Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Патогенные свойства возбудителей коклюша и дифтерии 18
1.1. Некоторые аспекты эволюционной изменчивости микроорганизмов 18
1.2. Биологические свойства возбудителя коклюша 26
1.2.1. Фенотипическая характеристика Bordetella pertussis 26
1.2.2. Антигенная структура и серотипирование штаммов возбудителя коклюша 27
1.2.3. Патогенные свойства штаммов В. pertussis 31
1.2.4. Генетическая характеристика штаммов В. pertussis 36
1.3. Биологические свойства возбудителя дифтерии 46
1.3.1. Микробиологическая характеристика Corynebacterium diphtheriae 46
1.3.2. Характеристика возбудителя дифтерии, циркулирующего на различных этапах эпидемического процесса дифтерийной инфекции 48
1.3.3. Патогенные свойства штаммов С. diphtheriae 55
1.3.4. Генетическая характеристика штаммов С. diphtheriae 57
Глава II. Применение молекулярно-генетических методов в диагностике коклюша и дифтерии 72
2.1. Использование молекулярно-генетических методов в диагностике инфекционных заболеваний 72
Собственные исследования 84
Глава III. Материалы и методы 84
3.1 .Штаммы бактерий 84
3.2. Идентификация культур 87
3.3. Генотипирование штаммов В. pertussis 90
3.3.1. Выделение хромосомной ДНК 90
3.3.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) по выявлению генов: SI субъединицы коклюшного токсина (ptxA), пертактина (рт), фимбриальных генов (fim2 и/гтЗ), фактора колонизации трахеи (tc/A) 90
3.4. Генотипирование штаммов С. diphtheriae 97
3.4.1. Выделение ДНК С. diphtheriae 97
3.4.2. Амплификация фрагментов tox гена 97
3.5. Определение вирулентности штаммов В. pertussis 98
3.5.1. Заражение животных 98
3.5.2. Определение вирулентности 98
3.5.3. Лейкоцитозстимулирующая активность (ЛСА) культур 98
3.6. Статистическая обработка результатов 98
3.7. Программное обеспечение 99
Результаты исследования и их обсуждение 100
Глава IV. Структура основных генов патогенности В. pertussis и особенности циркуляции возбудителя коклюша в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции 100
4.1. Особенности циркуляции возбудителя коклюша в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции 101
4.1.1. Характеристика различных периодов эпидемического процесса коклюшной инфекции и фенотипические особенности возбудителя 101
4.2. Генетическая структура популяции штаммов В. pertussis в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции 112
4.2.1. Последовательность нуклеотидов ptxA гена, кодирующего S1 субъединицу коклюшного токсина, и распространение штаммов В. pertussis с различными аллельными вариациями (аллеломорфами) этого гена 112
4.2.2. Последовательность нуклеотидов ргп гена, кодирующего пертактин, и распространение штаммов В. pertussis с различными аллельными вариациями этого гена 117
4.2.3. Последовательность нуклеотидов фимбриальных генов (fim2 и/ЇтЗ) и распространение штаммов В. pertussis с различными их аллельными вариациями 125
4.2.4. Последовательность нуклеотидов tcfA гена, кодирующего фактор колонизации трахеи, и распространение штаммов В. pertussis с различными аллельными вариациями этого гена 131
4.2.5. Сопоставление генетической структуры штаммов В. pertussis, используемых для производства АКДС-вакцины, и штаммов, выделенных от больных коклюшем на современном этапе эпидемического процесса коклюшной инфекции 133
4.2.6. Вирулентные свойства штаммов В. pertussis, несущих новые аллельные вариации 136
Глава V. Разработка ускоренных методов, основанных на амплификационных технологиях, для наблюдения и выявления возбудителя коклюша 144
5.1. Молекулярно-генетический метод, основанный на полиморфизме длин рестрикционных фрагментов, для ускоренного выявления штаммов В. pertussis, циркулирующих на современном этапе 144
5.1.1. Разработка метода слежения за генетической структурой штаммов В. pertussis 145
5.1.2. Мониторинг штаммов В. pertussis, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе, методом ГШР-ПДРФ 150
5.2. Ускоренный молекулярно-генетический метод лабораторной диагностики коклюшной инфекции 152
5.2.1. Разработка ускоренного метода диагностики коклюша LAMP-вариант 153
5.2.2. Клинические испытания прямого ускоренного молекулярно-генетического метода LAMP-варианта 160
Глава VI. Особенности структуры генов, кодирующих синтез дифтерийного токсина (tox) и амилазной активности (ату) С. diphtheriae 172
6.1. Структурный ген токсинообразования (tox) С. diphtheriae 173
6.2. Особенности структуры генетической детерминанты амилазной активности штаммов С. diphtheriae 179
6.2.1. Генетическая детерминанта амилазной активности штаммов С. diphtheriae 180
6.2.2. Определение размера делеции 184
6.2.3. Способность продуцировать амилазу - дополнительный фактор патогенности С. diphtheriae 190
Глава VII. Выбор фрагмента нуклеотидной последовательности в атугеяе для определения в ПЦР принадлежности С. diphtheriae к биовару 196
7.1. Выбор специфической «мишени» и постановка ПЦР с праймерами для определения биовара С. diphtheriae 196
7.2. Апробация специфической «мишени», определяющей принадлежность к биовару, для комплексирования в мультиплексной ПЦР 200
Заключение 205
Выводы 232
Литература 235
- Антигенная структура и серотипирование штаммов возбудителя коклюша
- Полимеразная цепная реакция (ПЦР) по выявлению генов: SI субъединицы коклюшного токсина (ptxA), пертактина (рт), фимбриальных генов (fim2 и/гтЗ), фактора колонизации трахеи (tc/A)
- Разработка ускоренного метода диагностики коклюша LAMP-вариант
- Апробация специфической «мишени», определяющей принадлежность к биовару, для комплексирования в мультиплексной ПЦР
Введение к работе
Актуальность проблемы
Коклюш и дифтерия являются воздушно-капельными инфекциями, управляемыми средствами специфической вакцинопрофилактики. Массовая иммунизация детского населения АКДС-вакциной против коклюша и дифтерии, осуществляемая в России с 1959 года, позволила достигнуть значительных успехов в борьбе с этими заболеваниями и коренным образом изменила характер течения эпидемических процессов коклюшной и дифтерийной инфекций (Герасимова А.Г. и др., 2004; Лыткина И.Н. и др., 2004; Максимова Н.М. и др., 2002, 2003, 2008; Маркина С.С. и др., 2002, 2005, 2006; Петрова М.С. и др., 2000; Селезнева Т.С. и др., 2002, 2004; Чистякова Г.Г. и др., 2001, 2005).
Несмотря на очевидные успехи проводимой массовой иммунизации детского населения, коклюш и дифтерия по-прежнему остаются актуальными инфекциями, как для детского, так и для взрослого населения. До настоящего времени сохраняются основные эпидемиологические особенности поддержания эпидпроцессов этих инфекций.
Однако, в настоящее время в г. Москве на фоне высокого охвата профилактическими прививками (до 95,0%) отмечается относительная стабилизация заболеваемости коклюшем (показатель заболеваемости на 100000 населения (ПЗ) 2006 г. – 13,28; 2007 г. – 12,87), регистрируется заболеваемость среди привитых детей, наметились изменения в возрастной структуре заболеваемости (увеличилась доля детей школьного возраста при сохраняющейся высокой заболеваемости детей раннего возраста) и тяжесть клинического течения коклюша (регистрируются тяжелые формы не только среди детей раннего возраста, но и у детей школьного возраста) (Лыткина И.Н. и др., 2004; Чистякова Г.Г. и др., 2005). Аналогичные тенденции развития эпидпроцесса коклюшной инфекции отмечаются в России (Герасимова А.Г. и др., 2004; Селезнева Т.С. и др., 2002). При дифтерии в настоящее время в России отмечается заболеваемость на спорадическом уровне (ПЗ – 0,48 – 0,35 в 2005 – 2007 гг.), однако, продолжают регистрировать тяжелые формы заболевания, летальные исходы, заболеваемость среди привитых лиц, а также бактерионосительство, которое имеет место на фоне высокого уровня антитоксического иммунитета (Максимова Н.М. и др., 2002, 2003; Маркина С.С. и др., 2002, 2005, 2006). Все это свидетельствует о продолжающейся циркуляции и сохранении возбудителей коклюша и дифтерии в окружающей среде, а значит, существует риск возникновения заболеваний, особенно среди неиммунных и/или лиц с ослабленным иммунитетом.
Таким образом, в настоящее время сохранились все условия для поддержания эпидемических процессов коклюшной и дифтерийной инфекций, что определяет необходимость борьбы с ними на современном этапе и невозможность иррадикации возбудителей дифтерии и коклюша как биологических видов с помощью существующих средств вакцинопрофилактики (Мазурова И.К., 1993, 2002, 2006, 2008).
Одной из причин поддержания эпидпроцессов является изменчивость возбудителей, лежащая в основе их адаптации в меняющихся условиях существования. В последнее десятилетие появилось значительное число работ отечественных и зарубежных исследователей, рассматривающих природные и антропогенные факторы, в том числе иммунизацию, как мощный селективный фактор отбора (Борисова И.Э. и др., 2008; Селезнева Т.С., 2002; Семенов Б.Ф. и др., 2002, 2003; Cassiday P. et all, 2000; de Melker H.E. et all, 2000; Gandon S. et all, 2003, 2007; Packard E.R. et all, 2004; Preston A. et all, 2005).
Поэтому, в сложившихся условиях необходимо проводить постоянный мониторинг циркулирующих штаммов возбудителей коклюша и дифтерии с использованием молекулярно-генетических методов исследования, позволяющих выявлять самые незначительные изменения в геномах, в первую очередь, в генах, ответственных за проявление патогенных свойств микробов. Эти мутации могут привести к достаточно серьезным изменениям фенотипа и появлению новых клонов возбудителя, что, в свою очередь, может оказать влияние на течение эпидемических и инфекционных процессов и требует разработки новых технологий диагностики и наблюдения за возбудителями, как дифтерии, так и коклюша.
Цель исследования: выявление молекулярно-генетических особенностей структуры основных генов патогенности B. pertussis и С. diphtheriae, циркулирующих на современном этапе развития эпидемических процессов этих инфекций, и разработка принципиально новых подходов к совершенствованию лабораторной диагностики и средств вакцинопрофилактики коклюша и дифтерии.
Задачи исследования
-
Выявить особенности структуры пяти основных генов патогенности: ptxА гена, кодирующего энзиматически активную S1 субъединицу коклюшного токсина, prn гена, кодирующего пертактин, fim2 и fim3 генов, кодирующих фимбриальные белки, и tcfA гена, кодирующего фактор колонизации трахеи, штаммов B. pertussis, выделенных от больных коклюшем в период 1948 – 2007 гг.
-
Изучить генетическую структуру штаммов B. pertussis, используемых для приготовления коклюшного компонента АКДС-вакцины, и провести сравнительный анализ с генетической структурой штаммов B. pertussis, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе. Оценить вирулентные свойства штаммов B. pertussis, несущих новые аллельные вариации основных генов патогенности.
-
Разработать ускоренный метод мониторинга, основанный на технологии ПЦР-ПДРФ, для выявления распространенных в настоящее время штаммов B. pertussis с измененной структурой гена коклюшного токсина.
-
Разработать и провести клинико-микробиологические испытания ускоренного молекулярно-генетического метода лабораторной диагностики коклюша (LAMP-вариант), позволяющего идентифицировать возбудителя коклюша в клиническом материале без предварительного выделения «чистой» культуры B. pertussis.
-
Изучить структуру гена дифтерийного токсина (tox) и провести наблюдение за распространением штаммов С. diphtheriae, имеющих изменения в его структуре.
-
Определить нуклеотидную последовательность (amy ген), являющуюся генетической детерминантой, кодирующей амилазную активность С. diphtheriae, и выявить «мишени» - нуклеотидные последовательности ДНК, ответственные за принадлежность возбудителя дифтерии к биовару gravis или mitis, и на этой основе разработать новый метод дифференциальной диагностики биоваров.
-
Систематизировать коллекцию штаммов B. pertussis, выделенных за период 1948 – 1994 гг., и пополнить коллекцию штаммов B. pertussis и С. diphtheriae штаммами современного периода эпидпроцессов.
Научная новизна
Впервые проведен молекулярно-генетический мониторинг штаммов B. pertussis, циркулирующих в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции, и показано, что происходит вытеснение штаммов, содержащих «вакцинные» аллели, штаммами с «невакцинными» аллелями генов, кодирующих S1 субъединицу коклюшного токсина, пертактина и фимбриальных белков.
Получены новые данные об особенностях структуры пяти основных генов патогенности штаммов B. pertussis. Установлено, что в настоящее время штаммы B. pertussis с новым «невакцинным» ptxА1 аллелем гена коклюшного токсина распространились и полностью вытеснили штаммы B. pertussis с «вакцинными» ptxА4 и ptxА2 аллелями; новые «невакцинные» prn2 и prn3 аллели гена пертактина встречаются у 76,0% и 21,9% штаммов, соответственно. В тоже время формирование и распространение штаммов с «невакцинными» fim2-2 и fim3В аллелями фимбриальных генов происходит медленнее и встречается в 53,3% и в 83,4% случаев, соответственно. Изменений в структуре гена, кодирующего фактор колонизации трахеи (tcfA) не выявлено. Обнаружено, что современная популяция штаммов B. pertussis, характеризующаяся новыми «невакцинными» аллелями основных генов патогенности, обладает высокой патогенностью и высокой лейкоцитозстимулирующей активностью, что влияет на тяжесть клинического течения коклюша.
Получены новые данные о несоответствии структуры основных генов патогенности, ответственных за коклюшный токсин, пертактин, фимбриальные белки, штаммов B. pertussis, которые используют в нашей стране для производства АКДС-вакцины, и штаммов B. pertussis, вызывающих заболевание коклюшем в настоящее время, что является обоснованием совершенствования средств вакцинопрофилактики при коклюше.
Показано, что сохраняется циркуляция штаммов C. diphtheriae (в 60,0% случаев) с незначительными множественными единичными мутациями в tox гене, которые не сказываются на первичной структуре белка дифтерийного токсина, что формирует генетическую вариабельность вида. В последние годы не произошло распространения штаммов C. diphtheriae с измененной структурой tox гена (в положении 1252), приводящей к изменению аминокислотного состава белка дифтерийного токсина.
Выявлено, что в геноме штаммов C. diphtheriae биовара gravis имеется нуклеотидная последовательность (amy ген), являющаяся генетической детерминантой, кодирующей амилазную активность, в то время как штаммы С. diphtheriae биовара mitis имеют делецию этого фрагмента генома.
Сформированы новые подходы в системе мониторинга коклюшной инфекции и лабораторной диагностики коклюша и дифтерии, основанные на современных амплификационных технологиях, использующих выбранные «мишени» (нуклеотидные последовательности ДНК).
Впервые разработан новый метод мониторинга штаммов B. pertussis на основе молекулярно-генетического изучения полиморфизма длин рестрикционных фрагментов амплифицированных продуктов (ПЦР-ПДРФ) и получен патент на изобретение № 2299908, зарегистрированный в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 мая 2007 г.
Впервые разработан прямой ускоренный, высокочувствительный, специфичный и эффективный метод лабораторной диагностики коклюша – LAMP-вариант; получено положительное решение о выдаче патента от 16.09.2008 г. по заявке № 2007147797/13 (52390).
Впервые разработан молекулярно-генетический способ дифференцирования штаммов C. diphtheriae по принадлежности к биовару; получено положительное решение о выдаче патента от 13.11.2008 г. по заявке № 2007140879/13(044745).
Теоретическая значимость
Новые знания о генетической структуре возбудителей коклюшной и дифтерийной инфекций, об измененных нуклеотидных последовательностях и мутациях в генетических детерминантах факторов патогенности штаммов B. pertussis и C. diphtheriae являются обоснованием для создания новых вакцинных препаратов, в первую очередь, при коклюшной инфекции, на основе современных штаммов B. pertussis. Установленные факты имеют значение для формирования новых подходов в системе мониторинга и ускоренной лабораторной диагностики возбудителей коклюша и дифтерии, основанных на выборе генетических «мишеней» и на современных амплификационных технологиях. Данные о генетической гетерогенности штаммов свидетельствуют о резерве изменчивости, лежащем в основе механизмов формирования адаптаций микроорганизмов к меняющимся условиям существования и сохранению B. pertussis и C. diphtheriae как биологических видов.
Пополнена уникальная коллекция штаммов B. pertussis и С. diphtheriaе, позволяющая проводить многоплановые исследования возбудителей коклюша и дифтерии с целью создания новых препаратов и биотехнологий, направленных на совершенствование лабораторной диагностики и средств иммунопрофилактики при этих инфекциях.
Подобраны штаммы B. pertussis, вызывающие заболевание коклюшем на современном этапе эпидпроцесса, с новой генетической структурой основных факторов патогенности, как кандидаты для конструирования перспективных вакцинных препаратов.
Новый метод мониторинга штаммов B. pertussis на основе ПЦР-ПДРФ позволяет определять штаммы с измененной структурой ptxА гена коклюшного токсина для наблюдения за циркулирующей на современном этапе развития эпидпроцесса коклюшной инфекции популяцией B. pertussis.
Прямой ускоренный метод лабораторной диагностики коклюша LAMP-вариант выявляет возбудителя заболевания непосредственно из клинического материала больного без выделения «чистой» культуры в течение 9 – 10 часов. Клинические испытания метода показали его высокую специфичность (100%), высокую чувствительность (103 м.кл.) и высокую диагностическую эффективность (84,9% ± 4,9% (р < 0,001), по сравнению с бактериологическим методом, эффективность которого не превышала 22,7% ± 5,7% (р < 0,001). Использование LAMP-варианта расширило возможности обследования больных с различной тяжестью клинического течения болезни, в различные сроки от начала заболевания, начиная с ранних сроков, а также при обследовании детей до 1 года, детей с коклюшем, осложненным другими заболеваниями и в очагах инфекции, в первую очередь, в детских специализированных учреждениях.
Способ дифференциальной диагностики C. diphtheriae позволяет определять принадлежность к биовару по более специфичному, по сравнению с биохимической идентификацией, признаку – нуклеотидной последовательности в amy гене, что является одним из этапов в создании новых мультиплексных тест-систем для выявления возбудителя дифтерии при обследовании больных с подозрением на дифтерию и для своевременного проведения противоэпидемических мероприятий в очаге.
Внедрение результатов работы в практику
Результаты проведенных исследований послужили основой для лекций и практических занятий на курсах сертификации и повышения квалификации для врачей –бактериологов «Актуальные вопросы медицинской микробиологии», проводимых на базе ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» (2000 г.; 2004 г.; 2005 г.; 2006 г.); семинара «Биологические свойства возбудителя коклюша и лабораторная диагностика» для врачей-бактериологов филиалов ФГУЗ ЦГиЭ г. Москвы на базе ФГУЗ ЦГиЭ (г. Москва) (2008 г.); семинара по лабораторной диагностике дифтерии для врачей-бактериологов филиалов ФГУЗ ЦГиЭ Центрального Федерального Округа Российской Федерации, проводимого в рамках программы Всемирной Организации Здравоохранения (2002 г.) и были использованы при составлении следующих пособий, рекомендаций и информационного письма (совместно с сотрудниками лаборатории):
-
Пособие для врачей «Характеристика Corynebacterium diphtheriae, циркулирующих в России в период 1984 – 1998 гг. (микробиологический мониторинг в системе эпиднадзора за дифтерийной инфекцией)».
-
Методические рекомендации «Ускоренные методы лабораторной диагностики и наблюдения за возбудителем дифтерийной инфекции».
-
Пособие для врачей «Нетоксигенные штаммы Corynebacterium diphtheriae, несущие ген дифтерийного токсина».
-
Пособие для врачей «Комплексная система наблюдения за циркулирующими штаммами Corynebacterium diphtheriae».
Патенты на изобретения (в соавторстве):
-
Патент на изобретение «Способ дифференциации штаммов Bordetella pertussis» № 2299908 от 27 мая 2007 г.
-
«Способ дифференцирования штаммов C. diphtheriae»; положительное решение о выдаче патента от 13.11.2008 г. по заявке № 2007140879/13(044745).
-
«Набор и ускоренный способ лабораторной диагностики коклюша»; положительное решение о выдаче патента от 16.09.2008 г. по заявке № 2007147797/13 (52390).
Штаммы B. pertussis – кандидаты для конструирования перспективных вакцинных препаратов переданы в ГУ НИИ вакцин и сывороток им.И.И. Мечникова РАМН.
Разработанные методы ускоренной лабораторной диагностики коклюша и дифтерии внедрены в практическую работу отделений № 2 и № 20 ИКБ № 1 (г. Москва).
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Молекулярно-генетический мониторинг штаммов B. pertussis выявил особенности циркуляции возбудителя коклюша в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции и изменения в распространении штаммов, несущих «вакцинные» и «невакцинные» аллели генов патогенности, ответственных за коклюшный токсин, пертактин и фимбриальные белки.
-
У штаммов B. pertussis, циркулирующих на современном этапе развития эпидемического процесса коклюшной инфекции, произошли изменения структуры генов, кодирующих основные факторы патогенности коклюшного микроба – коклюшного токсина (ptxА ген), пертактина (prn ген) и фимбриальных белков (fim2 и fim3 гены), и отмечается усиление их вирулентных свойств. Структура основных генов патогенности штаммов B. pertussis, используемых в нашей стране для производства АКДС-вакцины, не соответствует структуре этих генов современных штаммов B. pertussis, вызывающих заболевание коклюшем.
-
Мутационные изменения происходят в структурном tox гене дифтерийного токсина C. diphtheriae - циркулируют штаммы с незначительными единичными мутациями, не приводящими к изменению аминокислотного состава белка дифтерийного токсина. Распространения штаммов C. diphtheriae с измененной структурой этого гена (в положении 1252), приводящей к замене аминокислот, не произошло. Определена последовательность нуклеотидов, являющаяся генетической детерминантой дополнительного фактора патогенности C. diphtheriae, не связанного с токсином, – amy геном, ответственным за амилазную активность.
-
Новые знания о структуре генетических детерминант, кодирующих основные факторы патогенности штаммов B. pertussis и C. diphtheriae, позволили подобрать специфические «мишени» (нуклеотидные последовательности ДНК) и разработать на их основе новые молекулярно-генетические методы – мониторинга штаммов B. pertussis и лабораторной диагностики коклюша и дифтерии для ускоренного выявления возбудителей этих болезней непосредственно в клиническом материале.
Апробация работы
Работа выполнялась в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Эпидемиология, микробиология», Федеральной целевой программы «Предупреждение и борьба с социально значимыми заболеваниями (2007 – 2011 годы)», подпрограммы «Вакцинопрофилактика», Международных проектов IncoCopernicus, INTAS, Международного научно-технического центра (МНТЦ), деятельности Международной Лабораторной Рабочей Группы ВОЗ по Дифтерии.
Работа состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы и четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Библиография включает 473 наименований работ, в том числе отечественных – 167 и зарубежных – 306 авторов. Общий объем диссертации составляет 292 страницы машинописного текста. Текст иллюстрирован 25 таблицами и 48 рисунками.
Антигенная структура и серотипирование штаммов возбудителя коклюша
Микроорганизмы рода Bordetella имеют общие антигены (родовые) и антигены, характерные для каждого вида (видовые). Наличие общих родовых антигенов обуславливает положительную реакцию агглютинации с гомологичными и гетерологичными неадсорбированными сыворотками (коклюшные и паракоклюшные) [92].
Бордетеллы имеют много общего в антигенном составе (прежде всего В. pertussis, В. bronchiseptica и В. parapertussis). При сравнительном иммуноэлектрофорезе с бактериями 28 видов, из 44 выделенных антигенов В. pertussis [282] лишь два антигена давали перекрестную реакцию с представителями других родов, главным образом, с грамотрицательными бактериями. С В. parapertussis перекрестно реагировали 40 антигенов В. pertussis, а с В. bronchiseptica — 42 антигена. Лишь один антиген В. pertussis можно считать видоспецифичным [283].
У микроорганизмов рода Bordetella описано 16 агглютиногенов, являющихся поверхностными белками, стимулирующими выработку антител, агглютинирующих бактериальные клетки, из них 7-й является общеродовым. Видовые антигены микроорганизмов рода Bordetella используются для получения адсорбированных монорецепторных (факторных) сывороток, позволяющих дифференцировать вид представителей рода Bordetella: 1-ый антиген для вида В. pertussis, 14-ый для вида В. parapertussis и 12-ый -В. bronchiseptica. Имеются «штаммовые», так называемые типовые антигены — 2, 3, 4, 5, 6, 15, 16-ый у В. pertussis. Агглютиногены 8, 9 и 10-ый - общие для В. parapertussis и В. bronchiseptica, 11-ый агглютиноген встречается только у В. bronchiseptica, 13-ый - у В. bronchiseptica и В. pertussis. Один штамм может иметь несколько агглютиногенов. В зависимости от присутствия второго и третьего агглютиногена выделяют четыре серотипа В. pertussis - 1.2.0, 1.2.3, 1.0.0, 1.0.3. Серотипирование В. pertussis основано на реакции агглютинации бактериальных клеток со специфическими монорецепторными сыворотками к типовым антигенам [382, 465].
Нами проведен анализ данных литературы [39, 116, 117, 118, 130, 131, 132] по изучению серотипового пейзажа штаммов В. pertussis. Данные этого анализа представлены на рис. 1. Показано, что в различные периоды эпидпроцесса существует неодинаковое соотношение серотипов штаммов В. pertussis. В допрививочный период преимущественное распространение имели штаммы серотипов 1.2.3 и 1.2.0. К 1960 - 61 гг. доля таких штаммов снизилась до 78,5%, а к 1967 г. до 38,9%. Смена серологического типа циркулирующих штаммов В. pertussis началась еще в середине 60-х годов. Так, если в 1960 — 61 гг. удельный вес штаммов серотипа 1.0.3 составлял 16,0%, то к 1967 г. удельный вес этих штаммов достиг 58,8%. С 70-х годов штаммы серотипа 1.0.3 заняли доминирующее положение в популяции и уже к 1976 - 78 гг. составили 95,4%. [53, 67, 109, 115, 157]. Несмотря на то, что уже с начала 70-х годов для производства АКДС-вакцины использовали штаммы коклюшного микроба всех трех серотипов, в 80 - 90-е годы штаммы серотипа 1.0.3 также продолжали превалировать среди циркулирующих штаммов [39, 116, 117, 118, 130, 131, 132].
Аналогичные тенденции распространения штаммов разных серотипов показаны и в других странах мира [185, 194, 391].
Определение серотипа, наряду с наблюдениями за штаммами и клинико-микробиологическими сопоставлениями, является обязательным при конструировании корпускулярной вакцины на производстве, которая используется для иммунизации в нашей стране против коклюша. В качестве коклюшного компонента АКДС-вакцины в нее включены 3 штамма серотипов 1.2.3, 1.2.0 и 1.0.3, что отличает ее от зарубежных аналогов.
Вместе с тем, роль агглютиногенов в патогенезе коклюша до сих пор мало изучена. В отличие от классического адгезина - филаментозного гемагглютинина (ФГА), они не обладают выраженными адгезирующими свойствами. Более того, эти агглютиногены могут снижать адгезию за счет стерической конкуренции с ФГА и коклюшным токсином (КТ), ингибируя адгезию В. pertussis к клеткам Vero. Обнаружено, что они защищают мышей от респираторного, но не от интрацеребрального заражения [152, 465].
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) по выявлению генов: SI субъединицы коклюшного токсина (ptxA), пертактина (рт), фимбриальных генов (fim2 и/гтЗ), фактора колонизации трахеи (tc/A)
В основу проведения ПЦР взяты условия согласно [347, 452]. Однако, учитывая высокую стоимость реагентов и трудности их приобретения, проведены эксперименты по адаптации реагентов для ПЦР, предлагаемых российскими фирмами. Праймеры синтезировали в научно-производственной фирме «Литех», tag-полимеразу, дезоксинуклеотиды, ПЦР-буфер приобретали в фирме «Fermentas» (Литва). Нами отработаны концентрации реагентов и оптимальные условия постановки реакций. ПЦР проводили в режиме автоматической амплификации на термоциклере РТС-100 Peltier Effect Cycling, Mj Research Inc (США).
Амплификация фрагментов гена, кодирующего SI субъедитщу коклюшного токсина (ptxA). Реакционная смесь содержала ПЦР буфер с 10 тМ Tris-HCl (рН 8,8), 1,5 тМ MgCl2, 50 тМ КС1, 5% DMSO, 10 pmol каждого праймера, 200 иМ каждого dNTP и 1U Taq DNA полимеразы в окончательном объеме 50 ul. Выделенная ДНК была добавлена в реакционную смесь в количестве 1 ці. Использовали праймеры F2 и R2, амплифицирующие участок ptxA гена размером 930 п.н.: ptxAYl 5 -GCCAATTTCACGCTCCAA-3 ptxAB2 5 -GCAACGTGACCGACATGG-3 (положения праймеров согласно последовательности ptxA гена штамма В. pertussis (GenBank accesion number Ml3223). Амплификация выполнялась в режиме: 95С - 3 мин (1 цикл); 95С - 15 сек, 65С - 15 сек, 72С - 1 мин (30 циклов), 72С - 10 мин. Результаты выявляли в электрофорезе в 1,8% агарозном геле при 160 V 1 час. Гель окрашивали стандартным раствором этидия бромида и результат реакции учитывали с помощью УФ-трансиллюминатора и фотографировали. Учет результатов реакции осуществляли путем сравнения электрофоретической подвижности ампликонов с подвижностью маркерных фрагментов ДНК. В качестве маркера молекулярных весов использовали DNA Ladder Mix («Fermentas», Литва).
Секвенирование фрагментов ptxA гена. Для секвенирования использовали полученные ампликоны. Секвенирование выполнено с помощью ABI Prism Big Dye terminator cycle sequencing ready reaction kit на ABI DNA секвенаторе (Perkin-Elmer Applied Biosystems) no [348]. При секвенировании фрагментов ptxA гена использовали те же праймеры. Нуклеотидные последовательности типов ptxA гена штаммов В. pertussis были сопоставлены с базой данных EMBL/GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez): ptxAl (accession number AJ245366), ptxA2 (accession number AJ245367), ptxA4 (accession number AJ245368) viptxA5 (accession number AJ006151).
Амплификация фрагментов гена пертактина (ргп) выполнена согласно [356]. Реакционная смесь содержала ГЩР буфер с 75 mM Tris-HCl (рН 8,8), 20 mM (NH4)2S04, 2,5 mM MgCl2, 1,0 uM каждого праймера, 5% DMSO, 200 цМ каждого dNTP, 1 ul ДНК, 1U Taq DNA полимеразы в окончательном объеме 50 ul. Использовали две пары праймеров:
С 5 -GTGCCCTTCCCGGCGGTG-3 и D 5 -GCTCCACGCTTTAGCCCG-3 ; Е 5 GCGGTCCCCGGCGGCTTC-3 и D 5 -GCTCCATGCTGTAGCCCG-3 . Режим амплификации: 94С - 10 мин (1 цикл); 59С - 1 мин 30 сек, 72С - 2 мин (40 циклов).
Результаты ПЦР выявляли в электрофорезе в 3,0 % агарозном геле при 160 V 3 часа. Учет результатов реакции осуществляли как описано выше. В качестве маркера молекулярных весов использовали O RangerRuler 50bp DNA Ladder («Fermentas», Литва). После амплификации с первой парой праймеров получали два типа фрагментов ДНК с молекулярной массой, соответствующей 120 п.н. и 135 п.н. (рис. 7).
Наличие фрагмента ДНК размером 120 п.н. свидетельствовало о том, что структура ргп гена штамма В. pertussis соответствовала 1, 3, 6 или 7 аллелям ргп гена (1 группа штаммов); наличие фрагмента ДНК размером 135 п.н. - 2, 10 или 11 аллелям ргп гена (2 группа штаммов). Далее проводили следующую амплификацию со второй парой праймеров, что позволяло дифференцировать штаммы внутри каждой из этих двух групп. После амплификации ДНК штаммов 1 группы получали также два типа фрагментов ДНК размером 89 п.н. и 104 п.н. Наличие фрагмента ДНК размером 89 п.н. свидетельствовало о том, что структура ргп гена штамма В. pertussis соответствовала 1, 6 или 7 аллелям ргп гена (дальнейшую дифференциацию этих штаммов проводили методом секвенирования), а наличие фрагмента ДІЖ размером 104 п.н. - 3 аллели ргп гена.
После амплификации ДНК штаммов В. pertussis второй группы с парой праймеров E-D выявляли фрагменты ДНК также двух молекулярных весов -119 п.н. и 89 п.н. Наличие фрагмента ДНК размером 119 п.н. свидетельствовало о том, что структура ргп гена этих штаммов В. pertussis соответствовала 2 аллели ргп гена, а фрагмента ДНК размером 89 п.н. - 10 или 11 аллелям ргп гена.
Постановка ПЦР для наработки фрагментов ргп гена штаммов В. pertussis для секвенирования проведена согласно [348]. Использовали следующие праймеры (рис. 8):
AF 5 -GCCAATTTCAGGGTCCAA-3 AR 5 -GCAAGGTGCGCGACAGGG-3 BF 5 -AGCTGGGCGGTTCAAGGT-3 BR 5 -CGGATTCAGGCGCAACTC-3 ;
PF 5 GTCTCTGTCACGCATTGTC-3 PRN707R 5 -AGGGCGCCGATATGCAAG-3\ амплифицирующие участки ргп гена размером 585 п.н., 534 п.н. и 555 п.н., соответственно (положения праймеров согласно последовательности ргп гена штамма В. pertussis (GenBank accesion number J04560).
Секвенирование фрагментов рт гена. Условия проведения секвенирования описаны выше. В качестве праймеров для секвенирования 1 области рт гена использовали праймеры AF и AR; 2 области - BF и BR; на область 152 - 707 - PF и PRN707R, согласно [348]. Нуклеотидные последовательности типов рт гена штаммов В. pertussis были сопоставлены с базой данных EMBL/GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez): prn J (accession number AJ011091), prn2 (accession number AJO11092), и ргпЗ (accession number AJO11093).
Амплификация фрагментов фимбриальных генов (jim2 и fim3) проведена согласно [452]. Для постановки реакции использовали праймеры: Fim2F 5 -GCGCCGGGTTCCTGCATGCAC-3 Fim2R 5 -GGGGGGTTCCCGATTTCCAGTTTCTC-3 ; Fim3F 5 -GACCTCGTATTCTGATGCCG-3 Fim3R 5 -CGCAAGGCTCCCCGGTTTTTTTTGG-3 , амплифицирующие фрагменты fim2 и /гтЗ генов размером 838 п.н. и 801 п.н., соответственно (положения праймеров согласно последовательности jim2 и fim3 генов В. pertussis (GenBank accesion number Y00527 и X51543.). Реакционная смесь содержала ГЩР буфер 10 тМ Tris-HCl (рН 8,8), 20 тМ (NH4)2S04, 2,5 тМ MgCl2, 10 pmol каждого праймера, 200 иМ каждого dNTP, 5% DMSO, 1 ul ДНК, Ш Taq DNA полимеразы в объеме 50 ul. Амплификация фрагментов fim2 гена выполнялась в режиме: 95С - 15 мин (1 цикл); 95С - 30 сек, 59С
- 30 сек, 72С - 1 мин (30 циклов); 72С - 7 мин. Амплификация фрагментов /ЇтЗ гена выполнялась в режиме: 95С - 15 мин (1 цикл); 95С - 30 сек, 65С
- 30 сек, 72С - 1 мин (30 циклов); 72С - 7 мин. Электрофорез в агарозном геле и детекцию полученных результатов проводили, как описано выше. Секвенирование фрагментов fim2 и іітЗ генов. Для секвенирования использовали ампликоны, полученные в ПНР. Секвенирование выполнено, как описано выше, в качестве праймеров использовали Fim2F - Fim2R и Fim3F - Fim3R, амплифицирующие участки Jim2 и/їтЗ генов размером 838 п.н. и 801 п.н., соответственно. Нуклеотидные последовательности типов fim2 и fimS генов штаммов В. pertussis были сопоставлены с базой данных EMBL/GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez): fim2-l (accession number Y00527), fim2-2 (accession number AJ420988); fim3-A (accession number X51543), fim3-A (accession number AY464179), fim3-B (accession number AY464180) nfim3-C (accession number AY464181).
Амплификация фрагмента гена, кодирующего фактор колонизации трахеи (tcfA) проведена согласно [452]. Использовали праймеры: TcfAF 5 CCCTTAGGACTGACATC-3 TcfAR 5 TCGGAGTCCTCGTCATTGCG-3 , амплифицирующие участок tcfA гена размером 945 п.н. (последовательность праймеров согласно последовательности tcfA гена В. pertussis (GenBank accesion number AJ009785). Реакционная смесь содержала ПЦР буфер с 10 mM Tris-HCl (рН 8,8), 20 mM (NH4)2S04, 2,5 mM MgCl2, 10 pmol каждого праймера, 200 дМ каждого dNTP, 5% DMSO, 1 ul ДНК, 1U Taq DNA полимеразы в объеме 50 ul. Амплификация фрагментов гена выполнялась в режиме: 95С - 15 мин (1 цикл); 95С - 15 сек, 59С - 30 сек, 72С - 1 мин (2 цикла); 95С - 15 сек, 59С - 30 сек, 72С - 1 мин (2 цикла); 95С - 15 сек, 72С - 1 мин (2 цикла); 95С -15 сек, 53С - 30 сек, 72С - 1 мин (2 цикла); 95С - 15 сек, 55С - 30 сек, 72С - 1 мин (2 цикла); 95С - 15 сек, 53С - 30 сек, 72С - 1 мин (2 цикла); 72С — 7 мин. Электрофорез в агарозном геле и детекцию полученных результатов проводили, как описано выше.
Разработка ускоренного метода диагностики коклюша LAMP-вариант
Применение молекулярно-генетических методов является перспективным направлением в лабораторной диагностике коклюша. За рубежом используют множество технологий ПЦР [170, 175, 222, 229, 238, 257, 274, 288, 303, 318, 326, 367, 408, 432], позволяющих выявлять различные мишени в геноме В. pertussis. Однако все используемые в настоящее время амплификационные технологии не обладают высокой специфичностью и дают ложноположительные результаты, что связано с большой гомологией геномов представителей рода Bordetella. Поэтому, до настоящего времени вопрос использования той или иной амплификационной технологии остается открытым.
Имеются исследования японских ученых [365] по разработке новой молекулярно-генетической амплификационной технологии - loop-mediated isothermal amplification (LAMP) - «петлеопосредованная» изотермальная амплификация, основанная на свойстве полимеразы, лишенной эндонуклеазной активности, синтезировать новую цепь ДНК, вытесняя цепь с внесенным однонитевым разрывом. Подобная технология обладает высокой чувствительностью и специфичностью, высокой амплификационной эффективностью, которая достигается при изотермальных условиях реакции (63 - 65С). Механизм амплификации в LAMP-методе отличается от механизма в ПЦР в отсутствии шага денатурации ДІЖ. Такая технология явилась основой модифицированных методов LAMP и успешно применяется для диагностики значительного количества микроорганизмов, в том числе для межштаммовой дифференциации представителей рода Bordetella -штаммов В. pertussis от штаммов В. parapertussis и В. bronchiseptica [295]. Однако для лабораторной диагностики коклюша необходимым условием является выявление возбудителя коклюша непосредственно в клиническом материале от больного без этапа выделения «чистой» культуры.
Первым этапом разработки нового метода было воспроизведение LAMP-технологии [365]. Однако воспроизведение технологии японских коллег представляло серьезные затруднения, из-за отсутствия реагентов, используемых ими в LAMP, трудности их приобретения и их высокой стоимости. Поэтому были проведены предварительные эксперименты по адаптации реагентов для постановки амплификации - подобраны реагенты, отработаны концентрации и условия постановки реакции. Подбор реагентов. В результате большого числа предварительных экспериментов с использованием музейных штаммов представителей рода Bordetella, Corynebacterium и Staphylococcus вместо предложенной реакционной смеси [295] был разработан состав реакционного буфера, содержащего 10х буфер ПЦР, 25 mM MgCl2, 2 тМ dNTP; три пары праймеров - BP-F3, ВР-ВЗ, BP-FIP, BP-BIP, BP-LF, BP-LB [295]:
BP-F3 5 -CCGCATACGTGTTGGCA-3 ,
ВР-ВЗ 5 GCGTTTTGATGGTGCCT-3 ,
BP-FIP5 TGGATTGCAGTAGCGGGATGTGCATGCGTGCAGATTCGTC-3
BP-BIP 5 -CGCAAAGTCGCGCGATGGTAACGGATCACACCATGGCA-3 ,
BP-LF 5 -ACGGAAGAATCGAGGGTTTTGTAC-3\
BP-LB 5 -GTCACCGTCCGGACCGTG-3 ; и Bst полимеразу. Амплификацию выполняли в изотермальном режиме: 65С - 60 мин и 80С - 2 мин. Визуализацию полученных ампликонов проводили после электрофореза в 2% агарозном геле при 160V (рис. 29).
На фореграмме представлены результаты детекции полученных LAMP-ампликонов штамма В. pertussis. Положительными образцами считаются образцы, имеющие вид светящегося специфического Ladder-подобного профиля.
Разработанный протокол исследования изучен на 50 штаммах B. pertussis, 20 штаммах В. parapertussis, 8 штаммах В. bronchiseptica, 2 штаммах С. glutamicum, 10 штаммах С. ulcerans, 8 штаммах C. pseudodiphtheriticum, 20 штаммах С. diphtheriae 2 штаммах S. aureus (рис. 30).
Обнаружено, что для всех образцов, содержащих ДНК штаммов В. pertussis, характерными были специфические светящиеся Ladder-подобные профили. Во всех остальных образцах, содержащих ДНК других микроорганизмов, регистрировали отрицательный результат.
Данный метод с разработанным нами составом реакционной смеси был воспроизводим, что подтверждалось серией повторяющихся экспериментов. Во всех сериях опытов отмечали постоянство профилей LAMP-ампликонов штаммов В. pertussis.
Однако этот способ применим только при изучении «чистой» культуры возбудителя коклюша. Поэтому, перед нами стояла цель разработки метода ускоренной лабораторной диагностики коклюша для выявления возбудителя непосредственно из клинического материала с тампона от больного.
Известно, что чувствительность амплификационных технологий высока только при работе с «чистыми» культурами микроорганизмов и автоматически не распространяется на чувствительность метода при работе с клиническим материалом, где на эффективность метода влияют - методика подготовки клинического образца, способ выделения ДНК, освобождение от ингибиторов фермента амплификации и др. Не менее важным фактором для получения результата при изучении клинического материала является низкая концентрация первичной матрицы в малом объеме клинического образца.
Разработка прямого ускоренного специфического и чувствительного молекулярно-генетического метода выявления возбудителя коклюша в клиническом материале от больных включала несколько этапов экспериментальных исследований при разработанном составе (как было сказано выше) реакционного буфера: предварительная обработка клинического образца (смыв клинического материала с тампона от больного и его первичная обработка), подготовка клинического образца (разрушение клеточной стенки возбудителя коклюша в клиническом образце различными детергентами), выделение ДНК из клинического материала (изучены методы выделения ДНК с использованием сорбентов, детергентов, магнитных частиц, а также метода кипячения).
С целью подбора оптимального метода выделения ДНК апробированы четыре коммерческих набора для выделения ДНК: 1) с использованием детергентов («ДНК-экспресс» (НПФ «Литех», Москва), «InstaGene» («BioRad», США); 2) с использованием сорбентов («ДНК-сорбА» («АмплиСенс», Москва), «ДНК-сорбАМ» («АмплиСенс», Москва), «набор для выделения ДНК из биопроб» (НПФ «Литех», Москва); 3) с использованием магнитных частиц («Dynal», США); 4) метод кипячения культуры при 95 С 20 минут. Культуру контрольного штамма В. pertussis № 475 выращивали на КУА с кровью в течение 24 часов, делали десятикратные разведения бактериальной суспензии по стандарту мутности. В эксперимент брали по 100 мкл проб. В результате сравнительного изучения различных методов выделения ДНК из клинического материала обнаружено, что все апробированные тест-системы и метод кипячения для выделения ДНК из штамма В. pertussis, при выбранном протоколе, были эффективны только при очень большом количестве первичной бактериальной культуры. Таким образом, на данном этапе разработки мы получили очень низкую чувствительность, что является неприемлемым для использования в клинической практике. Вместе с тем, для дальнейшей работы выбран набор для выделения ДНК с использованием сорбентов - «ДНК-сорбАМ», так как при его использовании получали более-стойкий положительный результат и по времени выделения он был наиболее оптимальным.
С целью увеличения выхода первичной матрицы ДНК из клинического материала, следующим этапом была подработка методики подготовки клинического образца, т.е. разрушение клеточной стенки возбудителя коклюша в клиническом образце различными детергентами. Культуру контрольного штамма В. pertussis выращивали на КУА с кровью в течение 24 часов, делали десятикратные разведения бактериальной суспензии по стандарту мутности. В эксперимент брали по 100 мкл проб, которыми заражали тампоны. Тампоны смывали в 1мл ТЕ буфера, центрифугировали 14000 об/мин и удаляли супернатант, оставляя 180 мкл пробы. Для увеличения выхода ДНК из клинического материала проводили инкубацию образца с лизоцимом при 37 С и с протеиназой К при 70С. Далее выделение ДНК проводили с помощью набора «ДНК-сорбАМ». В результате эксперимента чувствительность метода удалось повысить до 10 тыс.м.к., однако, и такая чувствительность также является низкой. Для увеличения чувствительности предприняты попытки по увеличению концентрации лизоцима, что привело к получению более четкого положительного сигнала. Таким образом, на этом этапе подработана методика подготовки клинического образца - обработка клинического образца лизоцимом и протеиназой К.
Таким образом, в результате многочисленных экспериментов разработан прямой ускоренный молекулярно-генетический метод лабораторной диагностики коклюша, основанный на LAMP-технологии, обладающий высокой чувствительностью, выявляющий 100 м.к. (рис. 31) возбудителя коклюша непосредственно в клиническом материале в течение 9 -10 часов с момента начала обследования. Все этапы разработки нового метода (LAMP-вариант) описаны в заявке на изобретение № 2007147797/13 (052390) от 25.12.2007 г., поданной в Федеральную службу по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам; 16.09.2008 г. получено положительное решение о выдаче патента.
Апробация специфической «мишени», определяющей принадлежность к биовару, для комплексирования в мультиплексной ПЦР
Для оценки возможностей использования разработанных «мишеней» в ату гене в качестве дагностического критерия определения принадлежности к биовару в ускоренной лабораторной диагностике дифтерии совместно с руководителем лаборатории молекулярной диагностики и геноинженерных препаратов Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (г. Оболенск) к.б.н. Н.В. Воложанцевым и сотрудником этой лаборатории В.В. Банновым предпринята попытка применения мультиплексной амплификационной технологии для выявления возбудителя дифтерии в клиническом материале больных, позволяющей одновременно в одной пробирке определять фрагменты ату гена, ответственного за амилазную активность, и tox гена, кодирующего токсинообразование. Из вышеуказанной лаборатории получены праймеры и протоколы для проведения мультиплексной амплификации.
Сначала этот материал апробирован на 147 штаммах С. diphtheriae, как токсигенных (100 штаммов), так и нетоксигенных (47 штаммов), двух биоваров - gravis (76 штаммов) и mitis (71 штаммов). У токсигенных штаммов С. diphtheriae биовара gravis регистрировали специфический профиль, состоящий из двух фрагментов ДНК с молекулярной массой 634 п.н. и 289 п.н. (рис. 47, лунки 2, 4); у токсигенных штаммов С. diphtheriae биовара mitis — фрагмент с молекулярной массой 634 п.н. (рис. 47, лунка 5). При отсутствии этих фрагментов в исследуемом образце ДНК, продукты амплификации не регистрировались.
Таким образом, этот результат подтверждает специфичность «мишеней» в ату гене для определения биовара gravis, а также указывает на возможность использования мультиплексной ГЩР-технологии для диагностических целей.
Нами предпринята попытка выделения возбудителя дифтерии по наличию фрагментов tox и ату генов непосредственно в клиническом материале от больных дифтерией.
Принимая во внимание, что чувствительность амплификационных технологий высока только при работе с «чистыми» культурами микроорганизмов и не распространяется на чувствительность метода при работе с клиническим материалом (как показано на примере коклюшной инфекции), когда на эффективность метода влияет большое количество факторов - методика подготовки клинического образца, способ выделения ДНК, низкая концентрация первичной матрицы в малом объеме клинического образца и многое др., проведены эксперименты по оптимизации условий обследования больного, подготовки клинического образца, выделению ДНК. В нашей работе не представлены данные по нуклеотидным последовательностям праймеров, методике постановки мультиплексной ПНР и предварительной подготовке клинического материала, так как это является основой формируемого совместно с Н.В. Воложанцевым и В.В. Банновым патента на изобретение.
Обследовано 9 больных, госпитализированных в ИКБ № 1 (г. Москва) с подозрением на дифтерию и находящихся под наблюдением инфекциониста лаборатории эпиднадзора за дифтерией ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора к.м.н. М.П. Корженковой. Возраст больных варьировал в пределах 28 - 60 лет. Патологический материал собирали двумя тампонами из ротоглотки и носа для дальнейшего изучения в бактериологическом методе и мультиплексной ПНР.
На рис. 48 представлены результаты обследования больного С. (44 года) с подозрением на дифтерию в мультиплексной ПЦР. Положительной считалась проба, имеющая вид профиля, состоящего из двух специфических светящихся фрагментов определенной молекулярной массы. В образцах, содержащих ДНК из клинического образца из носа (рис. 48, лунка 2) и ротоглотки больного (рис. 48, лунка 3), регистрировали положительные результаты, что свидетельствовало о наличие в материале от больного токсигенного штамма С. diphtheriae биовара gravis и подтверждало клинический диагноз «дифтерия ротоглотки и носа».
С помощью мультиплексной ПЦР клинический диагноз «дифтерия» удалось подтвердить у трех больных: у больного (С, 44 лет) с диагнозом «комбинированная дифтерия ротоглотки и носа»; у больной (И., 54 лет) с клиническим диагнозом «комбинированная локализованная дифтерия ротоглотки и носа»; у больной (Е., 60 лет) с клиническим диагнозом «токсическая дифтерия ротоглотки II - III степени в комбинации с дифтерией гортани». У первых двух больных также получено бактериологическое подтверждение, в то время как бактериологическое обследование последней больной дало отрицательные результаты.
У остальных шести больных, госпитализированных в стационар с подозрением на дифтерию, при поступлении поставлены диагнозы «лакунарная ангина» и при бактериологическом обследовании и в мультиплексной ПЦР получены отрицательные результаты.
Таким образом, проведенное исследование показало возможности использования «мишеней» в ату гене, выявление которых с помощью ПЦР позволяет определять принадлежность к биоварианту, с целью коплексирования в мультиплексной ПЦР для разработки ускоренного метода обследования больных с подозрением на дифтерию. В настоящее время исследования по разработке ускоренного метода лабораторной диагностики дифтерии продолжаются.
Разработан способ определения принадлежности штаммов С. diphtheriae к биовару, основанный на ПЦР, позволяющий отличать штаммы С. diphtheriae биовара gravis от штаммов биовара mitis, что является необходимой составляющей наблюдения за возбудителем дифтерии в системе эпидемиологического надзора за дифтерийной инфекцией. На разработку способа дифференцирования штаммов С. diphtheriae биовара gravis от штаммов mitis подана заявка на изобретение № 2007140879/13 (044745) от 07.11.2007 г. в Федеральную службу по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам. Разработка данного метода явилась одним из этапов создания новых мультиплексных тест-систем для ускоренного выявления возбудителя дифтерии по специфическим генам - tox и ату генам. Предварительные эксперименты показали возможности использования «мишеней» в ату гене, выявление которых с помощью ПЦР позволяет определять принадлежность к биоварианту, с целью коплексирования в мультиплексной ПЦР для разработки ускоренного метода обследования больных с подозрением на дифтерию.
