлены правильностью выбора используемого носителя. С этой целью использованы носители на основе органической (полифепан) и неорганической (оксид железа) природы. Органические природные носители часто применяются в качестве сорбента, что объясняется их доступностью, наличием реакционно-способных функциональных групп, которые легко вступают в различные химические реакции [Matar G.M., Khneisser I.A., Abdelnoor A.M., 1996]. Полифепан, полученный при переработке древесного лигнина, обладает высокой адсорбционной активностью и содержит до 20 % целлюлозы [Регистр лекарственных средств России, 1993; Машковский М.Д., 2006].
Неорганические носители так же часто используются в качестве сорбента, что объясняется наличием ряда положительных свойств: механической, микробиологической, химической устойчивостью, отсутствием токсичности и т.д. Благодаря оксиду железа образуется жесткий остов, повышается микробиологическая устойчивость, механическая прочность, ускоряются и упрощаются все этапы исследований.
Чувствительность анализов увеличивается за счет того, что ионы металлов в металлопротеинах несут двойную функцию: первая из них - ориентировочный или матричный эффект, а вторая - эффект концентрирования на участке протекания реакции. Ион металла может образовывать множество связей с субстратом и оттягивать на себя их электронную плотность, таким образом, он ведет себя как сверхкислота. Сам пептид имеет слабожесткую структуру и не обладает каталитическими свойствами. Если ион металла связан с пептидом, то последний приобретает активность, благодаря эффекту оттягивания электронной плотности положительно заряженными электронами металла [Дюга Г., Пенни К., 1983].
Таким образом, введение в структуру матрицы сорбента магнитного материала значительно повышает его активность и упрощает, ускоряет анализ. Последние условия выполняются за счет использования магнитоуправ-ляемости диагностической системы.
Для придания матрице, состоящей из полифепана и оксида железа, достаточно высокой связывающей способности мы «активировали» ее поверхность. На первой стадии окисляли перйодатом натрия до появления альдегидных групп, затем белок соединяли с активированной матрицей и, наконец, для придания большей устойчивости связь между белком и носителем восстанавливали боргидридом натрия. Структуру матрицы и концентрацию иммобилизованного лиганда подбирали таким образом, чтобы исключить внешние и внутренние диффузионные затруднения и стерические препятствия.
Процесс получения МС осуществляли следующим образом: к 1 г поли-фепана добавляли магнитный порошок (Ре2Оз), варьируя его количеством от 0,5 до 5 г, и 30 мл дистиллированной воды. Перемешивали и инкубировали от 1 до 24 ч при температуре (22±4) С.
Разливали гель в фарфоровые чашки и прокаливали в течение 20-30 мин при температуре 100 С, измельчали и методом рассева выделяли фракции с размером частиц 80-120 мкм. На стадии гидрогеля протекают конденсационные процессы с участием частиц полифепана, происходит перераспределение вещества, частицы укрупняются, контакты срастаются, что приводит к упрочнению скелета гидрогеля. На стадии 3 при термообработке гидрогель превращается в ксерогель, при этом объем гидрогеля уменьшается более чем в 10 раз, благодаря действию капиллярных сил.
Для оптимизации структурных характеристик МС проведены исследования по варьированию состава компонентов синтеза (полифепан, Ре2Оз), а также изучение влияния времени гелеобразования на величину удельной поверхности сорбентов, объем и радиус пор (табл. 2).
Таким образом, совокупность полученных данных о взаимном влиянии компонентов на формирование пористой структуры сорбентов можно объяснить адсорбцией полифепана на поверхности частиц оксида железа.
Наиболее оптимальные параметры получения МС в модельной системе обнаружены при использовании соотношения 3:1 компонентов синтеза МС, соответственно Fe203 и полифепана. Увеличение количества окиси железа нецелесообразно и способствует только увеличению экономических затрат на МС. Применение магнитного компонента в составе сорбента, используемого в качестве носителя твердофазного иммуноанализа микроорганизмов, значительно упрощает манипуляции с мелкодисперсным материалом, повышает экспрессность метода диагностики.
Получение и тестирование лептоспирозного липосомально-иммунопероксидазного конъюгата
В диагностических препаратах лиганды (белки, ферменты и т.д.) могут быть в растворимой форме или иммобилизованы (фиксированы) на специальных носителях. Иммобилизованные лиганды более стабильны, чем растворимые препараты [Ефременко В.И., Тюменцева И.С., 1995] по отношению к различного рода денатурирующим воздействиям среды (рН, температуры, влажности и т.д.). Белки подвержены опасности «поедания» их микроорганизмами, почти всегда присутствующими в окружающей среде. Этого возможно избежать, если белки экранировать от микробов, включив, например, в микропористый носитель. Данные носители могут являться основой суспензионных диагностикумов, применяемых для постановки реакции суспензионной агглютинации (РСА) на стекле, не потерявшей своей актуальности, так как она обладает простотой постановки, высокой чувствительностью и экспрессностыо. В реакции хорошо видны (визуально) хлопья агглютининов в положительном контроле.
При разработке суспензионного диагностического препарата для выявления лептоспир проведен подбор матрицы, изучены условия сенсибилизации ее антителами, стабилизации сенсибилизированных суспензий и стандартизации полученных диагностикумов.
В качестве матрицы выбран неорганический компонент - алюмосиликат, так как для данного кремнезема характерна высокая реакционная способность поверхностных групп при взаимодействии со многими веществами. Неорганические кремнеземные носители позволяют получать химически чистые сорбенты, имеющие жесткий остов, обладающие значительной адсорбционной емкостью, микробиологической устойчивостью, механической прочностью. В качестве красителя использовали флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ -C2iHuN05S). Введение в матрицу данного красителя обуславливает не только цветовой эффект, повышающий наглядность серологического теста, но он также является химическим «мостиком», способным связывать матрицу и антитела, при этом белки не изменяют своих свойств.
При получении суспензионных диагностикумов с такими красителями, как фуксин, бромфеноловый синий и т.д. обязательным условием является выбор пути активирования матрицы для иммобилизации лиганда и достижения агрегативной устойчивости суспензии. Для выполнения последнего условия необходима хорошая смачиваемость поверхности частиц дисперсионной средой и наличие стабилизатора. Добавляемый стабилизатор вводят в виде ионов, заряжающих и стабилизирующих частицы суспензии, либо в виде поверхностно-активных веществ, либо в виде защитного высокомолекулярного соединения [Хмельницкий Р.А., 1988].
Предлагаемый нами метод позволяет исключить выполнение этих пунктов, так как достаточно только красителя ФИТЦ, который соединяется с матрицей за счет физической сорбции с участием электростатических взаимодействий с кислотными центрами (Бренстедовскими и Льюисовскими) алюмосиликата, а его активный центр соединен с аминогруппой лизина и концевыми аминогруппами белковой молекулы. Вероятно, сульфгидрильные группы реагируют также с красителем, но значительно медленнее.
Следующей задачей был выбор способа очистки препарата от несвя-завшихся компонентов и достижения агрегативной устойчивости суспензии. Для данной цели оптимизированы количественные, температурные и временные параметры.
При получении специфического препарата необходимо соблюдение следующих правил: отсутствие в препарате непрореагировавших компонентов; отсутствие гетерологичных антител; специфическая адсорбция белков на матрице. Для выполнения данных правил нами сконструированы суспензионные диагностические препараты, представляющие собой иммуноглобулины, соединенные с матрицей, состоящей из алюмосиликата и ФИТЦ. Освобождение от непрореагировавших компонентов (гидролизованный флуорохром, флуоресцирующие примеси и т.д.) проводили с помощью диализа. Лигандом служили иммуноглобулины, выделенные из агглютинирующих иммунных лептоспирозных сывороток, адсорбированных от гетерологичных антител. Нами изучены закономерности иммобилизации антител и условия, при которых они проявляют иммунологическую активность в суспензиях. Специфическую адсорбцию белков на матрице проводили путем подбора эффективных параметров рН, времени, температуры, количественных соотношений компонентов.
С использованием алюмосиликата получены иммобилизованные системы, которым присущи положительные свойства неорганических матриц: гидрофильность, химическая и микробиологическая устойчивость, отсутствие набухаемости в растворах, значительная адсорбционная емкость, отсутствие токсичности.
Технология приготовления диагностикума состояла в следующем: к 100 мг алюмосиликата добавляли 2 мг ФИТЦ и готовили 2 % суспензию в 0,1 М фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ), рН (9,5±0,1). Далее инкубировали 30, 60, 120, 240 мин при температуре 24 С, 37 С, 50 С. Для иммобилизации использовали иммуноглобулины лептоспирозные в концентрации от 1 до 10 мг/мл, в объеме 10 мл, которые инкубировали от 1 до 18 ч, диализо-вали против 0,1 М ФСБ, рН (9,5±0,1), освобождаясь от несвязавшихся компонентов.
Полноту очистки препарата от непрореагировавшего флуорохрома оценивали методом восходящей хроматографии на бумаге [Носков Ф.С., 1985]. Об отсутствии несвязавшегося красителя судили по наличию на хро матограмме одного яркого флуоресцирующего пятна на месте нанесения ди-агностикума.
Для получения специфических препаратов, кроме освобождения от низкомолекулярных несвязавшихся компонентов, необходимо иммобилизовать высокоспецифичные иммунные сыворотки, то есть освободиться от ге-тероантител, взаимодействующих как с клетками возбудителя лептоспироза, так и непатогенными лептоспирами-сапрофитами. Данная цель достигнута в результате использования полученных лептоспирозных антигенов при иммунизации животных и истощения готовых гипериммунных сывороток от гете-роантител с помощью магноиммунносорбентов с иммобилизованными антигенами непатогенных лептоспир-сапрофитов (описано в главе 3).
Изучение диагностической ценности предложенных тест-систем при исследовании клинического материала
При заболевании людей с подозрением на лептоспироз в октябре 2005 г. в г. Новопавловске Кировского района Ставропольского края исследовали сыворотки крови, обеззараженные мертиолатом натрия до конечной концентрации 1:10000, в РМА, в традиционном ИФА «сэндвич»-варианте, разработанном модифицированном ИФА с МИС антигенными и конъюгатом имунопероксидазным против глобулинов человека (таблица 12).
Первоначально с помощью традиционного метода РМА определяли серогруппу и титр антител. РМА осуществляли на предметном стекле, на котором смешивали по 1 капле разведенной сыворотки и культуры диагностических штаммов лептоспир. В качестве контроля использовали смесь равных объемов 0,9 % раствора хлорида натрия и культуры лептоспир. Смесь накрывали покровным стеклом и после 15-минутной экспозиции при комнатной температуре проводили учет реакции под микроскопом в темном поле зрения (при увеличении х400). Вследствие добавления к испытуемой сыворотке равного объема живой культуры лептоспир разведение сыворотки удваивали. Агглютинация проявлялась в форме склеивания лептоспир и образовании конгломератов в виде «паучков». В контроле агглютинация отсутствовала, все клетки лептоспир находились в свободном состоянии.
ИФА в планшетах ставили по традиционной методике, сенсибилизируя планшеты иммуноглобулинами кролика, инкубировали, отмывали, вносили взвеси лептоспир, инкубировали, промывали от несвязавшихся компонентов и вносили сыворотку крови в разведении 1:100, титровали на фосфатно-солевом буфере с альбумином и твином (ФСБ-АТ), инкубировали, промывали и вносили конъюгат иммунопероксидазный против глобулинов человека. После инкубации промывали и вносили субстрат-индикаторный раствор, состоящий из цитратного буфера, О-фенилендиамина и перекиси водорода. В качестве отрицательного контроля использовали ФСБ-АТ. Учет результатов проводили визуально и инструментально на фотометре при длине волны 492 нм. ИФА является видовым методом диагностики, выявляющим любые серогруппы вида L. interrogans, , т.е. определяет вид возбудителя, а не его се-ровар. Тем не менее, полученный иммунопероксидазный конъюгат не реагирует со взвесями штаммов-сапрофитов L. biflexa и гетерологичными штаммами. Постановка ИФА с МИС доступна для любой лаборатории, освобождает от работы с живыми культурами лептоспир и учета реакции под микроскопом. Титр ИФА более чем в 5 раз превышает титр РМА.
При постановке модифицированного ИФА с МИС использовали маг-ноиммуносорбенты антигенные, приготовление которых описано в главе 3. В качестве иммунопероксидазного конъюгата для выявления антител в сыво ротке больных людей использовали полученный нами конъюгат иммунопе-роксидазный против глобулина человека с рабочим титром 1:200. Этапы проведения анализа: 1 этап - селективное концентрирование. В каждый флакон с исследуемым материалом (1 мл инактивированной при 56 С в течение 30 мин сыворотки в разведениях от 1:100 до 800 000) вносили по ОД мл 10 % ресуспендированного МИС лептоспирозного антигенного и инкубировали при комнатной температуре в течение 30-40 мин. Далее, удерживая МИС при помощи постоянного магнита на дне флакона, сливали жидкость, к осадку МИС добавляли 10 мл ФСБ, перемешивали встряхиванием и переносили в бактериологическую пробирку или флакон. Таким образом промывали МИС 5-6 раз, удаляя отмывочный раствор, удерживая МИС при помощи магнита; 2 этап - исследование МИС в ИФА. Далее во флаконы вносили по 0,2 мл иммунопероксидазного конъюгата против глобулинов человека в его рабочем разведении, инкубировали при температуре 22 С в течение 15 мин и промывали шестикратно 0,1 М ФСБ с твин-20. Во все флаконы вно сили субстрат-индикаторный раствор, состоящий из 10 мл цитратного буфера, 10 мг О-фенилендиамина и 40 мкл 33 % перекиси водорода. Через 1-2 мин надосадочную жидкость из флаконов дозатором переносили в планшет по 0,15 мл и останавливали реакцию, внося по 0,05 мл раствора серной кислоты в концентрации 4 моль/л.
Визуально регистрацию результатов оценивали по изменению интенсивности окраски смеси от оранжево-желтого цвета (опытные) до слабожелтого (контрольные). При инструментальном учете на фотометре оптическую плотность хромогенной смеси измеряли при длине волны 492 нм. Чувствительность препарата при выявлении лептоспирозных антител была не ниже 1:25600 в пробе.
Более низкая чувствительность традиционного ИФА по сравнению с разработанными методами связана с нестандартностью адсорбционной поверхности планшет из полистирола, что приводит к непрочному связыванию антител и их десорбции на этапах иммуноферментного анализа.
В ряде случаев в первые дни болезни титр антител к неспецифическому возбудителю превышает таковой к этиологическому агенту заболевания, но на более поздних сроках выявляются только специфические антитела к возбудителю болезни. Для суждения об истинной роли той или иной серогруппы лептоспир в качестве этиологического агента у конкретного больного определяется класс антител, так как антитела класса Ig G отличаются большей специфичностью, чем Ig М и в 85 % случаев реагируют только с гомологичным антигеном.
В августе 2005 г. в Чеченской республике возникла вспышка лептоспи-роза. На основании проведенного эпидемиологического расследования и клинической картины 49 больным (100%) был предварительно поставлен диагноз: лептоспироз. Мы исследовали сыворотки крови этих пациентов и сыворотки крови 56 человек (100 %), находящихся в контакте с заболевшими или эпидемиологически связанными с источником заражения (водоемом).
Кровь забирали из локтевой вены людей, спустя два месяца после вспышки заболевания. Сыворотки крови исследовали на наличие антител к лептоспирам в РМА, традиционном «сэндвич»-варианте ИФА и в ИФА с разработанными нами МИС антигенными и иммунопероксидазным конъюга-том против глобулина человека. Кроме того, учитывая позднее обследование больных, мы определяли в сыворотках их крови Ig М и Ig G для уточнения класса иммуноглобулинов, определяющих титр специфических антител, наличие в крови иммуноглобулинов Ig Е, а также возможного сдвига соотношения иммуноглобулинов в крови переболевших лептоспирозом людей.
Постановку РМА, ИФА проводили аналогично вышеописанному. Селективное концентрирование исследуемых антител на МИС с последующей постановкой экспресс-анализов осуществляли в два этапа: 1 этап - селективное концентрирование; 2 этап — исследование МИС в ИФА (методика постановки реакций и система учета результатов описана выше).
Похожие диссертации на Совершенствование методов лабораторной диагностики лептоспироза и детекции его возбудителя
