Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Механизм действия бета-лактамных антибиотиков 11
1.2. Механизмы антибактериальной устойчивости 11
1.3. Классификация и происхождение бета-лактамаз 13
1.4. Характеристика сериновых бета-лактамаз 17
1.4.1. Бета-лактамазы класса А 17
1.4.2. Бета-лактамазы класса С 23
1.4.3. Бета-лактамазы класса D 27
1.5. Характеристика металло-бета-лактамаз (МБЛ) 28
1.6. Генетическая локализация бета-лактамаз 30
1.6.1. Генетическая локализация сериновых бета-лактамаз класса А 30
1.6.2. Генетическая локализация МБЛ 32
1.6.3. Генетическая локализация сериновых бета-лактамаз класса С 33
1.7. Клиническое значение бета-лактамаз 34
1.7.1. Клиническое значение бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС) 34
1.7.2. Клиническое значение бета-лактамаз АтрС 34
1.7.3. Клиническое значение МБЛ 36
1.8. Детекция бета-лактамаз 37
1.8.1. Критерии чувствительности грамотрицательных микроорганизмов к бета-лактамным антибиотикам (БЛА) 37
1.8.2. Фенотипические методы детекции бета-лактамаз 40
1.8.3. Молекулярные методы в исследовании феномена устойчивости к БЛА 44
1.9. Белковое моделирование 49
Глава 2. Материалы и методы исследования 53
2.1. Бактериальные штаммы 53
2.2. Анализ фенотипов антибиотикорезистентности 54
2.2.1. Определение чувствительности к антимикробным препаратам 54
2.2.2. Фенотипические тесты на наличие бета-лактамаз 55
2.3. Идентификация штаммов методом прямого белкового профилирования 57
2.4. Генетический анализ исследуемых штаммов 59
2.4.1. Определение нуклеотидной последовательности гена 16SpPHK 59
2.4.2. Выявление генетических маркеров устойчивости к БЛА 59
2.5. Моделирование пространственной структуры новой бета-лактамазы AmpC-new методом предсказания структуры по гомологии 62
Глава 3. Результаты 64
3.1 Использование метода прямого белкового профилирования для идентификации микроорганизмов, включенных в исследование 64
3.2 Анализ чувствительности к антибиотикам грамотрицательных микроорганизмов - возбудителей нозокомиальных инфекций 72
3.2.1. Анализ профилей чувствительности клинических изолятов К. pneumonia 72
3.2.2. Анализ профилей чувствительности клинических изолятов представителей семейства Enterobacteriaceae (кроме К. pneumoniae) 76
3.2.3. Анализ профилей чувствительности клинических изолятов A. haumanii 79
3.2.4. Анализ профилей чувствительности клинических изолятов P. aeruginosa 83
3.3. Расшифровка механизмов устойчивости к БЛА у грамотрицательных микроорганизмов - возбудителей нозокомиальных инфекций 89
3.3.1. Расшифровка механизмов устойчивости К. pneumoniae к БЛА 89
3.3.2. Расшифровка механизмов устойчивости у представителей семейства Enterobacteriaceae (кроме 93 К. pneumoniae) к БЛА
3.3.2.1. Случаи выявления AmpC у изолятов семейства Enterobacteriaceae .-: 96
3.3.2.2. Случай выявления МБЛ у штамма E.coli 100
3.3.3. Расшифровка механизмов устойчивости A. baumanii к БЛА 102
3.3.4. Расшифровка механизмов устойчивости Р. aeruginosa к БЛА 103
3.4. Оценка чувствительности и специфичности фенотипических тестов для выявления бета-лактамаз различных классов 104
3.4.1. Применение теста с клавулановой кислотой для выявления штаммов, продуцирующих БЛРС 104
3.4.2. Применение трехмерного АтрС-теста для выявления штаммов, продуцирующих бета-лактамазы класса С. 106
3.4.3. Применение метода двойных дисков с этилен-диамин-тетрауксусной кислотой для выявления штаммов, продуцирующих МБЛ 108
Глава 4. Обсуждение 109
Заключение 121
Выводы 122
Список литературы 12
- Классификация и происхождение бета-лактамаз
- Критерии чувствительности грамотрицательных микроорганизмов к бета-лактамным антибиотикам (БЛА)
- Фенотипические тесты на наличие бета-лактамаз
- Анализ профилей чувствительности клинических изолятов К. pneumonia
Введение к работе
Широкое применение в медицинской практике антибиотиков привело к
значительным изменениям в этиологической структуре и росту
антибактериальной резистентности возбудителей инфекционных болезней [33].
Инфекции, вызванные резистентными штаммами, отличаются длительным
течением, чаще требуют госпитализации, при этом увеличивается
продолжительность пребывания в стационаре и ухудшается прогноз для пациентов [164].
Многочисленные негативные социально-экономические последствия распространения антибактериальной резистентности вынудили Всемирную организацию здравоохранения (ВОЗ) разработать и опубликовать в 2001 году «Глобальную стратегию ВОЗ по сдерживанию устойчивости к противомикробным препаратам», в которой рекомендовано рассматривать указанную проблему в качестве одного из приоритетов национальных систем здравоохранения [1]. В приведенном документе указывается, что расшифровка молекулярных механизмов резистентности необходима для создания новых препаратов и средств диагностики, а также для оптимизации режимов этиотропной терапии.
Проблема антибактериальной резистентности представляется особо актуальной в лечении нозокомиальных инфекций, распространение которых лишь возрастает по мере совершенствования медицинских технологий, существенно расширяющих круг критических состояний, поддающихся эффективной терапии. Интенсивный селективный прессинг антибиотиков, обусловливает быструю эволюцию и распространение новых механизмов резистентности в медицинских учреждениях и, прежде всего, в отделениях реанимации и интенсивной терапии.
Одними из ведущих возбудителей нозокомиальных инфекций являются грамотрицательные бактерии (семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Acinetobacter и некоторые другие) [2].
Традиционно основу лечения инфекций, вызываемых бактериями этой группы, составляли бета-лактамные - антибиотики и, прежде всего, цефалоспорины III поколения. Однако эффективность этой группы антибиотиков в последние годы резко снизилась в связи с распространением среди возбудителей нозокомиальных инфекций штаммов, продуцирующих бета-лактамазы расширенного спектра класса А (группа 2Ье по К. Bush, [37]). Альтернативу цефалоспоринам III поколения составляют цефалоспорины IV
поколения, карбапепемы и ипгибитор-защищенные бета-лактамы, применение которых в медицинской практике постоянно расширяется.
В ответ на изменения в стратегии и тактике применения антибиотиков в различных регионах мира происходят изменения в распространении отдельных групп и классов бета-лактамаз - смена лидирующих групп [4]. К наиболее важным тенденциям следует отнести увеличение частоты выделения бета-лактамаз класса С (группы 1 и 1е по K.Bush, [37]) и появление карбапенемаз, прежде всего, относящихся к классу В (группы 3 и За по K.Bush, [37]) -металло-бета-лактамаз.
Своевременное выявление изменений в распространении бета-лактамаз имеет важное практическое и теоретическое значение, так как позволяет корректировать рекомендации по антибактериальной терапии нозокомиальных инфекций, разрабатывать экспрессные молекулярные методы детекции антибактериальной резистентности, дает важную информацию для создания новых препаратов, преодолевающих резистентность.
В настоящее время детекция бета-лактамаз основана на микробиологических методах, таких как диско-диффузионный, метод серийных разведений в бульоне, метод двух дисков, а также с применением различных коммерческих тестов, основанных на ферментативных колориметрических реакциях. Перечисленные традиционные микробиологические методы подходят для фенотипическои характеристики микроорганизма. Однако, при детекции бета-лактамаз они, в лучшем случае, позволяют оценить факт наличия фермента, но не дают информацию о том, какой именно из нескольких сотен видов фермента присутствует. Ввиду этого одним из перспективных направлений в изучении и диагностики бета-лактамаз является использование молекулярно-генетических подходов: полимеразной цепной реакции (ПЦР), секвенирования, мшшсеквепирования [3].
Кроме того, при проведении мониторинга устойчивости микроорганизмов к бета-лактамазам важное место занимает адекватная видовая идентификация патогенов. Классические методы идентификации и типирования бактерий (бактериологический анализ) имеют ряд недостатков: сложность стандартизации, трудоемкость, время выполнения 48-72ч, необходимость поддержания жизнеспособности микроорганизма до проведения анализа и не всегда дают достоверную информацию о микробном агенте. Поэтому все большую популярность получают молекулярные методы идентификации микроорганизмов, в том числе масс-спектрометрический анализ [180].
В рутинной лабораторной практике из-за недостатка оборудования и отработанных протоколов исследования невозможно точно определить детерминанты устойчивости микроорганизмов к тем или иным антимикробным препаратам. С момента обнаружения первого фермента бета-лактамазы в 60-е годы эти ферменты эволюционировали, с каждым годом растет их разнообразие, происходит смена лидирующих групп [4]. Поэтому изучение молекулярно-генетических механизмов устойчивости к бета-лактамным антибиотикам у грамотрицательных микроорганизмов методами бактериологического и молекулярно-генетического анализа является актуальным как в научном аспекте, так и в плане решения конкретных практических проблем.
Цель исследования: изучение молекулярно-генетических особенностей устойчивости к бета-лактамным антибиотикам у грамотрицательных микроорганизмов - возбудителей нозокомиальных инфекций - с помощью методов бактериологического и молекулярно-генетического анализа.
Для достижения поставленной цели были определены основные задачи:
Формирование лабораторной коллекции изолятов грамотрицательных бактерий, полученных из клиник различных городов Российской Федерации (РФ).
Видовая идентификация коллекции изолятов методом прямого белкового профилирования и оценка эффективности данного подхода для рутинного определения видовой принадлежности клинических изолятов.
Фенотипическая характеристика полученных изолятов и оценка чувствительности и специфичности фенотипических тестов для выявления бета-лактамаз различных классов у грамотрицательных микроорганизмов - возбудителей нозокомиальных инфекций.
Характеристика генетического разнообразия различных детерминант устойчивости грамотрицательных микроорганизмов — возбудителей нозокомиальных инфекций - к бета-лактамным антибиотикам.
Научная новизна.
Показано преимущество метода прямого масс-спектрометрического профилирования для видовой идентификации бактерий семейства Enlerobacteriaccae и неферментирующих грамотрицательных бактерий рода Pseudomonas или Acinetobacter.
Установлено генетическое разнообразие всей совокупности генов бета-лактамаз, выявляемых среди изолятов семейства Enterobacteriaceae и неферментирующих грамотрицательных бактерий рода Pseudomonas и Acinetobacter.
На основании анализа пуклеотидной последовательности геномной ДНК Enterobacter asburiae обнаружен ген blaAmpC, кодирующий не описанную ранее последовательность бета-лактамазы. Структура данного фермента изучена методом молекулярного моделирования.
Впервые на территории РФ у представителя семейства Enterobacteriaceae, изолированного из мочи пациента интенсивной терапии Научно-исследовательского института нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко РАМН, обнаружен ген ошуш-4> кодирующий металло-бета-лактамазу и описано его генетическое окружение. '
Практическая значимость.
Результаты, полученные в ходе исследований по теме диссертационной работы, были использованы в клинической практике лаборатории микробиологии Национального агентства по клинической фармакологии и фармации для идентификации микроорганизмов и скрининга бета-лактамаз.
Результаты диссертационной работы были систематизированы и внедрены в
педагогическую практику кафедры микробиологии РМАПО
Минздравсоцразвития.
В приложении представлены копии документов, подтверждающих практическую значимость работы (справки от лаборатории микробиологии Национального агентства по клинической фармакологии и от кафедры микробиологии РМАПО Минздравсоцразвития).
Основные положения, выносимые на защиту:
Изучены молекулярно-генетические особенности устойчивости к бета-лактамным антибиотикам па основе сформированной коллекции из 145 изолятов грамотрицательных микроорганизмов - возбудителей нозокомиальных инфекций
Показана эффективность метода прямого белкового профилирования для видовой идентификации исследуемых грамотрицательных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae и неферментирующих грамотрицательных бактерий рода Pseudomonas или Acinetobacter.
Фенотипическая характеристика полученных изолятов с применением панелей скринипговых и подтверждающих тестов с оценкой их чувствительности и специфичности показала большое разнообразие профилей антибиотикочувствительности у исследуемых возбудителей нозокомиальных инфекций.
С использованием оригинальных ПЦР тест-систем установлены генетические детерминанты (гены бета-лактамаз классов А, В, С и D),
обусловливающие формирование устойчивости к бета-лактамным антибиотикам. 5. Установлены новые механизмы резистентности к бета-лактамным антибиотикам. На основании анализа нуклеотидной последовательности геномной ДНК изолята Е. asburiae обнаружен ген blaAmpC, кодирующий не описанную ранее аминокислотную последовательность фермента, структура белка изучена методом молекулярного моделирования. Впервые на территории РФ обнаружен клинический изолят Escherichia coli, содержащий ген металло-бета-лактамазы VIM-4, что свидетельствует о начавшемся процессе передачи этих генов от Pseudomonas spp к представителям семейства Enterobacteriaceae, потенциально приводящему к снижению эффективности карбапенемов в терапии инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями.
Классификация и происхождение бета-лактамаз
Эволюция бактерий, приводящая к возникновению у них резистентности к БЛА, происходила по следующим направлениям [37, 65, 90, 110, 112, 122]:
Снижение проницаемости внешней мембраны. Этот механизм в основном распространен среди грамотри нательных микроорганизмов, обладающих внешней мембраной. Он является наименее специфичным в отношении антибиотиков разных групп. Транспорт гидрофильных антибиотиков внутрь микробной клетки осуществляется через пориновые каналы. Нарушение проницаемости оболочки микробной клетки достигается путем угнетения экспрессии пориновых белков. Изначальная роль этих белков состоит в пассивном транспорте аминокислот, но исследования показали, что они ответственны также за транспорт остальных БЛА [97], [104]. При утрате этих белков эффективность транспорта антибиотика резко снижается, что проявляется в формировании устойчивости к нескольким классам препаратов.
Изменение структуры ПСБ. Структура мишеней действия антибиотиков изменяется в результате спонтанных мутаций, делеций, дупликаций в кодирующих их генах. Такие генетические перестройки ведут к модификации мишени действия антибиотика и как следствие к снижению (или утрате) эффективности связывания мишени с антибиотиком. Активный транспорт антибиотика из клетки (эффлюкс). Система эффлюкса - это энергозависимый механизм, распознающий и выводящий из микробной клетки ряд химически и структурно экзогенных веществ без разрушения или изменения их структуры. Известно 5 больших семейств транспортных систем, обеспечивающих активное выведение экзогенных веществ из бактериальной клетки [99]: ABC, MFS, RND, SMR и MATE. Наиболее распространенные и многочисленные из них MFS (Major facilitator superfamily) - т.н., основная группа, и ABC (ATP-binding cassette) - группа АТФ связывающих кассет. Гены систем эффлюкса обычно локализованы на хромосоме, однако есть данные о нахождении этих генов на мобильных генетических элементах [177]. «Вазовая» активность систем эффлюкса во многом определяет уровень природной чувствительности бактерий к антибиотикам. г. Инактивация антибиотика (синтез бета-лактамаз - ферментов, разрушающих антибиотики). Бета-лактамазный механизм резистентности микроорганизмов является, безусловно, наиболее действенным и распространенным. В результате реакции свободной гидроксильной группы аминокислоты серина с бета-лактампым кольцом антибиотиков образуется эфирный комплекс. При взаимодействии БЛА и ПСБ образующийся комплекс оказывается достаточно стабильным, благодаря чему и подавляется функциональная активность ПСБ. Комплекс, образующийся при взаимодействии антибиотиков и бета-лактамаз, оказывается крайне нестабильным. Вначале фермент нековалентно соединяется с антибиотиком, в результате образуется нековалептный комплекс Михаэлиса (рис. 1). Затем в результате реакции свободной гидроксильной группы аминокислоты серина, входящей в активный центр фермента, с бета-л актам ным кольцом образуется нестабильный ацилэфирный комплекс, быстро подвергающийся гидролизу. В результате гидролиза высвобождается активная молекула фермента и разрушенная молекула антибиотика. В течение секунды одна молекула фермента может разрушить до 1000 молекул антибиотика. Резистентность бактерии к пепициллинам, связанная с разрушением последних бста-лактамазами, была обнаружена уже в конце 40-х годов и ознаменовала возникновение, так называемой, «пенициллиновой проблемы». До недавнего времени классификация бета-лактамаз основывалась на их гидролитическом спектре, степени чувствительности к ингибиторам и на локализации в геноме (хромосомная или плазмидная). Большое значение при этом придавалось тому, гпдролизовался ли цефалоридин быстрее, чем бензилпенициллип или наоборот, и тому, инактивировался ли фермент клоксациллином, клавулапатом или азтреонамом. Впервые такая классификация была предложена в 1970-м году Джейком и Ричмондом [85] и была дополнена Ричмондом и Сайксом в 1973-м году [151]. Неточности данной классификации были выявлены в течение последующих 15-ти лет, и К. Буш в 1989-м году предложила значительную реорганизацию [36], которую впоследствии расширила до полноценной классификации [37]. В последнем варианте классификации Буш разделяет бета-лактамазы по их субстратной специфичности к пенициллину, оксациллину, карбенициллину, цефалоридину, цефалоспорипам расширенного спектра действия и карбапенемам, а также по их чувствительности к действию ингибиторов (клавулановой кислоты) (Табл.1).
Фенотипическая классификация сталкивается с проблемой того, что точечные мутации могут значительно изменять субстратную специфичность [88, 137] и чувствительность к ингибиторам [178], изменяя таким образом принадлежность к группе. В такой ситуации функциональная классификация бета-лактамаз становится малоэффективной даже при использовании большого набора (20 и более) типов антибиотиков в сочетании с экспериментами по конъюгации плазм ид и определению изоэлектрических точек. Эта проблема становится особенно актуальной при наличии в клиническом изоляте двух или более различных типов бета-лактамаз. Поэтому все большее значение приобретает молекулярная классификация бета-лактамаз, предложенная Амблером [8]. Эта классификация стабильна, так как отражает фундаментальные свойства молекул. Она основана на анализе генов бета-лактамаз, сравнении их аминокислотных последовательностей и четвертичных структур этих ферментов. Более того она простая, так как выявляет всего 4 класса (A-D).
В настоящее время функциональная классификация подразделяет все известные бета-лактамазы на 3 функциональные группы (Табл. 1). В первую группу входят ферменты, относящиеся к молекулярному классу С. Это бета-лактамазы типа АтрС. Их также называют цефалоспориназами из-за характерной особенности этой группы проявлять большую активность к цефалоспориновым антибиотикам по сравнению с пенициллиновыми. Кроме того эти бета-лактамазы имеют низкую чувствительность к действию ингибиторов. Во вторую группу входят ферменты, относящиеся к молекулярным классам А и D. Гены этих ферментов входят в состав плазмид, поэтому они быстро распространяются между различными штаммами.
Критерии чувствительности грамотрицательных микроорганизмов к бета-лактамным антибиотикам (БЛА)
Бета-лактамазы, как уже было сказано, обладают широким спектром активности, в той или иной степени они гидролизуют практически всех представителей бета-лактамных антибиотиков. Однако наличие у микроорганизма детерминанты устойчивости к какому-либо антибиотику далеко не всегда означает клиническую неудачу при лечении этим препаратом. Применительно к микроорганизмам, продуцирующим БЛРС, наиболее остро стоит вопрос о возможности применения для лечения соответствующих инфекций цефалоспоринов III—IV поколения. Решение этого вопроса имеет свою историю и тесно связано с проблемой разработки критериев чувствительности грамотрицательных микроорганизмов к бета-лактамным антибиотикам.
Критерии чувствительности грамотрицательных микроорганизмов к цефалоспоринам III поколения Институт клинических и лабораторных стандартов США (CLSI) [47] установил в начале 80-х годов, вскоре после появления первых представителей этой группы антибиотиков в практической медицине. Штаммы энтеробактерий рассматривали как чувствительные при величине МІЖ 8 мкг/мл и меньше, как резистентные при величине МПК 32 мкг/мл и больше. Однако следует признать, что эти критерии были избраны во многом по аналогии с критериями, установленными для полусинтетических пенициллинов и ранних цефалоспоринов. Предложенные критерии удачно учитывали микробиологические, фармакокинетические и клинические параметры этих препаратов, но не цефалоспоринов III поколения. Приведенные выше критерии были приняты для цефалоспоринов III поколения, несмотря на то, что по ряду свойств эти антибиотики существенно отличаются от своих предшественников. Несмотря на то, что критерии чувствительности грамотрицательных микроорганизмов к цефалоспоринам III поколения были недостаточно обоснованы, в течение некоторого времени они удовлетворяли практическим запросам. Проблемы появились после формирования у грамотрицательных микроорганизмов новых механизмов устойчивости.
В первых сообщениях БЛРС описывали как ферменты, проявляющие высокий уровень устойчивости к цефалоспоринам III поколения (МПІ032-64 мкг/мл). Но к концу 80-х - началу 90-х годов было установлено, что величины МІЖ некоторых цефалоспоринов в отношении штаммов, продуцирующих БЛРС, могут быть в пределах критериев чувствительности (2-8 мкг/мл), но все же выше, чем для так называемой дикой популяции (0,03-0,5 мкг/мл). Вскоре появились сообщения о снижении клинической эффективности цефалоспоринов III поколения при инфекциях, вызванных штаммами микроорганизмов, продуцирующими БЛРС (но по формальным критериям чувствительными) [35].
В качестве одного из объяснений указанных эффектов приводят наблюдения о наличии выраженного "эффекта инокулюма" при оценке чувствительности штаммов, продуцирующих БЛРС. Этот эффект заключается в резком повышении величины МІЖ антибиотика (от 1 до 64 мкг/мл и выше) при увеличении посевной дозы возбудителя от 10 КОЕ/млдоЮ КОЕ/мл.
При последующих наблюдениях различными авторами были получены противоречивые данные. Так, имеются сообщения о высокой эффективности цефалоспоринов III поколения при лечении инфекций, вызванных штаммами, продуцирующими БЛРС [25]. В то же время в недавно опубликованной работе были суммированы собственные данные авторов и некоторые из ранее опубликованных сообщений о результатах лечения цефалоспориновыми антибиотиками инфекций, вызванных штаммами семейства Enterobacteriaceae, продуцирующими БЛРС, но по формальным критериям CLSI относящимися к чувствительным или промежуточным. Таким образом, экспериментальные данные и фармакодинамические расчеты показывают, что бактериологический и клинический эффект бета-лактамов зависит от величины МІЖ этих антибиотиков в отношении возбудителя, а не от наличия или отсутствия того или иного механизма устойчивости. Надежный бактериологический и клинический эффект всех бета-лактамов, в том числе и цефалоспоринов, может быть получен в том случае, если концентрация антибиотика в очаге инфекции превосходит его МПК в отношении возбудителя в течение 40% - 60% времени от длительности интервала дозирования. Зная параметры фармакокинетики цефалоспоринов можно рассчитать значения МПК, при которых антибиотики будут проявлять достаточный уровень эффективности. Эти значения позволяют определять, какие возбудители будут клинически чувствительны, а какие устойчивыми, то есть по существу они являются критериями чувствительности.
Описанный подход к обоснованию критериев чувствительности используется Европейским комитетом по оценке антибиотикочувствительности (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing - EUCAST) (www.eucast.org) . В таблице 2 приведено сопоставление критериев, предлагаемых CLSI и EUCAST, для оценки чувствительности энтеробактерий к основным бета-лактамам.
Из представленных данных следует, что использование критериев CLSI неизбежно приводит к получению результатов о ложной чувствительности энтеробактерий и негативным клиническим последствиям. Детекция продукции БЛРС в части случаев, вероятно, позволит избежать необоснованного назначения цефалоспоринов, однако, этот метод не позволяет прогнозировать эффективность лечения цефалоспоринами при снижении чувствительности, вызванном другими механизмами. В то же время в случаях незначительного повышения устойчивости, даже обусловленного продукцией БЛРС, некоторые из цефалоспоринов могут сохранять эффективность, но формальное выполнение рекомендаций CLSI приведет к необоснованному исключению этих антибиотиков из рекомендаций по лечению.
Фенотипические тесты на наличие бета-лактамаз
Чувствительность штаммов к ампициллину, амоксициллин с добавлением клавулановой кислоты, цефокситину, цефоперазону/сульбактаму (2:1), цефотаксиму, цефепиму, цефепиму/сульбактаму (2:1) цефтазидиму, меропенему, имипенему, а также гентамицину, амкацину, хлорамфениколу, ципрофлоксацину определяли методом серийных микроразведений в бульоне Мюллера-Хинтона (BD, США) согласно рекомендациям и критериями CLSI [81] в 96-лунковых планшетах для иммунологических исследований. Для определения МІЖ использовали следующий диапазон конечных концентраций антибиотиков в лунках: от 256,0 до 0,125 мкг/мл для ампициллина, амоксициллина/клавуланата, гентамицина, амикацина, цефотаксима, цефепима, ципрофлоксацина; от 32,0 до 0,016 мкг/мл для имипинема, меропенема, от 128,0 до 0,0625 мкг/мл для всех остальных антибиотиков.
Планшеты для оценки антибиотикочувствительности готовили следующим образом. В лунки 96-луночных планшет для иммунологических исследований вносили по 16,0 мкл растворов антибиотиков с таким расчетом, чтобы при 2-кратном разведении в лунках планшет создавались концентрации, соответствующие заданным. Планшеты с растворами антибиотиков замораживали при -70 С и хранили не более 2 недель. Для проведения исследования планшеты после извлечения из холодильника выдерживали до достижения ими комнатной температуры, после чего проводили инокуляцию приготовленной суспензией исследуемого микроорганизма.
Для приготовления инокулюма использовали чистую суточную культуру микроорганизмов, выросших на плотных питательных средах. Отбирали несколько однотипных, четко изолированных колоний, выросших на неселективной плотной питательной среде (агар Мюллера-Хинтона (BD, США)). Петлей переносили незначительное количество материала с верхушек колоний в пробирку со стерильным физиологическим раствором, доводя плотность инокулюма до 0,5 по стандарту МакФарланда. Суспензию разбавляли в бульоне Мюллера-Хинтона (BD, США) до концентрации 105 КОЕ/мл. Инокулюм использовали в течение 15 минут после приготовления.
Приготовленную суспензию вносили с помощью 8-канальной автоматической пипетки по 100,0 мкл в лунки планшет (предварительно размороженных). В первый ряд лунок вносили дополнительно 100 мкл инокулюма, затем суспензию с растворенным в ней антибиотиком перемешивали и переносили по 100 мкл раствора во второй ряд планшета, содержавшего первоначально 100 мкл суспензии. Эту процедуру повторяли, пока не был приготовлен весь необходимый ряд разведений. Из последнего ряда планшета 100 мкл бульона удаляли. Таким образом, получали планшет с растворами антибиотиков, концентрации которых отличаются в соседних рядах в 2 раза.
Инокулированные планшеты инкубировали в течение 18 ч при 35-370С. За МІЖ принимали наименьшую концентрацию антибиотика, подавляющую видимый рост микроорганизма.
Также при исследовании инокулюм-эффекта на чувствительность к меропенему, имипенему, дорипенему и эртапенему у штамма Е. со И (№55) использовали метод микроразведений в бульоне Мюллера-Хинтона (BD, США). В этом методе использовали стандартную концентрацию бактериальной суспензии (5x105 КОЕ/мл) и концентрацию, увеличенную в 100 раз (5x107 КОЕ/мл). В среду добавляли 2,3,5-трифенилтетразол-хлорид (Sigma, США) до конечной концентрации 0,005% для колориметрической детекции роста бактериальных культур.
Комбинацию цефтазидим/клавуланат использовали для детекции бета-лактамаз расширенного спектра методом серийных микроразведений в бульоне Мюллера-Хинтона (BD, США) согласно рекомендациям и критериями CLSI [81] (снижение величины МІЖ в сравнении с изолированным цефтазидимом более чем в 3 раза). Использовали постоянную концентрацию клавуланата 4,0 мкг/мл. Также в исследовании штамма Е. coli (№55) использовали метод двойных дисков с клавулановой кислотой. Постановку диско-диффузионного теста осуществляли в соответствии с методическими указаниями по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам [10]. Для приготовления инокулюма использовали чистую суточную культуру исследуемого микроорганизма, выращенную на неселективной плотной питательной среде (агар Мюллера-Хинтона (BD, США)). Несколько колоний стерильным тампоном или петлей переносили в пробирку с 1 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида. Взвесь бактериальных клеток доводили до мутности 0,5 по МакФарланду и наносили стерильным ватным тампоном на поверхность агара Мюллера-Хинтон. Через 5-10 мин после инокулирования на подсохшую поверхность агара накладывали диски согласно следующей схеме: в центр - пустой диск, на который наносили 10 мкл раствора клавуланата (10 мкг), по бокам от него на расстоянии 20 мм между центрами дисков - диски с цефтазидимом (30 мкг), цефотаксимом (30 мкг) и цефепимом (Юмкг). Чашки инкубировали в термостате при 35 С в течение 16-18 ч.
Фенотипический тест на наличие бета-лактамаз АтрС. Для детекции бета-лактамаз АтрС был использован трехмерный АтрС-тест, который являлся адаптацией методов, описанных ранее для детекции бета-лактамаз класса А и С (36,41). В этом тесте выращивали суточную культуру контрольного штамма Е. coli АТСС 25922 и исследуемого микроорганизма на плотной питательной среде - агар Мюллера-Хинтона (BD, США). Несколько колоний исследуемого микроорганизма стерильным тампоном или петлей переносили в пробирку с 1 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида. Взвесь бактериальных клеток доводили до мутности 0,5 по МакФарланду и добавляли 50 мкл в пробирки эппендорф, содержащие 1,5 мл бульона Мюллера-Хинтона (BD, США). Получившийся раствор инкубировали 4 часа при температуре 35 С. Выросшую бактериальную культуру в жидкой среде концентрировали центрифугированием в течение 1 минуты при 10000 оборотах в минуту. После удаления супернатанта клетки ресуспендировали в 200 мкл стерильной дистиллированной воды. Для получения грубого лизата исследуемого микроорганизма водный раствор клеток подвергался заморозке и оттаиванию 5 раз. Несколько колоний контрольного штамма Е. coli АТСС 25922 стерильным тампоном или петлей переносили в пробирку с 1 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида. Взвесь бактериальных клеток доводили до мутности 0,5 по МакФарланду и наносили стерильным ватным тампоном на поверхность агара Мюллера-Хинтон. Через 5-10 мин после инокулирования на подсохшую поверхность агара в центр накладывали диск, содержащий 30 мкг цефокситина. Грубый лизат клеток исследуемого микроорганизма вносили в щелевидное отверстие в агаре. За положительный результат принимали усиленный рост поверхностного микроорганизма (контрольного штамма Е. coli АТСС 25922) в области, где щелевидное отверстие перекрывает зону ингибирования.
Анализ профилей чувствительности клинических изолятов К. pneumonia
Проведение детального фенотипического анализа антибиотикочувствительности проблемных штаммов P. aeruginosa имеет большое практическое значение, так результаты, получаемые в практических лабораториях с применением диско-диффузионного метода (или автоматизированных коммерческих систем) не позволяют выявить тонкие различия. В тоже время на фоне широкого распространения резистентности, даже незначительные различия в уровне чувствительности могут иметь значения для выбора наиболее адекватного метода лечения. Результаты сравнения распределения МІЖ цефтазидима и цефепима в отношении P. aeruginosa из базы данных EUCAST и в отношении клинических штаммов, включенных в исследование, приведены на рисунках 13 А и Б соответственно. Сравнение активности этих антибиотиков в отношении P. aeruginosa представляет значительный интерес, так эти препараты составляют основу терапии соответствующих инфекций. По характеру распределения МІЖ «дикой» популяции в базе данных EUCAST можно сделать вывод о некотором сдвиге МПК цефтазидима в сторону больших значений в сравнении с цефепимом. При сравнении распределения МПК антибиотиков в отношении изученных штаммов также выявляются некоторые различия. Для цефтазидима характерен более широкий диапазон распределения, в отношении большего процента штаммов выявляются относительно невысокие значения. Различия в характере распределения МПК в отношении штаммов, включенных в исследования, могут быть связаны не только с различиями в уровне природной активности цефтазидима и цефепима, но с распространением различных механизмов резистентности. Известно, что некоторые эффлюксные помпы P. aeruginosa выводят цефепим с гораздо большей скоростью, чем цефтазидим. Следующим практически важным вопросом является сравнительная оценка активности в отношении P. aeruginosa карбапенемных антибиотиков (имипенема и меропенема). Данные о распределении МПК этих антибиотиков приведены на Рисунках 13 В и Г. Частота чувствительности P.aeruginosa к гентамицину, амикацину и ципрофлоксацину согласно критериям EUCAST составила 11,4%, 29,5%, и 4,5% соответственно. При использовании критериев CLSI ложночувствительными к гентамицину оказалось 3,2% штаммов, к амикацину и ципрофлоксацину - 12,0% и 5,2 % штаммов соответственно. Если результаты оценки чувствительности P.aeruginosa к цефепиму с использованием различных критериев оказались одинаковыми (34,1% чувствительных штаммов), то для цефтазидима были выявлены небольшие расхождения. Так, при использовании критериев CLSI ложночувствительными к цефтазидиму оказались 2,7% изученных штаммов. Интересно отметить, что, судя по характеру распределения МПК, цефоперазон/сульбактам существенно уступал по активности всем цефалоспоринам. К этой комбинации наблюдалась наибольшая устойчивость - 78,0% согласно критериям CLSI.
Штаммы P.aeruginosa проявляли высокий уровень резистентности к карбапенемам, причем меропенем уступал по активности имипенему (15 штаммов были чувствительны к имипенему, и лишь 9 штаммов были чувствительны к меропенему). Результаты интерпретации данных оценки чувствительности штаммов P.aeruginosa к имипенему при применении критериев CLSI и EUCAST полностью совпали, расхождения в оценке чувствительности к меропенему составили 2,8%. При использовании метода двойных дисков с ЭДТА среди 44 исследуемых штаммов синергизм между карбапенемами и ЭДТА был выявлен в 5 случаях (11,4%), что с высокой степенью вероятности свидетельствовало о продукции МБЛ этими микроорганизмами (Табл. 13).
