Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 16
1.1. Этиологическое значение Pseudomonas aeruginosa и разнообразие нозологических форм синегнойной инфекции 16
1.2. Микробиологическая характеристика P. aeruginosa 23
1.2.1. Общая характеристика микроорганизма 23
1.2.2. Продукция факторов патогенности и антибактериальных веществ 24
1.2.3. Подвижность и пленкообразующая способность 35
1.2.4. Pseudomonas aeruginosa в планктонной и пленочной смешанной культуре in vitro (антагонистическая активность) 39
1.2.5. Влияние экзопродуктов P. aeruginosa на функциональную активность нейтрофилов 41
1.2.6. Распространенность фенотипов резистентности 42
1.2.6.1. Молекулярная эпидемиология бактерий P. aeruginosa, продуцирующих карбапенемазы 44
1.3. Методы микробиологического анализа для идентификации, типирования и оценки патогенного потенциала Pseudomonas aeruginosa 47
1.3.1. Бактериологический метод 47
1.3.2. Молекулярные технологии, используемые для генотипической характеристики Pseudomonas aeruginosa 50
1.3.2.1. Идентификация и прямая детекция 50
1.3.2.2. Методы генетического типирования 53
1.3.3.1. Генотипы вирулентности и антибиотикоустойчивости 58
Экспериментальная часть
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 64
2.1. Анализ медицинской документации 64
2.2. Бактериальные штаммы 65
2.3. Среды и условия культивирования 66
2.4. Молекулярно-генетические исследования 67
2.4.1. Идентификация/детекция бактерий 68
2.4.2. Генетическая детерминация эффекторов TTSS 69
2.4.3. Определение детерминант антибиотикоустойчивости 70
2.4.4. Проведение секвенирующей реакции 72
2.4.5. Методы генетического типирования 72
2.5. Фенотипические методы определения факторов патогенности 73
2.5.1. Определение степени гидрофобное поверхности бактериальных клеток (ВАТН-тест) 73
2.5.2. Определение адгезивных свойств 73
2.5.3. Определение биопленкообразующей способности 74
2.5.4. Определение экзопродуктов 75
2.5.5. Определение гемолитической активности 76
2.6. Фенотипическая оценка антибиотикоустойчивости 77
2.7. Оценка интенсивности биолюминесценции 77
2.8. Экстракция АТФ из клеток в составе биопленок и определение концентрации внутриклеточного АТФ 78
2.9. Экспериментальные процедуры по изучению антагонистической активности P. aeruginosa и
оценке ее роли в межвидовых взаимоотношениях 78
2.9.1. Оценка антагонистической активности супернатантов P. aeruginosa 78
2.9.2. Определение токсичности супернатантов P. aeruginosa 78
2.9.3. Оценка влияния супернатантов P. aeruginosa на планктонные и биопленочные культуры Е. coli 79
2.9.4. Совместное культивирование P. aeruginosa и Е. coli 79
2.10. Оценка апоптоза/некроза нейтрофилов 80
2.11. Микроскопические методы оценки биопленок (атомно-силовая и лазерная сканирующая конфокальная микроскопия) 81
2.12. Статистические методы 81
ГЛАВА 3. Мониторинг pseudomonas aeruginosa в стационарах различного профиля взрослой и педиатрической медицинской сети 83
3.1. Инфицированность пациентов и частота встречаемости P. aeruginosa в спектре микробных
культур 83
3.2. Распространенность P. aeruginosa в стационарах хирургического профиля 86
3.2.1. Частота выделения P. aeruginosa от пациентов, госпитализированных в хирургические стационары различного профиля 86
3.2.2. Характеристика антибиотикоустойчивости изолятов P. aeruginosa 90
3.2.3. Микробные ассоциации с участием P. aeruginosa при гнойно-септических осложнениях у пациентов стационаров хирургического профиля 94
3.2.4. Роль P. aeruginosa в этиологии инфицированных ожоговых ран 96
3.3. Особенности циркуляции P. aeruginosa в акушерских стационарах 99
ГЛАВА 4. Молекулярные методы в идентификации/детекции, типировании и оценке клинической значимости нозокомиальных штаммов p. aeruginosa 105
4.1. Сравнительный анализ применения культурального и молекулярно-генетического методов
для определения видовой принадлежности P. aeruginosa 105
4.2. Применение ПЦР-анализа для контроля обсемененности объектов внешней среды 111
4.3. Генотипирование нозокомиальных культур P. aeruginosa 112
4.3.1. Сравнительная оценка диагностической значимости RAPD- и Rep-ПЦР при генотипировании клинических изолятов P. aeruginosa 112
4.3.2. Эпидемиологическая характеристика (основные геномоварианты) P. aeruginosae, циркулирующих в ЛПУ различного профиля 117
4.3.3. Генетическое разнообразие ЫаОхА-50-Ше как основа выявления родства изолятов P. aeruginosa 120
4.4. Молекулярные механизмы устойчивости нозокомиальных штаммов P. aeruginosa к бета-
лактамным антибиотикам 123
4.4.1. Распространенность оксациллиназ с БЛРС-фенотипом 123
4.4.2. Поиск и изучение генов, кодирующих металло-бета-лактамазы 125
4.5. Генетические профили цитотоксичности штаммов P. aeruginosa 131
4.6. Использование мультилокусной ПЦР-тест системы в оценке клинико-эпидемиологической значимости изолятов P. aeruginosa 133
ГЛАВА 5. Характеристика биологических свойств нозокомиальных штаммов p. aeruginosa 136
5.1. Разнообразие фенотипов клинических штаммов P. aeruginosa 136
5.2. Оценка пигментообразования штаммами P. aeruginosa 138
5.3. Комплексная оценка гемолитической активности P. aeruginosa 139
5.3.1. Внеклеточные факторы гемолитической активности 140
5.3.2. Клеточно-ассоциированный гемолиз 141
5.4. Особенности формирования биопленок нозокомиальными штаммами P. aeruginosa 146
5.4.1. Взаимосвязь гидрофобных свойств поверхности, адгезивной активности и биопленкообразующей способности клеток бактерий 146
5.4.2. Биопленкообразующая способность как маркер госпитальности клинических изолятов 155
5.5. Оценка потенциальной патогенности клинических штаммов P. aeruginosa биолюминесцентным методом 157
5.6. Модификация биологических свойств клинических штаммов P. aeruginosa при многократных пересевах и хранении на искусственных питательных средах 164
ГЛАВА 6. Характеристика симбиотических/антагонистических взаимоотношений p. aeruginosa и клинически значимых упм в планктоне и биопленке (in vitro) 170
6.1. Изучение межвидовых взаимодействий нозокомиальных штаммов в биопленках 170
6.1.1. Влияние супернатантов УПМ на пленкообразующую способность P. aeruginosa 170
6.1.2. Формирование смешанных биопленок P. aeruginosa с представителями других таксонов УПМ 172
6.2. Влияние экзометаболитов P. aeruginosa на планктонные и пленочные культуры E. coli 173
6.3. Характер взаимоотношений P. aeruginosa и E. coli при совместном культивировании в планктоне и биопленке 179
6.4. Влияние супернатантов смешанной культуры P. aeruginosa и E. coli на апоптоз, некроз и окисислительную активность нейтрофилов in vitro 179
Заключение 193
Выводы 205
Практические рекомендации 207
Список условных сокращений 208
Список литературы 209
- Молекулярные технологии, используемые для генотипической характеристики Pseudomonas aeruginosa
- Экстракция АТФ из клеток в составе биопленок и определение концентрации внутриклеточного АТФ
- Частота выделения P. aeruginosa от пациентов, госпитализированных в хирургические стационары различного профиля
- Генетическое разнообразие ЫаОхА-50-Ше как основа выявления родства изолятов P. aeruginosa
Молекулярные технологии, используемые для генотипической характеристики Pseudomonas aeruginosa
Идентификацию бактерий с помощью молекулярно-генетических методов чаще всего осуществляют с помощью технологии, основанной на процессе искусственного многократного копирования ДНК, известной как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для выявления P. aeruginosa предложены специфические праймеры детекции algD-геиа, кодирующего гуанозиндифосфат-О-манноза-дегидрогеназу (ГДФМ-дегидрогеназа), участвующую в продукции альгината у этого вида бактерий, toxA-гепа, кодирующего экзотоксин А, gyrB-теяа, ecJX-геиа и генов oprl и oprL (Khan А.А., Cerniglia С.Е., 1994; De Vos D. et al, 1997; Da Silva Filho L.V. et al, 1999; Lavenir R. et al, 2007; Motoshima M. et al, 2007). Экзотоксин А нарушает биосинтез белка и других метаболических процессов эукариот, инактивируя фактор элонгации II, наподобие дифтерийного токсина и является основным фактором патогенности P. aeruginosa (Armstrong S. et al, 2002). Khan A.A. и Cerniglia C.E. (1994) сообщили, что из 130 изолятов P. aeruginosa 125 содержали toxA-геи (чувствительность -96%), тогда как другие виды бактерий не приводили к положительным результатам (специфичность - 100%). Позднее, Nikbin V.S. и др. (2012) показали, что чувствительность данной тест-системы была на уровне 90,7%, и авторы объясняют это тем, что не все изоляты P. aeruginosa естественно несут этот ген.
Продукция альгината играет центральную роль в патогенезе хронической легочной инфекции при муковисцидозе. Его синтез регулируется несколькими генами, но algD ген, кодирующий ГДФМ-дегидрогеназу, является первым ферментом в альгинатном биосинтетическом пути (Govan J.R.W., Deretic Y., 1996). Da Silva Filho L.V. и соавт. (1999) предложили, и протестировали праймеры к algD-геиу на 182 изолятах P. aeruginosa и 20 штаммах близкородственных видов, и показали их 100% специфичность и чувствительность. Тест также оправдал себя при непосредственной детекции возбудителя в клинических образцах.
Использование праймеров к гену gyrB при идентификации 224 клинических штаммов P. aeruginosa показало 98,1% чувствительность и 100% специфичность данной технологии (Motoshima М. et al, 2007). Ген кодирует GyrB - одну из субъединиц гетеротетрамера ДНК-гиразы (топоизомеразы II типа) - фермента, являющегося мишенью для большинства фторхинолонов. Именно этот ген используется для идентификации синегнойной палочки в российских тест-системах, например компании «Синтол» (www.syntol.ru/productleg.htm ).
Ген ecfX кодирует один из 19 описанных альтернативных сигма-факторов внецитоплазматической группы (экстрацитоплазматическая функция, ECF), который у P. aeruginosa может играть роль в утилизации железа и вирулентности (Potvin Е. et al., 2007). Анализ специфичности и чувствительности ес/Х-ПЦР выявил, что он работает со 100% специфичностью и высокой чувствительностью (97-99%) для детекции P. aeruginosa как в клиническом материале, включая сыворотку крови, так и в экологических образцах почвы и воды (Lavenir R. et al, 2007; Cattoir V. et al, 2010).
Предложена одновременная амплификация («multiplex-PCR») генов oprl и oprL, экспрессирующих синтез двух липопротеинов наружной мембраны, маркирующих флюоресцентную группу псевдомонад и P. aeruginosa соответственно (De Vos D. et al, 1997). Липопротеины I и L являются внешними мембранными белками, ответственными за видовую устойчивость псевдомонад к антибиотикам и антисептикам (Masuda N. et al, 1995). Поскольку эти белки были найдены только у данных микроорганизмов, они были предложены в качестве мишени для быстрой идентификации P. aeruginosa в клинических образцах. Позднее, наряду с высокой чувствительностью, отмечена низкая специфичность данной технологии. Так, Lavenir R. и соавт. (2007) подтвердили, что все изоляты P. aeruginosa содержали oprl и oprL гены, но выявили ложноположительные реакции с другими видами (чувствительность - 100%, специфичность - 80%). Причину низкой специфичности авторы видят в отсутствии полной расшифровки геномов бактерий, близкородственных с P. aeruginosa, у которых могут быть фрагменты подобных генов (Qin X. et al, 2003).
При использовании в качестве мишени fliC, кодирующего С-конец флагеллина, показана 100% чувствительность, но очень низкая специфичность (Lavenir R. et al, 2007), в том числе на изолятах P. aeruginosa, ассоциированных с язвенным кератитом (Winstanley С. et al, 2005).
Молекулярной мишенью могут служить нуклеотидные последовательности, кодирующие участки генов 16S-23S рРНК (Widmer F. et al, 1998; Baker G.C. et al, 2003; Spilker T. et al, 2004). Для выявления P. aeruginosa разработан ДНК-микрочип на основе последовательности 23S рДНК. Двести десять клинических образцов были рассмотрены, и 25 из 26 клинических образцов P. aeruginosa были успешно идентифицированы, а оставшиеся 184 образца, содержащие другие виды бактерий, были отрицательными: чувствительность 96,2% и специфичность 100% (Keum К.С. et al, 2006).
В ряде работ показано, что вышеназванные гены-мишени можно использовать для непосредственной детекции P. aeruginosa в образцах кожи (биопсий из раны) (De Vos D. et al, 1997), в том числе в количественной ПЦР в реальном времени при исследовании образцов крови (Jaffe R.I. et al, 2001).
На настоящий момент нет единого мнения и регламентирующих документов, определяющих обязательные ДНК-мишени, соответствующие праймеры и протоколы для идентификации P. aeruginosa. По данным Lavenir R. и соавт. (2007), которые оценили чувствительность и специфичность ряда предложенных последовательностей, сделан вывод, что гены gyrB, toxA и последовательность 16S-23S рРНК внутреннего транскрибируемого региона (ITS), но не 16S рРНК, oprl, oprL ufliC могут быть применены в качестве мишеней для верификации клинических P. aeruginosa. Наиболее стабильным считают ecJX-геи, при использовании которого в ПЦР показана самая высокая чувствительность и специфичность при исследовании штаммов сине гнойной палочки различного происхождения (Lavenir R. et al., 2007). Использование только единственного гена для молекулярной идентификации P. aeruginosa потенциально «страдает» от видового полиморфизма, который усложняет и биохимическую верификацию этого микроорганизма. Показана эффективность использования нескольких пар праймеров (гены ecfX, gyrB) для выявления синегнойной палочки (Anuj S.N. et al, 2009). В одном из последних исследований было проведено сравненение мультиплексной ПЦР {gyrB и ecfX гены) с технологией ПЦР детекции oprL-гепа (Le Gall F. et al, 2013) и выявлена более высокая чувствительность oprL ПЦР-РТ (порог - 10 против 730 КОЕ/мл), но лучшая специфичность gyrB/ecjX ПЦР-РТ (90% против 73%). Авторы предлагают протокол ПЦР, объединяющий эти две технологии, который позволит получить чувствительность с порогом 10 КОЕ/мл и 100%-ую специфичность. В Российской мультиплексной Realime тест-системе (в том числе для детекции А. Ъаитаппй, К. pneumoniae и Е. coli), разработанной на базе Центрального НИИ эпидемиологии Минздрава РФ (ИЛС), мишенью для P. aeruginosa также является oprL. 1.3.2.2. Методы генетического типирования
Молекулярно-генетический анализ широко используется для субвидового типирования и анализа генетического родства (клональности) выделенных штаммов микроорганизмов, что особенно ценно при проведении эпидемиологических исследований. По сравнению с традиционными фенотипическими методами (био-, фаго- и серотипирование) генотипирование отличается универсальностью, более глубоким уровнем дифференциации и высокой воспроизводимостью (Лопухов Л.В., Эйделыптейн М.В., 2000).
Молекулярные технологии, различающиеся по уровню и сложности исследования структуры ДНК, давно и широко используются для типирования клинических и природных штаммов P. aeruginosa. Основные методы включают: гель-электрофорез в пульсирующем поле (Pulsed-Field Gel Electrophoresis, PFGE, ПЭ) (Schwartz D.C., Cantor C.R., 1984), саузерн-блот типирование с использованием ген-специфических зондов (RFLP-Southern blotting, ПДРФ-саузерн-блотинг) (Southern Е.М., 1975), риботипирование - вариант саузерн-блот анализа, в котором в качестве зонда используются последовательности генов 16S и 23S рРНК (Stull T.L. et. al, 1988), мультилокусный анализ числа тандемных повторов (Multiple-Locus (Variable-number tandem repeat, VNTR) Analysis, MLVA-типирование) (Jeffreys A.J. et. al, 1985; Vergnaud G., Denoeud F., 2000), мультилокусное секвенирование-типирование (Multiple-Locus Sequence Typing, MLST-типирование) (Maiden M.C. et al, 1998), а также ряд ПЦР методов, основанных на амплификации повторяющихся последовательностей (RAPD-ПЦР, Rep-ПЦР, ВОХ-ПЦР). При RAPD-ПЦР (Random Amplified Polymorphic DNA) используются короткие произвольные праймеры, которые гибридизуются с ДНК-мишенью при низкой температуре отжига, для стандартизации процедуры чаще всего используют консенсусный праймер М13 (Welsh J., McClelland М., 1990; Williams J.G. et. al, 1990; Huey B., Hall J., 1989). Rep-ПЦР позволяет амплифицировать две основные группы элементов: повторяющиеся экстрагенные палиндромные элементы (Repetitive Extragenic Palindromic (REP) elements) и энтеробактериальные повторяющиеся внутригенные последовательности (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (ERIC) sequences), впервые описанные у представителей семейства Enterobacteriacea (Versalovic J. et al, 1991). Еще одной межгенной последовательностью являются В ОХ-элементы, не связанные ни с REP-, ни с ERIC-последовательностями, которые могут формировать структуры типа стебель-петля благодаря их двойной симметрии (Martin В. et al, 1992).
Пульс-электрофорез, как основа молекулярного изучения эпидемиологии микроорганизмов, является наиболее отличительным, и признан «золотым стандартом» для типирования большей части бактерий, включая P. aeruginosa (Bertrand X. et al, 2001; Silva F.M. et al, 2011; Wolska K., Szweda P., 2012). Однако этот метод ограничен технической сложностью и длительной по времени обработкой результатов (Olive D.M., Bean P., 1999).
Экстракция АТФ из клеток в составе биопленок и определение концентрации внутриклеточного АТФ
Биопленку, выращенную в полистироловом плоскодонном планшете, 2-х кратно отмывали охлажденным 0,89% физиологическим раствором и переносили планшет на лед. В лунки вносили 100 мкл DMSO, выдерживали 15 мин, отбирали по 50 мкл в пробирки «Эппендорф» и замораживали. Концентрацию АТФ определяли, используя стандартный набор реактивов ATP Bioluminescent Assay Kit (Sigma). Пробы разводили в 10 раз (180 мкл воды на 20 мкл образца). Смешивали 100 мкл образца с 100 мкл реагента, содержащего люциферин и люциферазу светляков (стандартная смесь, разбавленная в 25 раз). Измерение люминесценции проводили на микропланшетном ридере Infinite М200 (Тесап, Австрия). Для определения количества АТФ в образце строили калибровочный график, используя результаты люминесценции контрольных образцов, содержащих известную концентрацию АТФ.
. Экспериментальные процедуры по изучению антагонистической активности P. aeruginosa и оценке ее роли в межвидовых взаимоотношениях
Для исследования антагонистических свойств бактерий использовали метод отсроченного антагонизма согласно Muriana Р. и Klaenhammer Т. (1987) с модификацией (Бухарин О.В. и соавт., 2010). Антагонистическую активность штамма выражали как % прироста тест-культуры (Е. coli lux+) при её культивировании 3,5 и 5 ч с супернатантами P. aeruginosa, полученными стерильно.
Для оценки антагонистической активности при формировании биопленки к 100 мкл тест-культуры УПМ (с концентрацией микробных клеток 6х106 КОЕ/мл) добавляли 100 мкл стерильной культуральной жидкости (цельные экзометаболиты). Контролем служили лунки с монокультурой УПМ, в которые добавляли 100 мкл LB-бульона. Оценивали биомассу биопленки УПМ через 24 ч инкубации. Действие супернатантов P. aeruginosa на сформированную биопленку УПМ оценивали после 24-часового роста в 96-луночной полистироловом планшете, 3-х-кратной промывки и последующей экспозиции с ночными цельными супернатантами в течение 2 ч. В контрольные лунки добавляли LB-бульон. Биомассу биопленки определяли вышеописанным способом.
Рекомбинантный биолюминесцентный штамм Е. coli lux+ (полный lux-регулон Vibrio fischeri) использовали в лиофилизированном виде. Регидратацию проводили охлажденной Н20 (1 мл на ампулу) 30 мин при 4С. Затем взвесь сенсора разводили 0,9% NaCl до рабочего объема и выдерживали 30 мин при 20С. Штаммы P. aeruginosa с исходным числом клеток 6x108 КОЕ/мл (2,0 по стандарту McFarland) засевали в соотношении 1:4 в LB-бульон и статически выращивали 18 ч при 37С. Супернатанты получали путем центрифугирования 1-2 мл ночной культуры P. aeruginosa при 13000 об/мин в течение 10 мин на микроцентрифуге «Эппендорф» (Германия). Надосадочную жидкость использовали в анализе немедленно или после замораживания при -18С в течение 1 ч. По 50 мкл супернатантов добавляли к 50 мкл сенсора, предварительно разлитого в лунки белого 96-луночного плоскодонного полистиролового планшета. Смесь выдерживали 60 мин при 20С. Измерения интенсивности биолюминесценции проводили через 15, 30, 45, 60 мин. В ряде экспериментов использовали разведения экзометаболитов в 0,9% NaCl.
Для изучения влияния супернатантов P. aeruginosa на рост и пленкообразование Е. coli к 100 мкл тест-культуры (с концентрацией микробных клеток 6х108 КОЕ/мл) добавляли 100 мкл стерильной культуральной жидкости (цельные экзометаболиты). Контролем служили лунки с монокультурой Е. coli, в которые добавляли 100 мкл LB-бульона. Оптическую плотность культуры (ОПбоо) измеряли с интервалом в 60 мин. Численность клеток в планктоне определяли через 6, 12 и 24 ч культивирования путем подсчета КОЕ после высева культуры из лунок на среду Мак-Конки с ампициллином 50 мкг/мл. Скорость экспоненциального роста (ц, h"1) вычисляли по формуле (lnxt-lnx0)/(t0), где х0 - начальная плотность бактерий, xt - конечная плотность бактерий в моменты времени t0 и t. Длительность лаг-фазы (Ті) по формуле tr-(lnxr-lnx0)/u, где хг - плотность культуры на момент времени tr. Интенсивность биолюминесценции в планктонной и биопленочной культуре, биомассу биопленки Е. coli оценивали через 6, 12 и 24 ч инкубации.
Действие супернатантов P. aeruginosa на сформированную биопленку Е. coli оценивали после 24-часового роста в 96-луночной полистироловом планшете, 3-х-кратной промывки и последующей экспозиции с ночными цельными супернатантами в течение 1-3 ч. В контрольные лунки добавляли LB-бульон. Биомассу биопленки определяли вышеописанным способом.
aКультивирование проводили статически в 96-луночных полистироловых плоскодонных планшетах при 37С в течение 6, 12 и 24 ч. Монокультуру исследуемого штамма засевали в количестве 100 мкл (106 КОЕ/мл) и 100 мкл LB. Смешанная культура представляла смесь из 100 мкл P. aeruginosa (106 КОЕ/мл) и 100 мкл Е. coli (106 КОЕ/мл). Бактериальный рост планктона был измерен при ОПбоо.
Подсчет КОЕ в планктоне в моно- и смешанных вариантах проводили через 6, 12 и 24 ч культвирования: для P. eruginosa на ацетамидном агаре, для Е. coli на агаре Мак-Конки с добавлением 50 мкг/мл ампициллина после 10-кратных серийных разведений. Для определения КОЕ в биопленке последнюю дважды отмывали от клеток планктона 0,9% NaCl. После внесения в каждую лунку 100 мкл свежего 0,9% NaCl биомассу биопленки тщательно соскабливали в течение 30 сек с помощью стерильного скальпеля (Bandara H.M.H.N. et al, 2010). Затем содержимое трех лунок для каждого варианта собирали в пробирки «Эппендорф», встряхивали в течение 15 мин, готовили 10-кратные серийные разведения и инокулировали по 20 мкл на селективные среды. Подсчет КОЕ проводили через 24 ч инкубации в условиях термостата, для Е. coli проводили контроль светящихся вариантов.
Общую и удельную продукцию пиоцианина и пиовердина для P. aeruginosa, биолюминесценцию для Е. coli определяли в супернатантах, полученных путем фильтрования, в моно- и смешанных вариантах после 6, 12 и 24 ч инкубации. Биопленкообразование оценивали в те же сроки. Наряду с определением биомассы биопленки определяли концентрацию внутриклеточного АТФ и фиксировали интенсивность биолюминесценции (в вариантах с Е. coli).
Частота выделения P. aeruginosa от пациентов, госпитализированных в хирургические стационары различного профиля
Если в целом (включая общесоматические отделения) доля синегнойной палочки в спектре нозокомиальных микробных культур, не превышала 2%, то по данным 2010-12 гг., в хирургических стационарах взрослой сети (6 ЛПУ, 20 отделений) бактерии P. aeruginosa были выделены в 10,5% случаев гнойно-септических осложнений (Таблица 6).
В «неОРИТ» группе доля синегнойной палочки в спектре всех возбудителей составила 6,7% (Таблица 8). P. aeruginosa выделяли в большем проценте случаев в отделениях экстренной и торакальной хирургии, в меньшем - в эндоскопическом и нейрохирургических отделениях (Рисунок 6-А). Оценивая роль изучаемых микроорганизмов в отделениях реанимации, следует отметить, что их доля в ОРИТ существенно выше - 18,1%. Большая значимость синегнойной палочки в реанимационных - 25,3 против 11,5% - в общехирургических отделениях при представлении результатов с учетом количества больных показана в работе Ермолова А.С. и соавт. (2009). Удельный вес P. aeruginosa различался в ОРИТ разных стационаров, а также принимающих больных специализированных отделений в пределах одного стационара (Рисунок 6-Б, 7-А). Разброс данных составил от 11,1% в ГКБ №1 до 26,7% в ПКБ №3 «Центр диализа».
При сравнении доли штаммов P. aeruginosa в спектре культур, изолированных от пациентов, переведенных в ОРИТ из различных терапевтических и хирургических отделений, значимых различий не выявлено (Рисунок 7-А, Б). Это дало основание предположить, что существенной роли первичное место госпитализации не играет, а инфицирование пациентов и затем распространение штаммов, скорее всего госпитальных, обусловлено их пребыванием в ОРИТ ЛПУ.
Роль и место ОРИТ в распространении нозокомиальной синегнойной инфекции. Для выявления эпидемиологических связей, оценки роли и места ОРИТ в распространении нозокомиальной синегнойной инфекции в многопрофильном хирургическом стационаре был проведен ретроспективный анализ историй болезни 58 пациентов, находившихся на лечении в многопрофильном хирургическом стационаре в период январь-май 2009 г., инфицированных P. aeruginosa.
Установлено, что на определенном этапе стационарного лечения 38 (65,5%) человек из 58 госпитализированных и инфицированных P. aeruginosa являлись пациентами ОРИТ. В 6 случаях P. aeruginosa была выделена от больных до пребывания в ОРИТ, в 16 - после перевода в профилированное отделение, от остальных 16 человек - во время их лечения в ОРИТ. Период пребывания в ОРИТ составлял от 1 до 4 дней, а время от перевода в хирургические отделения из ОРИТ до выделения возбудителя варьировало от 1 до 12 дней. По-видимому, изоляты из других отделений могут иметь «реанимационное» происхождение. Принимая во внимание, что доля пациентов, проходящих через ОРИТ, во всех отделениях достаточно высока (Таблица 7), можно полагать, что колонизация/инфицирование пациентов внутрибольничными штаммами происходит именно в ОРИТ, с последующим распространением по отделениям.
P. aeruginosa и неферментирующие грамотрицательные бактерии. В последнее время высказывается мнение, что роль синегнойной палочки как возбудителя внутрибольничных ГСИ снижается, а других видов, относящихся к группе неферментирующих грамотрицательных бактерий, увеличивается. Сравнительный анализ удельного веса НГОБ в микробном спектре культур, изолированных в хирургических стационарах, выявил следующее. Доля НГОБ составила 20,28+0,03% от всех микроорганизмов в целом в хирургии и более 30% в ОРИТ, при этом в «неОРИТ» группе этот показатель был меньше в 2,6 раза (Таблица 8).P. aeruginosa сохраняет лидирующие позиции в обеих группах: ее удельный вес -18,11+0,84 и 6,69+0,38% соответственно. Сравнение двух групп («неОРИТ» и ОРИТ) выявило статистически значимые различая в уровне встречаемости и НГОБ, и P. aeruginosa ( р=0,241; р=0,0000 и =0,176; p=0,0000 соответственно). Вторым по значимости микроорганизмом был Acinetobacter baumannii. Несмотря на то, что отмечено расширение видового представительства группы НГОБ, в качестве этиопатогенов госпитальных инфекций в хирургии их роль была незначительна: совокупная доля не превышала 2% (кроме P. aeruginosa и A. baumannii). Всего идентифицировано 17 видов (8 родов), в том числе редко встречаемые/описываемые в клинике виды.
Генетическое разнообразие ЫаОхА-50-Ше как основа выявления родства изолятов P. aeruginosa
Сравнение нуклеотидных последовательностей ЫаОхА-50 выявило, что штаммы P. aeruginosa, выделенные в разных ЛПУ, имели сходные гены, например b/aoxA-50g-iike (GenBank AMI 17127.1), и, наоборот, в одном ЛПУ могли циркулировать изоляты с различными оксациллиназами (Таблица 21). Следует отметить, что штаммы, отнесенные к одной геномогруппе по результатам генотипирования в RAPD-ПЦР, содержали ЫаохА-5о последовательности с идентичными нуклеотидными заменами. По-видимому, обнаружение идентичных оксациллиназ может служить дополнительным критерием их родства. Такая возможность основана на двух известных фактах: продукция данных ферментов может считаться видовым признаком P. aeruginosa, но существует большое число различных ОХА-50икебета-лактамаз (Girlich D. et al, 2004).
Проверку данной гипотезы осуществили при расследовании вспышки синегнойной инфекции среди новорожденных в г. Перми. В период с января по июнь 2008 г. среди новорожденных, находившихся в ОРИТ крупного акушерского стационара г. Перми, возникла вспышка синегнойной инфекции с количеством пострадавших 37 человек. При этом, если в январе-марте носительство не сопровождалось какими-либо клиническими проявлениями, то с апреля по июнь из числа инфицированных у 8 (21,6+6,8%) детей были выявлены клинические признаки пневмонии. Фактором риска распространения синегнойной инфекции явилась процедура ИВЛ. Сравнение антибиотикограмм культур P. aeruginosa, выделенных от новорожденных в этот период, выявило, что 80,7% штаммов имели сходные фенотипические характеристики. Поводом для углубленного динамического исследования культур P. aeruginosa послужило широкое распространение носительства синегнойной палочки среди новорожденных, переведенных из акушерского отделения в ОРИТ того же ЛПУ, где проходили роды, а в последующем госпитализированных в неонатальные отделения других детских больниц (второй этап выхаживания новорожденных). Более того, штаммы P. aeruginosa с близким антибиотикофенотипом стали изолировать от детей, поступающих в детские больницы из других акушерских стационаров.
Предварительно методом RAPD-ПЦР было проведено генотипирование «вспышечных» штаммов P. aeruginosa (п=125). В результате обнаружено, что подавляющее большинство (п=111) из них отнесено к 3 геномовариантам и оценены как близкородственные (Рисунок 26-А). Данные культуры, скорее всего, являлись результатом персистирования «модального» штамма в отделениях акушерского стационара и двух детских больницах. Несколько штаммов имели другие отличающиеся генетические профили.
Для подтверждения гипотезы о возможности использования сравнительного анализа нуклеотидной последовательности ЫаохА-зо для выявления родства изолятов P. aeruginosa дополнительно выполнена его специфическая амплификация и секвенирование. Сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей показало, что большая часть штаммов P. aeruginosa, циркулирующих в момент вспышки в акушерском стационаре и детских больницах, имеют последовательности на 100% идентичные гену Ыарохв (WaoxA-50-uke) P. aeruginosa MF 6 (GenBank AY597439.1, ААТ09630.1) (Рисунок 26-Б). Геномы 2-х изолятов содержали последовательность ЫаОхА-501-ШеР. aeruginosa KSM РАЕ0922 (GenBank HQ833036.1, AEK06328.1) и одного - ЫаОхА-50-Ше P. aeruginosa Р23 (GenBank GQ141728.1, ACS45294.1). Такое единообразие, учитывая вариабельность ОХА-50-подобных генов, позволило выявить формирование эпидемически значимого клона в замкнутом контуре: акушерский стационар -неонатальные отделения детской клиники.
Исследовано 178 штаммов P. aeruginosa, выделенных в 2008-09 гг. от больных крупных хирургических, детского и акушерского стационаров г. Перми. Специфическая амплификация с праймерами ABD1/ABD4 к ферменту ОХА-10 и его производным была выявлена у 26 изолятов, выделенных преимущественно в трех ЛПУ взрослой сети: ГКБ№4, ККБ и ЛКБ (Рисунок 27), и только в двух случаях в детских ЛПУ. Нужно отметить, что большая часть детектированных фрагментов соответствовала размеру предполагаемого участка гена Ь/ЙОХАЮ - 775 п.н.
Электрофореграмма продуктов амплификации, полученных с праймерами ABD1/ABD4: 1, 15 - маркеры молекулярных масс; 2-14; 16-31 - клинические изоляты.
У семи изолятов из разных ЛПУ (ГКБ 4 - 1-6, 1-12, 1-18; ККБ - 203; ЛКБ - 2пл, №7, №9) определены нуклеотидные последовательности ампликонов, полученных с праймерами ABD1/ABD4, и выявлено, что все они являются оксациллиназами OXA-14-like, которая характеризуется БЛРС-фенотипом (Таблица 22). Фермент отличается от ОХА-10 аминокислотной заменой Glyl57Asp (443-445 п.н., GGC на GAC). Таким образом, у некоторых исследованных штаммов, фенотипически устойчивых к одному или ряду БЛА, эта устойчивость была связана, в том числе, и с продукцией оксациллиназ (нельзя исключить другие механизмы и возможную продукцию бета-лактамаз иных классов).
