Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Характеристика бактерий - возбудителей острых кишечных инфекций 9
1.2. Факторы патогенности бактериальных возбудителей острых кишечных инфекций и их генетическая детерминация 15
1.3. Молекулярно-биологические методы идентификации бактериальных возбудителей ОКИ 32
ГЛАВА 2. Материалы и методы 47
2.1. Методы взятия и транспортировки проб 48
2.2. Методики выделения ДНК в процессе подготовки к проведению ПЦР 49
2.3. Проведение ПЦР-амплификации фрагментов генома энтеробактерий 52
2.4. Регистрация результатов.. 58
2.5. Учет результатов 59
2.6. Анализ плазмидного состава энтеробактерий 59
2.7. Статистическая обработка результатов . 61
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 62
3.1. Разработка ПЦР тест-системы для экспресс-детекции шигелл и энтероинвазивных эшерихий 62
3.2. Апробация и оптимизация к проведению практических исследований экспериментальных вариантов ПЦР тест-систем для детекции бактериальных возбудителей ОКИ: сальмонелл, кампилобактеров, йерсиний 84
3.3. Изучение распространенности генов факторов патогенности бактериальных возбудителей ОКИ с использованием метода ПЦР 101
Заключение 113
Выводы 119
Список литературы 121
- Характеристика бактерий - возбудителей острых кишечных инфекций
- Методики выделения ДНК в процессе подготовки к проведению ПЦР
- Анализ плазмидного состава энтеробактерий
- Разработка ПЦР тест-системы для экспресс-детекции шигелл и энтероинвазивных эшерихий
Введение к работе
В настоящее время острые кишечные инфекции продолжают оставаться серьезной проблемой для здравоохранения многих стран, в том числе и России. В последние годы из-за снижения уровня жизни и ухудшения экологической ситуации в нашей стране отмечается рост заболеваемости острыми кишечными инфекциями, в особенности шигеллезом (Черкасов Б.Л., 1997; Сергевнин В.И.Д999).
Согласно официальным данным службы Госсанэпиднадзора, по России в 80% случаев кишечных заболеваний не выявляется этиологический агент. Несовершенство методической лабораторной базы ЛПУ приводит к тому, что диагностика ОКИ во многих случаях поздняя, а число диагностических ошибок достигает 12,2-14,7% и остается стабильным (Ющук Н.Д., 2000; Покровский В.И. и др. 2002). В связи с этим важной задачей является разработка новых ускоренных, прямых, высокочувствительных и специфичных методов диагностики, обеспечивающих раннее выявление возбудителя и изучение его биологических свойств.
Всем этим требованиям соответствуют диагностические системы, базирующиеся на ПЦР-технологии: продолжительность анализа 6-7 часов, чувствительность до 10-100 бактерий в образце, при удачном подборе праймеров практически 100% специфичность, возможность анализировать до 100-200 и более образцов за день.
Быстрое, своевременное определение возбудителя, источника инфекции, круга инфицированных лиц является важным условием оперативного контроля над эпидемиологической ситуацией, целенаправленного государственного санитарно-эпидемиологического надзора за сырьем и пищевыми продуктами, оценки эффективности комплекса противоэпидемических мероприятий и назначения адекватной этиотропной терапии.
Цель работы:
Разработка ПЦР тест-системы для выявления бактерий рода Shigella и энтероинвазивных E.coli, совершенствование диагностики острых кишечных инфекций применением ПЦР-детекции наиболее распространенных бактериальных возбудителей диарейных инфекций.
Задачи исследования:
1. Разработать ПЦР тест-систему для детекции бактерий рода Shigella и энтероинвазивных Е. соїі в клиническом материале, продуктах питания, объектах внешней среды.
2. Оптимизировать отечественные экспериментальные ПЦР тест- системы, выявляющие бактерии рода Salmonella, для внедрения в практическую медицину.
3. Оценить целесообразность комплексного ПЦР-исследования клинического материала на наличие распространенных бактериальных возбудителей острых кишечных инфекций.
4. Изучить распространенность генов факторов патогенности в клинических изолятах шигелл, сальмонелл и эшерихий.
Научная новизна исследований
Подобраны оригинальные праймеры, позволяющие проводить эффективный высококачественный синтез консервативного участка оперона инвазивности шигелл и энтероинвазивных эшерихий. На базе данных праймеров разработана отечественная тест-система для детекции бактерий рода Shigella и энтероинвазивных Е. соїі в клиническом материале, продуктах питания и объектах внешней среды.
Получены новые данные, характеризующие степень патогенности клинических изолятов шигелл, сальмонелл, эшерихий, выделенных в Волго-Вятском регионе. Показано широкое распространение генетических детерминант инвазивности (33,0%), токсигенности (22,6%) и подвижности
7 (11,4%) микроорганизмов. Из генов токсигенности выявлен ген шигоподобного токсина 1. У штаммов Е. coli 0127 выявлены генетические структуры, сходные с генами адгезии tcpA V. cholerae и V. eltor. Основные положения, выносимые на защиту
ПЦР тест-система, разработанная на основе оригинальных праймеров, специфичных к оперону инвазивности, позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью проводить выявление шигелл и энтероинвазивных эшерихий в клиническом материале от больных ОКИ.
Применение в клинических исследованиях и санитарно-эпидемиологических мероприятиях ГЩР-детекции шигелл и сальмонелл позволяет более чем в 2 раза увеличить эффективность выявления указанных инфекционных агентов.
3. Экспериментальные отечественные ПЦР тест-системы для изучения патогенных свойств энтеробактерий позволяют получать новую, объективную информацию о наличии генетических детерминант факторов патогенности в клинических изолятах Shigella, Salmonella, E.coli.
4. Комплексное ПЦР-исследование на наличие бактерий родов Shigella, Salmonella, Campylobacter и Yersinia enterocolitica на стадии первичного анализа клинического материала от больных ОКИ позволяет в увеличить выявление этиологического фактора и проследить циркуляцию труднокультивируемых возбудителей ОКИ.
Практическая значимость
Созданная в ходе настоящей работы ПЦР тест-система для детекции шигелл и энтероинвазивных эшерихий в 2,5 раза эффективнее выявляет инфекционный агент в клиническом материале по сравнению с бактериологическим методом, сокращает время проведения анализа до одного рабочего дня.
Апробированные и в ряде случаев оптимизированные экспериментальные тест-системы для выявления бактерий родов Shigella, Salmonella, Campylobacter и Yersinia enterocolitica позволяют увеличить
8 выявляемость этиологического фактора ОКИ более чем в 2 раза. При проведении комплексного ПЦР-исследования клинического материала возбудитель ОКИ был выявлен методом ПЦР в 37% случаев, бактериологическим методом - в 16%.
Использование метода ПЦР для характеристики патогенных свойств клинических изолятов энтеробактерий позволило получить объективную научную информацию о циркуляции эпидемически значимых штаммов микроорганизмов в регионе. В 33% исследованных штаммов энтеробактерий выявлен оперон инвазивности, в 22,6% - ген шигоподобного токсина 1, и в 11,4% - ген белка фимбрий Н7, все культуры шигелл, выделенные от больных ОКИ, имеют оперон инвазивности. Выявление гена шиготоксина 1 в клинических изолятах S. flexneri 2а коррелирует с тяжелым проявлением заболевания.
Внедрение результатов работы
Подготовлена и прошла первый этап проверки в ГИСК им Л.А. Тарасевича документация (научно-производственный регламент, временная фармакопейная статья и инструкция по применению) на ПЦР тест-систему "Amply-Inv" для детекции бактерий рода Shigella и энтероинвазивных E.coli.
Подготовлено и опубликовано пособие для врачей «Принципы отбора, хранения и транспортировки биологических субстратов для проведения ПЦР-диагностики бактериальных и вирусных инфекций» (Н.Новгород, 2002).
Результаты, полученные при ПЦР-исследовании клинического материала от больных ОКИ, проб продуктов питания, объектов внешней среды использовались лечебными учреждениями для подтверждения этиологии в диагностике ОКИ и проведения адекватной этиотропной терапии, а центрами ГСЭН - при проведении санитарно-эпидемиологических мероприятий, что подтверждено актами внедрения.
9 Апробация работы
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Н. Новгород 2002), на научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Елкина И.И. "Актуальные проблемы эпидемиологии инфекционных болезней" (Н.Новгород, 2003), на заседании Ученого совета и межлабораторного семинара Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. РАМН И.Н. Блохиной. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ
Характеристика бактерий - возбудителей острых кишечных инфекций
ПЦР тест-система, разработанная на основе оригинальных праймеров, специфичных к оперону инвазивности, позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью проводить выявление шигелл и энтероинвазивных эшерихий в клиническом материале от больных ОКИ.
Применение в клинических исследованиях и санитарно-эпидемиологических мероприятиях ГЩР-детекции шигелл и сальмонелл позволяет более чем в 2 раза увеличить эффективность выявления указанных инфекционных агентов. 3. Экспериментальные отечественные ПЦР тест-системы для изучения патогенных свойств энтеробактерий позволяют получать новую, объективную информацию о наличии генетических детерминант факторов патогенности в клинических изолятах Shigella, Salmonella, E.coli. 4. Комплексное ПЦР-исследование на наличие бактерий родов Shigella, Salmonella, Campylobacter и Yersinia enterocolitica на стадии первичного анализа клинического материала от больных ОКИ позволяет в увеличить выявление этиологического фактора и проследить циркуляцию труднокультивируемых возбудителей ОКИ. Практическая значимость Созданная в ходе настоящей работы ПЦР тест-система для детекции шигелл и энтероинвазивных эшерихий в 2,5 раза эффективнее выявляет инфекционный агент в клиническом материале по сравнению с бактериологическим методом, сокращает время проведения анализа до одного рабочего дня. Апробированные и в ряде случаев оптимизированные экспериментальные тест-системы для выявления бактерий родов Shigella, Salmonella, Campylobacter и Yersinia enterocolitica позволяют увеличить выявляемость этиологического фактора ОКИ более чем в 2 раза. При проведении комплексного ПЦР-исследования клинического материала возбудитель ОКИ был выявлен методом ПЦР в 37% случаев, бактериологическим методом - в 16%. Использование метода ПЦР для характеристики патогенных свойств клинических изолятов энтеробактерий позволило получить объективную научную информацию о циркуляции эпидемически значимых штаммов микроорганизмов в регионе. В 33% исследованных штаммов энтеробактерий выявлен оперон инвазивности, в 22,6% - ген шигоподобного токсина 1, и в 11,4% - ген белка фимбрий Н7, все культуры шигелл, выделенные от больных ОКИ, имеют оперон инвазивности. Выявление гена шиготоксина 1 в клинических изолятах S. flexneri 2а коррелирует с тяжелым проявлением заболевания. Внедрение результатов работы Подготовлена и прошла первый этап проверки в ГИСК им Л.А. Тарасевича документация (научно-производственный регламент, временная фармакопейная статья и инструкция по применению) на ПЦР тест-систему "Amply-Inv" для детекции бактерий рода Shigella и энтероинвазивных E.coli. Подготовлено и опубликовано пособие для врачей «Принципы отбора, хранения и транспортировки биологических субстратов для проведения ПЦР-диагностики бактериальных и вирусных инфекций» (Н.Новгород, 2002). Результаты, полученные при ПЦР-исследовании клинического материала от больных ОКИ, проб продуктов питания, объектов внешней среды использовались лечебными учреждениями для подтверждения этиологии в диагностике ОКИ и проведения адекватной этиотропной терапии, а центрами ГСЭН - при проведении санитарно-эпидемиологических мероприятий, что подтверждено актами внедрения. Апробация работы Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Н. Новгород 2002), на научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Елкина И.И. "Актуальные проблемы эпидемиологии инфекционных болезней" (Н.Новгород, 2003), на заседании Ученого совета и межлабораторного семинара Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. РАМН И.Н. Блохиной. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.
Методики выделения ДНК в процессе подготовки к проведению ПЦР
Пробу исследуемого материала пересевали в пробирку с МПБ и инкубировали 18 часов при 37С. Отбирали 1,5 мл культуры в микропробирку и центрифугировали 10 мин при 8 тыс. об/мин. Осадок ресуспендировали в 1 мл стерильного физиологического раствора и центрифугировали в том же режиме. Надосадочную жидкость сливали, а осадок ресуспендировали в 200 мкл лизирующего раствора (0,2N NaOH и 10% SDS). В каждую пробирку вносили 2,5 мкл раствора протеиназы (150 мкг/мл) и инкубировали 1 час при 55С. Инактивировали протеиназу прогреванием при 96-100С в течение 5 минут. Центрифугировали 3 минуты при 12 тыс. об/мин. Отбирали 10 мкл надосадочной жидкости для постановки ПЦР.
Выделение ДНК из проб пищевых продуктов и смывов с объектов внешней среды кипячением Первые 3 этапа обработки проводили аналогично предыдущему методу. Процедуру отмывания осадка физиологическим раствором повторяли второй раз в той же последовательности. Надосадочную жидкость сливали, осадок ресуспендировали в 1 мл стерильной воды и проводили кипячение на водяной бане в течение 5 минут. Тщательно встряхивали и забирали 10 мкл раствора для постановки ПЦР. Выделение ДНК методом фенольно-хлороформной депротеинизации Для очистки ДНК из лизатов проб пищевых подуктов и смывов с объектов внешней среды проводили фенольно-хлороформную депротеинизацию в соответствии со стандартной методикой, описанной в руководстве Маниатиса Т. и соавторов "Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование" (Москва, "Мир", 1984), страницы 388, 403 -405. Выделение ДНК с помощью набора «ДНК-сорб-Б» (ЦНИИЭ МЗ РФ) Отбирали в микропробирку 500 мкл исследуемой пробы (смывы с объектов внешней среды и продуктов питания после 18-ти часовой инкубации в МПБ, спиртовая фекальная суспензия). Перемешивали пробы на вортексе, осаждали центрифугированием при 8-12 тыс. об/мин., супернатант сливали, осадок ресуспендировали в 100 мкл дистиллированной воды. В заранее приготовленные и промаркированные пробирки вносили по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО) и по 300 мкл лизирующего раствора (5,2 М гуанидинтиоцианат; 0,125 М Na-ЭДТА; 10 мМ трис-HCl, рН 8,0; 2 % Тритон Х-100), добавляли в каждую пробирку 100 мкл биологической пробы отдельными наконечниками. Перемешивали на вортексе, прогревали в течение 5 мин. при 65 С, перемешивали на вортексе до полного лизиса. Центрифугировали в течение 5 сек. при 5 тыс. об/мин. Если проба до конца не лизировалась, то центрифугировали ее в течение 5 мин при 10 тыс. об/мин и переносили надосадочную жидкость в новую пробирку. В каждую пробирку с лизатом добавляли по 25 мкл ресуспендированного сорбента, перемешивали на вортексе, выдерживали при комнатной температуре в течение 2 мин (до полного осаждения сорбента), после этого еще раз перемешивали и выдерживали в течение 5 мин. Осаждали сорбент при 5 тыс. об/мин. в течение 30 сек. Аккуратно удаляли супернатант. Добавляли по 300 мкл отмывочного раствора 1 (4,0 М гуанидинтиоцианат; 0,125 М Na-ЭДТА; 10 мМ трис-HCl рН 8,0; 0,5 % Тритон Х-100), перемешивали на вортексе до полного ресуспендирования сорбента. Сорбент осаждали при 5 тыс. об/мин. в течение 30 сек., удаляли супернатант. Вносили в пробирки по 500 мкл отмывочного раствора 2 (ОД М трис-НС1 рН 8,0; 0,01 М Na-ЭДТА; 0,05 М NaCl), перемешивали на вортексе до полного ресуспендирования сорбента. Центрифугировали в течение 30 с. при 10 тыс. об/мин. Удаляли супернатант и повторяли процедуру отмывки отмывочным раствором 2. Тщательно отбирали супернатант. Пробирки помещали в термостат при 65С на 5-10 мин. для подсушивания сорбента. К осадку сорбента добавляли 50 мкл элюирующего ТЕ-буфера (ЮмМ трис-HCl рН 8,0; 1 мМ Na-ЭДТА), ресуспендировали осадок встряхиванием на вортексе, прогревали суспензию в термостате при 65 С в течение 5 мин, периодически проводя перемешивания на вортексе. Центрифугировали при 12 тыс. об/мин в течение 1 мин. ДНК-пробы готовы к постановке ПЦР, супернатант содержит очищенную ДНК. Очищенную ДНК хранили до недели при плюс 2-8С и до года при минус 20С. Выделение ДНК с помощью набора «Рибо-сорб-50» (ЦНИИЭ МЗ РФ) В чистые микропробирки раскапывали по 10 мкл ВКО и по 450 мкл лизирующего раствора, аналогичного по составу из набора "ДНК-сорб-Б". Согласно маркировке, в каждую пробирку вносили по 100 мкл исследуемой пробы, перемешивали на вортексе. Вносили в пробирки по 25 мкл ресуспендированного сорбента, перемешивали на вортексе и оставляли на 1 минуту в штативе, после повторного перемешивания оставляли в штативе на 5 минут до полного осаждения сорбента. Центрифугировали пробирки при 10 тыс. об/мин в течение 30 сек. Надосадочную жидкость отбирали из пробирок, к осадку добавляли 400 мкл раствора для отмывки аналогичного по составу из набора «ДНК-сорб-Б». Ресуспендировали сорбент на вортексе и центрифугировали при 10 тыс об/мин в течение 30 сек. Надосадочную жидкость отбирали, к осадку добавляли по 500 мкл 70% этанола. После перемешивания на вортексе проводили центрифугирование при 10 тыс. об/мин в течение 30 сек. Надосадочную жидкость отбирали из пробирок и повторяли отмывку этанолом в том же режиме.
В каждую пробирку к осадку добавляли по 500 мкл ацетона, перемешивали на вортексе и центрифугировали при 10 тыс. об/мин в течение 30 сек. Полностью отбирали ацетон из пробирок, высушивали осадок в термостате при 60 С в течение 5 минут и ресуспендировали в 50 мкл элюирующего ТЕ-буфера. Прогревали пробирки при 60С в течение 5 минут, перемешивали на вортексе и осаждали сорбент при 10 тыс. об/мин 30 сек.
Анализ плазмидного состава энтеробактерий
В связи с этим была поставлена задача изучить возможность использования данных праймеров для детекции шигелл и энтероинвазивных эшерихии непосредственно в клиническом материале от больных ОКИ.
В результате исследований мы скомплектовали тест-систему для выявления оперона инвазивности, указанную в методике проведения ПЦР-амплификации фрагмента ДНК генома шигелл и энтероинвазивных эшерихии данной работы.
Программа амплификации специфического фрагмента ДНК оперона инвазивности была рассчитана исходя из нуклеотидного состава праймеров. Температура отжига праймеров в значительной степени влияет на специфичность получаемого продукта ПЦР. Она определяется длиной праймеров и содержанием ГЦ-пар, и рассчитывается по стандартным формулам. Существует несколько вариантов определения температуры отжига праймеров, один из них предложен в справочнике «Медицинские лабораторные технологии» под редакцией профессора А.И. Карпищенко («Интермедика», Санкт-Петербург, 1998, с. 589). Температуру отжига праймеров мы рассчитали по формуле: где А - адении, Т - тимин, Г - гуанин, Ц - цитозин (количество нуклеотидов).
Температура отжига праймеров, рассчитанная по формуле, не является окончательным вариантом. Специфичность продукта ПЦР и качество электрофореграммы зависит от модели амплификатора, варианта регулирования температурного режима в приборе и точности поддержания температуры в реакционной смеси. В связи с этим мы провели серию экспериментов с пошаговым повышением температуры отжига праймеров (один шаг - +1С). Эмпирически была выбрана температура отжига, при которой специфичность продукта ПЦР в клиническом материале максимально соответствовала положительному контролю.
Исследования фекалий и ректальных проб с использованием первого варианта тест-системы были выполнены на отечественной экспериментальной модели амплификатора производства Института Биофизики РАН, г. Пущино-на-Оке. Ввиду несовершенства данной модели амплификатора, эксперименты на клиническом материале не дали положительного результата. Прибор был пригодным только для проведения ПЦР с чистыми препаратами нуклеиновых кислот.
Получить интерпретируемые результаты по детекции шигелл в клиническом материале удалось при проведении ПЦР с использованием амплификатора "Ампли-250" фирмы "Biokom" (Москва), имеющего более широкие возможности программирования и стабильное поддержание температурно-временных параметров программ.
Экспериментальный вариант тест-системы был апробирован при расследовании случаев групповой заболеваемости дизентерией в соматических стационарах г. Нижнего Новгорода. Исследования проводились по заявкам городского центра ГСЭН совместно с его сотрудниками.
В городской психиатрической больнице №1 была зарегистрированы повторяющиеся вспышки дизентерии, вызванной штаммом Shigella flexneri 2а. Микробиологические исследования не выявили бактерионосителей среди пациентов и персонала. Для проверки предположения о бактерионосительстве было проведено обследование сотрудников и пациентов больницы методом ПЦР с использованием экспериментальной тест-системы на инфицированность шигеллами. Исследовали пробы фекалий от лиц, имеющих антитела к шигеллам. Всего было обследовано 40 человек. У 2 больных и 5 технических сотрудников были выявлены бактерии рода Shigella (рис.3). Они прошли дополнительный курс лечения, после чего повторное обследование методом ПЦР показало полную элиминацию возбудителя. В дальнейшем вспышки дизентерии в данном стационаре не регистрировались.
Экспериментальный вариант ПЦР тест-системы использовался также при расшифровке вспышки ОКИ в доме ребенка Автозаводского района г. Нижнего Новгорода. В короткий промежуток времени там были зарегистрированы две вспышки ОКИ, по клиническим признакам сходных с дизентерией. Однако у больных не удавалось выявить шигеллы традиционным бактериологическим методом.
Методом ПЦР во время первой вспышки было проведено обследование 15 детей, возбудители дизентерии были выявлены у 3 человек. Во время второй вспышки при обследовании 10-ти детей с подозрением на дизентерию, без бактериологического подтверждения диагноза, у 3-х также были выявлены шигеллы методом ПЦР.
Следует отметить, что при работе с клиническим материалом с использованием данного варианта ПЦР тест-системы возник ряд трудностей.
Не увенчались успехом попытки использовать как способ пробоподготовки нагревание образцов фекалий и ректальных проб на кипящей водяной бане. После подобной обработки не наблюдалось амплификации специфического фрагмента, что, по-видимому, связано с ингибированием ДНК-полимеразы полисахаридами фекалий и другими макромолекулами. Фенольно-хлороформная депротеинизация оказалась более приемлемым вариантом обработки анализируемого материала.
Тем не менее, интенсивность амплификации оставалась низкой, что сказывалось на чувствительности и качестве электрофореграммы (слабое свечение специфических фрагментов, шлейфы продуктов неспецифического синтеза).
Качественный результат был получен после инкубации проб в селенитовом бульоне в течение 18 часов при 37С и последующем выделении ДНК методом фенольно-хлороформной депротеинизации. Введение стадии культивирования существенно увеличивало продолжительность исследования.
В таком варианте метод не соответствовал требованиям, предъявляемым к тест-системам для практического здравоохранения.
Разработка ПЦР тест-системы для экспресс-детекции шигелл и энтероинвазивных эшерихий
На этапе проверки специфичности тест-системы мы оптимизировали программу амплификации, что позволило сократить время проведения ПЦР и улучшить качество результата: «горячий старт» сократили с 10 до 4 минут, процесс проводили при температуре отжига праймеров 57 С. Кроме этого, на 25% было уменьшено количество вносимых в реакционную смесь праймеров, что улучшило качество электрофореграммы.
Проведенные исследования показали высокую специфичность и достаточную чувствительность ПЦР тест - системы для детекции бактерий рода Salmonella, разработанной ГУ МНИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. Проведенная модификация улучшила ее рабочие характеристики.
Полевые и клинические испытания тест-системы осуществлялись при проведении плановых и экстренных мероприятий санитарно-эпидемиологического контроля над предприятиями промышленного птицеводства, общественного питания и торговли, и при расшифровке вспышек ОКИ.
Совместно с сотрудниками центра ГСЭН г. Н. Новгорода нами обследованы мясокомбинат №1, продуктовые рынки Ленинского и Сормовского районов г. Н. Новгорода. Производились смывы с продуктов питания (тушки кур, мясо и т.д.), оборудования, торгового инвентаря, прилавков. Пробы забирали одновременно для ПЦР-исследования и бактериологического анализа. Микробиологические исследования на наличие бактерий рода Salmonella проводили специалисты бактериологической лаборатории городского центра ГСЭН.
Проанализировано 78 образцов. В 30% из них методом ПЦР были выявлены сальмонеллы, микробиологическим методом они были выделены из 12% смывов. При этом следует отметить, что все пробы, давшие положительный результат при бактериологическом исследовании, оказались положительными и при ПЦР-детекции. Данная ПНР тест-система для выявления бактерий рода Salmonella была использована нами при выяснении причин повторяющихся внутрибольничных вспышек сальмонеллеза в больнице №35 г. Нижнего Новгорода в 1998 году. При проведении эпидемиологического расследования вспышек ОКИ городской службой ГСЭН в результате серологического скрининга на антитела к сальмонеллам среди технического персонала больницы № 35 были выявлены 2 работника с серопозитивной реакцией. Бактериологический анализ положительных результатов не дал. Проведенное ПЦР-исследование проб фекалий этих сотрудников на бактерии рода Salmonella выявило наличие сальмонелл, что могло свидетельствовать о бессимптомном носительстве. После лечения носителей инфекции вспышки сальмонеллеза в больнице №35 не повторялись.
Таким образом, апробированная тест-система показала свою эффективность при проведении санитарно-эпидемиологических исследований. Тем не менее, ряд ее недостатков не позволяет рекомендовать ее для практического применения.
Для стабильной работы тест-системы необходим отбор материала и культивирование его в накопительной среде, что увеличивает продолжительность исследования. В процессе работы довольно часто наблюдался неспецифический синтез, затрудняющий интерпретацию результата. Компановка тест-системы каждым ингредиентом реакционной смеси по отдельности (6 пробирок) усложняет этап постановки ПЦР, увеличивает вероятность неспецифического синтеза.
Вторая тест-система для детекции бактерий рода Salmonella, «Ампли-сенс - Salmonella species 250», апробированная нами при проведении санитарно-эпидемиологических и клинических исследований, является разработкой Центрального НИИ эпидемиологии МЗ РФ. Она представляет собой комплект из двух реакционных смесей: нижней, включающей в себя праймеры и дНТФ и верхней, состоящей из компонентов буфера для проведения ПЦР, Tag-полимеразы, красителя-маркера веса для электрофореза. До начала процесса ПЦР смеси разделены восковой перегородкой, предотвращающей возможность неспецифического синтеза на стадии подготовки рабочей смеси. Праймеры, входящие в состав тест-системы, позволяют амплифицировать фрагмент гена белка фимбрий сальмонелл размером 225 п.н.
При первичном контроле система «Ампли-сенс - Salmonella species 250» показала такую же специфичность, как и тест-система разработки ГУ МНИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, а аналитическая чувствительность была выше в 2 раза и составила 500 кл/мл (табл.10).
Применение на стадии подготовки проб сорбционной технологии, более удобное комплектование реактивов для ПЦР — всего 2 пробирки с компонентами, составляющими реакционную смесь, делает тест-систему разработки ЦНИИЭ МЗ РФ более технологичной и удобной в работе. Все дальнейшие практические исследования проводились с использованием данной тест-системы. Единственным изменением при ее внедрении в работу было повышение температуры отжига праймеров на 2С. Необходимость этого была связана с индивидуальными особенностями используемых нами ДНК-амплификаторов. Практические испытания тест-системы проведены во время плановых и экстренных санитарно-эпидемиологических мероприятий. В июне 1999 года была зарегистрирована вспышка сальмонеллеза в Городецком районе Нижегородской области. Предположительно источником инфицирования могла быть продукция птицеводства. В связи с этим была проведена проверка санитарного режима на Балахнинской птицефабрике. Исследования проводились совместно с сотрудниками бактериологической лаборатории областного центра ГСЭН и эпидемиологического отдела центра ГСЭН г. Балахны. Были сделаны смывы с оборудования в убойном цехе на разных этапах технологического процесса, с тушек птиц в процессе обработки, с яиц, спецодежды и рук персонала, складского оборудования. Всего проанализировано 34 пробы. Несмотря на то, что непосредственно перед проверкой на фабрике провели санитарную обработку, мы выявили высокую обсемененность сальмонеллами на всех этапах технологического процесса. Микроорганизмы методом ПЦР были выявлены в 20 образцах (58,9%), при бактериологическом исследовании в 18 пробах (52,9%). Во всех пробах, давших положительный результат в бактериологическом анализе, сальмонеллы были выявлены и методом ПЦР. Тест система «Ампли-сенс - Salmonella species 250» применена при плановой проверке санитарного состояния продовольственного рынка Советского района г. Н.Новгорода. Было проведено исследование 38 смывов с продуктов птицеводства, торгового оборудования, одежды и рук продавцов. Методом ПЦР сальмонеллы выявлены в 7 пробах (18,4%), при микробиологическом исследовании только 1 проба (2,6%) была положительна. Сальмонеллы выявлены только в смывах с продуктов птицеводства, оборудования, контактирующего с такой продукцией и рук продавцов, торгующих ею.
