Введение к работе
Актуальность проблемы.
На современном этапе для успешного выполнения приоритетных национальных проектов и правительственных программ в сфере здравоохранения, которые традиционно ориентированы на предупреждение распространения и ликвидацию актуальных и социально-значимых инфекционных заболеваний, важное значение приобретает совершенствование методов их лабораторной диагностики.
Актуальной задачей является разработка и внедрение в практическую
медицину и систему эпиднадзора технологий, отвечающих следующим
требованиям: высокая чувствительность, прецизионная специфичность,
информативность, объективность, экспрессность, высокая
производительность, универсальность (выявление различных возбудителей в любом типе клинического материала), биобезопасность для исполнителей, возможность автоматизации процесса. Полимеразная цепная реакция (ПЦР), основанная на выявлении уникальных фрагментов геномов инфекционных агентов, соответствует данным требованиям, существенно расширяет возможности диагностики, позволяет обнаруживать некультивируемые и труднокультивируемые формы микроорганизмов (Говорун В.М.,2000; Шагинян И.А.,2000;Ребриков Д.В., 2009; Mullis К.В., 1994; Newton C.R.,1997; Farrell D.J., 2001). Универсальность метода ДНК-диагностики и автоматизация практически всех этапов анализа позволяют осуществлять одновременное выявление нескольких инфекционных агентов, способных вызывать определенный тип патологии, проводить скрининговые обследования различных контингентов населения в профилактических целях.
Несмотря на обилие публикаций, посвященных методу ГЩР и его использованию в диагностике отдельных нозологических форм, работы содержащие материалы комплексных ПЦР исследований инфекционных заболеваний, обусловленных широким спектром возбудителей, достаточно редки. Данные о частоте выявления возбудителей зачастую противоречивы, а проблемы ПЦР обследования обширных контингентов одновременно на несколько различных инфекционных агентов и определения роли и места молекулярно-биологических методов в общей системе лабораторной диагностики инфекционных заболеваний освещены недостаточно.
Широко распространенные социально значимые инфекционные заболевания, такие как острые кишечные и негонококковые урогенитальные инфекции, хеликобактериозы и вирусные гепатиты приносят значительный вред здоровью жителей России и экономический ущерб (Кишкун А.А., 2002; Козлова В.И., 2003; Шахгильдян И.В., 2003; Подколзин А.Т., 2004,). Кроме этого, хеликобактериозы и гепатиты существенно снижают продолжительность жизни, а негонококковые урогенитальные инфекции отрицательно влияют на репродуктивную функцию. Активизация и оптимизация внедрения современных технологий в диагностику этих инфекций способствует своевременному назначению этиотропной терапии, уменьшению продолжительности лечения и количества осложнений.
В связи с вышеизложенным, особую актуальность приобретают вопросы выбора наиболее значимых направлений и объектов исследования, создания и подбора тест-систем для ПЦР-диагностики, их апробации и адаптации к медицинской практике, разработки оптимальных алгоритмов применения как отдельных диагностикумов, так и сочетаний нескольких тест-систем для улучшения технологичности, повышения эффективности и уменьшения стоимости исследований.
Цель работы - оптимизировать и адаптировать собственные (экспериментальные) и коммерческие ПЦР тест-системы к решению задач диагностики острых кишечных инфекций, хеликобактерной инфекции, негонококковых урогенитальных инфекций, вирусных гепатитов; разработать стратегию и тактику использования метода ПЦР для наиболее рационального и эффективного выявления возбудителей этих заболеваний. Задачи исследования:
1. Провести оптимизацию методов ПЦР-диагностики для выявления
актуальных патогенов - возбудителей ОКИ, хеликобактерной инфекции,
вирусных гепатитов В и С, НУГИ.
2. Разработать алгоритмы диагностики ОКИ, хеликобактерной инфекции,
вирусных гепатитов В к С, НУГИ с использованием оптимизированных
нами методов на основе отечественных ПЦР тест-систем.
-
Апробировать и адаптировать к практической диагностике систему молекулярно-биологических методов выявления актуальных бактериальных возбудителей ОКИ - бактерий родов Shigella, Salmonella, Yersinia, Campylobacter и генов, ответственных за патогенность энтеробактерий.
-
Оценить возможности метода ПЦР при изучении распространения бактерий Н. pylori у больных разных возрастных групп с различными типами гастродуоденальной патологии, а также при внутривидовом титровании и выявлении генов факторов патогенности Нpylori.
-
Разработать экономичный вариант метода ПЦР для оценки вирусной нагрузки у больных вирусными гепатитами В и С, изучить особенности репликации вирусов гепатитов В, С, D, G при моно- и смешанном инфицировании, определить эффективность и значимость вертикального пути передачи вирусов гепатитов 5 и С в Нижегородском регионе.
-
С помощью комплексного ПЦР исследования получить новые знания о распространении и особенностях циркуляции наиболее значимых возбудителей НУГИ (U. urealyticum, М. hominis, С trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex Щ у взрослых и детей, и о возможной связи отдельных представителей НУГИ с формированием различных форм патологии.
-
На основе полученных новых знаний определить роль и место молекулярно-биологических методов в лабораторной диагностике НУГИ, ОКИ, хеликобактерной инфекции, парентеральных вирусных гепатитов, провести апробацию разработанных алгоритмов их диагностики в практической медицине.
Научная новизна работы.
Впервые в Нижегородском регионе проведено освоение и внедрение в практическое здравоохранение и систему зпиднадзора метода ПЦР. На основе многолетних системных исследований группы возбудителей актуальных инфекционных заболеваний (ОКИ, хеликобактерная инфекция, НУГИ, вирусные гепатиты) получены новые данные о распространенности и особенностях циркуляции инфекционных агентов среди населения.
Разработаны оптимальные алгоритмы применения амплификационных методов для решения задач диагностики ОКИ, хеликобактерной инфекции, вирусных гепатитов, НУГИ. Определены роль и место данных технологий в общей системе диагностических исследований для наиболее рациональной и эффективной реализации последних.
Впервые разработаны экспериментальные лабораторные тест-системы для выявления бактерий рода Shigella, и генов токсинов энтеробактерий (термолабильного - LT; термостабильного - ST; шигатоксина первого типа -VTJ).
Впервые установлено, что использование ПЦР при первичном обследовании больных с подозрением на ОКИ позволяет более чем в 2 раза увеличить эффективность выявления бактерий родов Shigella и Salmonella по сравнению с классическим микробиологическим исследованием.
Впервые в РФ проведен многолетний мониторинг (18 лет) клинических изолятов энтеробактерий. Установлены особенности циркуляции в Нижнем Новгороде штаммов энтеробактерий, содержащих гены факторов патогенности. Наиболее распространены варианты, имеющие оперон инвазивности (Shigella ssp., E.coli). Показано, что циркуляция токсигенных штаммов энтеробактерий не характерна для Нижегородского региона. Выявлены единичные случаи обнаружения гена шигаподобного токсина первого типа у представителей Shigella ssp., Е. coli. Впервые выявлен факт наличия у Е. coli 0127 генетических структур, сходных по нуклеотидной последовательности с геном адгезии холерного вибриона.
Показана широкая распространенность Н. pylori среди больных разных возрастов с различными типами гастродуоденальной патологии в Нижнем Новгороде (частота выявления 58,9±2,9% у детей и 82,9±1,8% у взрослых). Выявлена циркуляция токсигенных вариантов Н. pylori в бактериальной популяции. Варианты cagA + составили 76,4±3,8%, а варианты vakA + -66,0±6,7% в популяции соответственно.
Определена активность репликации вирусов у больных хроническими гепатитами В и С разных возрастов при моноинфицировании, частота выявления вирусных нуклеиновых кислот составляла 48±2,4 - 50±1,9%. Установлено, что эффективность репликации вирусов гепатитов В, С, D, G снижается при смешанном инфицировании (вирусные нуклеиновые кислоты выявлялись суммарно в 25,5±1,4 - 37,4±2,4% случаев в зависимости от состава ассоциации).
Определена вероятность вертикальной передачи вирусов гепатитов В и С в Нижнем Новгороде - 12,8±2,8% и 10,2±0,86% соответственно.
Впервые изучена циркуляция наиболее распространенных в Европе генотипов вируса гепатита С (la, lb, 2, За) на территории г. Нижнего Новгорода и Нижегородской области. Показано доминирование генотипов lb и За, частота их выявления несколько варьировала по годам от 48,4±3,6 до 54,3±3,4% и от 46,1±4,2 до 51,6±3,6% соответственно.
Исследованы особенности распространенности наиболее значимых возбудителей НУГИ - U. urealyticum, М. hominis, С trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II. Они обнаружены у 68,0±1,3% женщин и 40,0±3,8% мужчин. Показано многолетнее стабильное сохранение распределения возбудителей по частоте выявления. В течение всего периода наблюдения чаще других обнаруживались U. urealyticum (54,2±1,4% у женщин, 29,7±3,6% у мужчин) и М. hominis (25,8±1,3% У женщин, 14,5±2,7% у мужчин). Остальные виды инфекционных агентов определялись существенно реже.
На основе анализа частоты выявления возбудителей НУГИ в разных возрастных группах установлены этапы колонизации макроорганизма уреаплазмами, микоплазмами и вирусами группы гепеса. Показана связь возбудителей НУГИ с нарушениями репродуктивной функции и воспалительными процессами в различных отделах урогенитального тракта.
На клонированные фрагменты генов термолабильного токсина (LT) фактора адгезии (CFA1), которые впервые использованы в качестве ДНК зондов для выявления соответствующих генов и конструирования лабораторных вариантов ПЦР диагностикумов получены патенты Российской Федерации № 2031948; № 2049822 соответственно. Патент получен и на алгоритм использования метода ПЦР для выявления возбудителей НУГИ у детей первых лет жизни - №2271003.
Теоретическое значение работы.
Работа является одной из первых в Российской Федерации, в которой рассматриваются проблемы комплексного подхода к ПЦР диагностике инфекционных заболеваний, обусловленных широким спектром возбудителей.
Предложена система адаптации отечественных ПЦР тест-систем к решению задач практической медицины и эпиднадзора, а также разработки алгоритмов рационального использования метода ПЦР в диагностике актуальных инфекционных заболеваний.
Полученные новые данные о распространенности
труднокультивируемых форм возбудителей расширяют представления об эпидемиологических особенностях ОКИ, хеликобактерной инфекции, НУГИ и вирусных гепатитах.
Предложенные алгоритмы диагностики НУГИ, ОКИ, парентеральных вирусных гепатитов, хеликобактерной инфекции с применением метода ПЦР могут быть использованы в дальнейшем при разработке новых диагностических стандартов. Перечни ведущих инфекционных агентов, предложенные для одновременного выявления при комплексной ПЦР-диагностике НУГИ и ОКИ могут служить основой комплектации
мультиплексных ПЦР-тест-систем с детекцией продуктов амплификации методом биочипов.
Практическое значение работы.
Разработанные ДНК-зонды и созданные на их основе лабораторные варианты ПЦР систем впервые в Российской Федерации позволили проводить скрининг штаммов энтеробактерий на наличие генов факторов патогенности (термолабильного - LT; термостабильного - ST; шигатоксина первого типа - VT1) и детекцию бактерий рода Shigella и энтероинвазивных Escherichia в клиническом материале.
На основе авторских тест-систем, а также адаптации и модификации имеющихся отечественных ПЦР-диагностикумов, отработки схем их индивидуального и комплексного применения предложены алгоритмы использования метода ПЦР в диагностике бактериальных ОКИ, хеликобактерной инфекции, НУГИ и вирусных гепатитов.
Внедрение в практику разработанных алгоритмов позволили усовершенствовать этиологическую диагностику и систему эпиднадзора и мониторинга за возбудителями актуальных социально-значимых инфекционных заболеваний.
Оптимизация использования тест-систем, проведение одномоментного выявления наиболее распространенных и этиологически значимых инфекционных агентов, исследование пула потенциально инфицированных субстратов позволили в 1,5-2,5 раза повысить эффективность выявления возбудителей, уменьшить продолжительность и на 30-50% снизить стоимость исследований.
Предложенные нами принципы применения ПЦР в диагностике бактериальных ОКИ, хеликобактерной инфекции, НУГИ и вирусных гепатитов используются диагностическими лабораториями медицинских учреждений Н.Новгорода.
Внедрение в практику.
Получены патенты Российской Федерации: -№ 2031948 «Фрагмент ДНК LTf, предназначенный для выявления гена термолабильного энтеротоксина энтеробактерий» (27.03.1995 г.); -№2049822 «Фрагмент ДНК CFv, используемый для выявления энтеробактерий, обладающих фактором колонизации CFA I» (10.12.1995 г.); -№2271003 «Способ выявления наиболее значимых возбудителей негонококковых урогеннитальных инфекций (Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Cytomegalovirus, Herpes symplex VII) у детей с использованием метода ПЦР» (27.02.2006 г.).
Разработана медицинская технология: ^«Комплексное ПЦР-обследование пациентов с инфекционно-аллергическими заболеваниями органов дыхания», 2008 г. Разрешение № 209/084 от 21.04.09 Минсоцздрава РФ.
Материалы работы послужили основой для следующих документов: -пособие для врачей «Полимеразная цепная реакция для выявления пилорического хеликобактера», 2000 г. утверждено председателем секции по
эпидемиологии, инфекционным болезням и вирусологии МЗ РФ академиком
РАМН Покровским В.И., протокол №5 от 28.11.2000 г;
-методические рекомендации «Метод ПЦР-диагностики в обследовании
новорожденных и детей первого года жизни», 2000 г. утверждены Главным
государственным санитарным врачом Нижегородской области Петровым
Е.Ю.;
-пособие для врачей «Принципы отбора, хранения и транспортировки
биологических субстратов для проведения ПЦР-диагностики бактериальных
и вирусных инфекций», 2002 г. утверждено председателем секции по
эпидемиологии, инфекционным болезням и вирусологии МЗ РФ академиком
РАМН Покровским В.И., протокол №4 от 25.12.2001 г.;
-пособие для врачей «Комплексное ПЦР-обследование на наличие
возбудителей негонококковых урогенитальных инфекций женщин с
гинекологической патологией и отягощенным акушерско-гинеколгическим
анамнезом», 2005 г., утверждено Председателем секции по эпидемиологии,
инфекционным болезням и вирусологии МЗ РФ академиком РАМН
Покровским В.И., протокол №5 от 02.12.2005 г.
И были использованы при составлении: -книги для практического врача «Диагностика и биокоррекция нарушений антиинфекционного гомеостаза в системе «мать-дитя», г. Нижний Новгород, 2004 г.;
-аналитического обзора «Молекулярно-биологические методы в микробиологической диагностике», 1998 г.; -аналитического обзора «Современные методы диагностики ИППП», 2007 г.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Для успешного внедрения и использования метода ПЦР в диагностике
бактериальных и вирусных инфекционных заболеваний необходимо
проведение стадий адаптации, оптимизации диагностикумов, определение
наиболее важных и существенных аспектов, требующих привлечения ПЦР.
2. ПЦР может успешно использоваться для первичной скрининговой
детекции бактериальных возбудителей ОКИ в лабораторной диагностике и
санитарно-эпидемиологическом надзоре. Эффективность этиологической
диагностики возрастает при одновременном выявлении ведущих
инфекционных агентов: бактерий родов Shigella, Salmonella, Campylobacter и
Y. enlerocolitica.
-
Использование отечественных ПЦР тест-систем позволяет проводить не только первичную индикацию Н .pylori, осуществлять оценку количества инфекционного агента и контролировать эффективность антихеликобактерной терапии, но и получить ряд существенных характеристик микроорганизма, таких как наличие генов факторов патогенности cagA и vakA, устойчивости к антибиотикам - макролидам без культивирования микроорганизма.
-
Наиболее значимыми направлениями использования ПЦР в решении проблемы парентеральных вирусных гепатитов является определение результативности противовирусной терапии, интенсивности репликации
вирусов при моно- и смешанном инфицировании, совершенствование профилактики вертикального пути передачи вирусов. Для этого успешно может быть использован разработанный нами экономичный полуколичественный вариант ПЦР.
5. ПЦР является основным методом детекции возбудителей НУГИ, позволяющим эффективно выявлять любой из микроорганизмов этой группы (вирусы, бактерии). Наиболее эффективно и экономически оправдано одновременное выявление у пациента пяти наиболее значимых и распространенных возбудителей: U. urealyticum, М. hominis, С trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/H в пуле субстратов (смеси соскобов слизистых уретры, вагины, цервикального канала у женщин; смеси соскоба слизистой уретры и осадка мочи у мужчин; смеси слюны, мочи, слезного отделяемого у детей), в которых наиболее вероятно их присутствие.
Апробация работы.
Диссертация апробирована на Ученом Совете ФГУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 28.02.2008 г., протокол № 2.
Результаты работы доложены и обсуждены на II Съезде Биохимического общества РАН, г. Москва 1997 г.; на I Российском форуме «Мать и дитя», г. Москва, 1999 г.; на II Российском форуме «Мать и дитя», г. Москва, 2000 г.; на III Российском форуме «Мать и дитя», г. Москва, 2001 г.; на Научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» в рамках Международной конференции «Геномика , протеомика и биоинформатика для медицины», г. Москва, 2002 г.; на Всероссиской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний», г. Москва, 2002 г.; на Всероссиской научно-практической конференции «Медицинская микробиология - XXI век», г. Саратов 2004 г.; на Всероссиской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней», г. Москва, 2004 г.; на Научной конференции, посвященной 75-летию Нижегородского НИИЭМ «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», г. Н.Новгород, 2004 г.; на VII Российском съезде инфекционистов «Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней», г. Н.Новгород, 2006 г.; на Научной конференции, посвященной 85-летию со дня рождения академика РАМН И.Н.Блохиной «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», г. Н.Новгород, 2006 г.; на VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007», г. Москва, 2007 г.; на Международном симпозиуме «Папилломавирусная инфекция и злокачественные образования. Интегрированная система надзора и профилактики», г. С-Петербург, 2009 г.; на X Международном медицинском форуме «Профилактика заболеваний -основа качества медицинской помощи и благополучия человека», г. Н.Новгород, 2009 г.
Диссертационная работа выполнена на базе лаборатории молекулярно-генетических методов надзора за инфекционными заболеваниями ФГУН «Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н.Блохиной» Роспотребнадзора. Исследования осуществлялись в рамках Федеральной Программы «Здоровье населения России», отраслевой научно-исследовательской программы МЗ РФ № 034 «Эпидемиология и микробиология» по договору «Новые технологии в профилактике, диагностике и лечении инфекционных заболеваний и использование их в эпиднадзоре» и ведомственной (отраслевой) целевой программы «Научные аспекты обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в Российской Федерации на 2006-2010 г.г» по комплексной теме «Разработка комплексных мероприятий по диагностике, профилактике, лечению и эпиднадзору за актуальными инфекциями».
В настоящее время предложенные нами алгоритмы ПЦР диагностики ОКИ, хеликобактериоза, вирусных гепатитов, НУГИ используются практическими лабораториями медицинских учреждений Нижнего Новгорода, применяющими метод ПЦР, что увеличивает точность индикации патогенов и приносит существенный экономический эффект за счет оптимизации расхода диагностикумов.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 69 печатных работ, среди них - 10 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ; 9 - в других журналах; 42 -в материалах конференций, съездов, форумов, 3 - патенты; 5 -методические материалы.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 94 отечественных и 306 зарубежных источников. Работа изложена на 334 страницах, компьютерного текста. Включает 47 таблиц и 36 рисунков.
