Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 6
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
Характеристика возбудителя легионеллеза 13
Лабораторная диагностика легионеллеза 21
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 32
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 32
2.1. Объекты исследования 32
Бактериальные штаммы 32
Реактивы, питательные среды и диагностические препараты 32
2.2. Микробиологические методы 34
2.2.1. Культивирование микроорганизмов,
полученных из ГКПБ «Микроб» 35
2.2.2. Выделение и идентификация гетер о логичных
микроорганизмов из клинического материала 40
Подготовка проб 41
Выявление возбудителя легионеллеза в пробах биологического материала и из объектов окружающей среды с помощью бактериологического анализа 44
Идентификация культур Legionella spp 46
Выявление растворимого антигена
L. pneumophila серогруппы 1 в моче 46
2.2.7. Выявление в сыворотке крови иммуноглобулинов
к L. pneumophila серогруппы 1, Chlamydophila pneumoniae,
Mycoplasma pneumoniae, Coxiella burnetii методом
иммуноферментного анализа 47
2.2.8. Выявление в сыворотке крови иммуноглобулинов
kL. pneumophila серогруппы 1 в реакции аггломсрации (РАО).. 47
2.3. Генетические методы 47
Обеззараживание проб для исследований методом ПЦР 47
Выделение ДНК из бактериальных суспензий, проб
биологического материала и объектов окружающей среды 48
2.3.3. Полимеразная цепная реакция 48
2.4. Клонирование ПЦР-продукта в вектор pGEM-T 50
Очистка ампликонов 50
Клонирование в вектор pGEM-T 51
Культивирование рекомбинантных штаммов Е. coli TG1 52
Выделение плазмидной ДНК рекомбинантного
штамма Е. coli TGI 52
Определение концентрации ДНК 52
Программы и базы данных для анализа нуклеотидньтх последовательностей 52
2.7. Статистическая обработка полученных данных 53
Глава 3. ПОДГОТОВКА ВЫБОРКИ ШТАММОВ
L. PNEUMOHILA И ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ
МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
СПЕЦИФИЧНОСТИ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ГЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ
ЛЕГИОНЕЛЛЕЗА 54
Подбор гетерологичных штаммов микроорганизмов 55
Подбор специфичных штаммов микроорганизмов 57
Подготовка выборки штаммов L. pneumophila и гетерологичных микроорганизмов для определения специфической активности и специфичности тест-систем, направленных на индикацию
и идентификацию возбудителя легионеллеза 59
ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА ПЦР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК
ВОЗБУДИТЕЛЯ ЛЕГИОНЕЛЛЕЗА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ, ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ И ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ШТАММОВ L. PNEUMOPHILA .. 62
Выбор ДНК-мишеней 62
Подбор олигоиуклеотидных праимеров и зондов, оптимизация условий проведения ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов 74
ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ
И ИДЕНТИФИКАЦИИ L. PNEUMOPHILA МЕТОДОМ
ПЦР С ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИМ И ГИБРИДИЗА-
ЦОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ УЧЕТОМ
РЕЗУЛЬТАТОВ 87
Конструирование тест-систем для выявления ДНК возбудителя легионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды методом ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов 87
Конструирование тест-систем для идентификации штаммов L. pneumophila методом ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов 98
Изучение диагностической ценности разработанных тест-систем для выявления возбудителя легионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды и для идентификации штаммов
L. pneumophila методом ПЦР с элекгрофоретическим и
гибридизациионно-флуоресцентным учетом результатов 100
Глава 6. АПРОБАЦИЯ СКОНСТРУИРОВАННЫХ
ТЕСТ-СИСТЕМ НА ПРОБАХ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКОГО
МАТЕРИАЛА И ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ,
РАЗРАБОТКА АЛГОРИТМА ГЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ
ЛЕГИОНЕЛЛЕЗА 103
6.1. Апробация сконструированных тест-систем на пробах из
биологического материала и объектов окружающей среды 103
6.2. Алгоритм генной диагностики легионеллеза 109
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 111
ВЫВОДЫ 121
БЛАГОДАРНОСТИ 123
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 125
ПРИЛОЖЕНИЕ 1 154
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИИ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
ЮхБ - 10-кратный буферный раствор
SDS - sodium dodecyl sulphate (додецилсульфат натрия)
SNR - short nucleotide repeats (короткие нуклеотидные повторы)
w/v - масса к объему
БАЛ - бронхоальвеолярный лаваж
БСА - бычий сывороточный альбумин
ВК - внутренний контроль
ВКО - внутренний контрольный образец
ГЭ - геном-эквивалент
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
дНТФ - дезоксинуклеозидтрифосфаты
ед - единиц
ИФА - иммуноферментный анализ
ИХА - иммунохроматографический анализ
КОЕ - колониеобразующие единицы
ЛПС - липополисахарид
М - моль
м.к. - микробных клеток
МФА - метод флуоресцирующих антител
н/д - нет данных
ОКО - отрицательный контрольный образец
плі. - пар нуклеотидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РАО реакция аггломерации
РЭФ -учет результатов ПЦР методом электрофореза
РГФ - учет результатов ПЦР с помощью гибридизационно-флуоресцентного ме
тода в режиме реального времени
PC - реакционная смесь
ТАЕ - трисацетатный буфер
Твин 20 - сорбитанмонолаурат
ЭДТА - этилендиамин-1Ч,К,1Ч,Н-тетрауксусной кислоты динатриевая соль
Введение к работе
Современная значимость проблемы легионеллеза определяется, прежде всего, постоянными случаями заболевания людей в различных странах мирах. Крупные вспышки имели место в России (1987 г.), в Голландии (1999 г.), Испании (2001 г.), Франции и Норвегии (2004-2005 гг.) [Покровский В.И. с соавт., 1988; Тартаков-ский И.С., 2001, Карбышев Г.Л., 2006, Joseph С, 2004, McNaught В. et al., 2005; Chartier B.J.Y. et al., 2007]. В Российской Федерации в июле-августе 2007 г. в г. Верхняя Пышма (Свердловская область) была зарегистрирована вспышка легио-неллезной инфекции, во время которой количество госпитализированных составило 202 человека, из них у 74 диагноз «легионеллез» был лабораторно подтвержден, в том числе у 4 пациентов посмертно [Беликов Е.С. с соавт., 2008; Онищенко Г.Г. с соавт., 2008].
Подавляющее большинство случаев легионеллеза (70-90 %) связано с видом Legionella pneumophila, включающим 16 серогрупп. Представители всех серогрупп этого вида являются патогенными для человека, однако более 90 % случаев легио-неллезной пневмонии обусловлено L. pneumophila 1 серогруппы [Marston В.J., et al, 1994; Fields B.S. etal, 2002].
Причиной заболевания легионеллезом является контакт человека с искусственными водными системами (системы горячего и холодного водоснабжения, централизованные системы кондиционирования воздуха с водным охлаждением, градирни, вихревые бассейны, увлажнители воздуха, фонтаны и т.д.), коптаминиро-ванными возбудителем инфекции. Это обусловлено тем, что в обозначенных выше объектах создаются благоприятные условия для размножения легионелл, что приводит к образованию биопленок и накоплению в них возбудителя в высокой концентрации [Тартаковский И.С. с соавт., -2005; Карпова Т.И. с соавт., 2008; Atlas R.M., 1999; Zanetti F. et al, 2000]. В естественных местах обитания легионелл (пресноводные водоемы) их количество незначительно и они не представляют опасности для человека.
Основным направлением профилактики легионеллеза является организация регулярного микробиологического мониторинга потенциально опасных для человека водных объектов, а также оборудования и медицинского инструментария
[Онищенко Г.Г. с соавт., 2008]. Не менее важно своевременное выявление возбудителя легионеллеза в биологическом материале от людей [Тартаковский И.С, Сино-пальников А.И., 2001; Темежникова Н.Д., 2008].
Лабораторная диагностика легионеллеза бактериологическим методом длительна (выделение культуры занимает до 10-14 дней), а чувствительность анализа при исследовании клинического материала варьирует в пределах 10-80 % [WHO, 1999; Diederen B.M.W. et al, 2006]. Иммунодиагностические препараты позволяют детектировать/,, pneumophila только 1 серогруппы [Plouffe J.F. et al, 1995; Castilla J. et al., 2007]. Серологические тесты являются ретроспективными и неэффективны при обследовании людей со сниженным иммунитетом [Franzin L., Scramuzza F., 1995; Yzerman E.P. et al., 2006]. В связи с этим очевидна необходимость разработки быстрых и эффективных способов детекции возбудителя легионеллеза всех серог-рупп. Наиболее перспективным решением данной проблемы является использование для индикации и идентификации легионелл молекулярно-генетических подходов, в первую очередь полимеразной цепной реакции (ПЦР).
На сегодняшний день эффективность применения ПЦР для обнаружения ДНК легионелл в биологическом материале и объектах окружающей среды подтверждена в ряде работ отечественных и зарубежных авторов [Федоров Ю.Н. с соавт., 2003; Аляпкина Ю.С. с соавт., 2007; Koide М., et al, 1993; Cloud J. L. et al, 2000; Wellinghausen N. et al, 2001; Wilson D.A., et al, 2003; Yafiez M.A.e/ al, 2005]. В большинстве публикаций исследования были направлены на разработку вариантов ПЦР для выявления ДНК Legionella spp. и/или L. pneumophila. Данные о регистрации ПЦР-тест-систем для детекции возбудителя легионеллеза в Российской Федерации отсутствуют.
При разработке препаратов для генной диагностики легионеллеза необходимо предусмотреть возможность, во-первых, количественной оценки содержания L. pneumophila в пробах из объектов окружающей среды, поскольку уровень контаминации возбудителем легионеллеза искусственных водных систем является эпидемически значимым показателем; во-вторых, исключения ложноотрицательиых результатов, возникающих из-за наличия в пробах веществ, ингибирующих реакцию амплификацию; в-третьих, осуществления детекции возбудителя легионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды и идентификации
штаммов L. pneumophila с использованием отдельных тест-систем; в-четвертых, подтверждения первичного положительного ответа, полученного на этапе индикации патогена.
Вышеизложенное свидетельствует о необходимости разработки тест-систем для качественного и количественного выявления ДНК легионелл в исследуемом материале на основе технологий ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов, а также методологии определения ингибиро-вания реакции за счет введения в исследуемые пробы внутреннего контрольного образца. Использование в качестве ДНК-мишеней для создания генодиагностических препаратов альтернативных видоспецифичных генов L. pneumophila в полной мере обеспечивает получение первичного ответа и его подтверждение. По данным А.А. Чуракова с соавт. [2005] и G. Jaschck et al. [1993] применение такого подхода способствует повышению точности ПЦР-анализа.
Цель работы - конструирование тест-систем для выявления ДНК возбудителя легионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды, и для идентификации штаммов L. pneumophila методом ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов, разработка алгоритма генной диагностики легионеллеза. Основные задачи исследования:
1. Подготовить и охарактеризовать целевую коллекцию штаммов L. pneumophi
la и гетерологичных микроорганизмов для оценки специфической активно
сти (чувствительности) и специфичности препаратов для генной диагности
ки легионеллеза.
Провести анализ нуклеотидных последовательностей генома легионелл на наличие видоспецифичных и консервативных для L. pneumophila локусов.
Подобрать к выбранным фрагментам ДНК олигонуклеотидные праймеры и зонды, оптимизировать условия проведения ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов для качественного и количественного анализа.
4. Сконструировать тест-системы для выявления ДНК возбудителя легионелле
за в биологическом материале, объектах окружающей среды и для иденти
фикации штаммов L. pneumophila методом ПЦР с электрофоретическим и
гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов, охарактеризовать их диагностическую ценность. 5. Апробировать созданные генодиагностические препараты при исследовании клинического материала от людей, больных пневмониями неясной этиологии, и проб из объектов окружающей среды. 6. Разработать алгоритм генной диагностики легионеллеза с использованием ПЦР-анализа, включающего два этапа: 1. выявление ДНК возбудителя в биологическом материале и объектах окружающей среды; 2. идентификация штаммов L. pneumophila н подтверждение первичного положительного ответа о наличии в пробе патогена. Научная новизна работы
Проведен анализ нуклеотидньтх последовательностей генома L.pneumophila, позволивший определить мономорфные видоспецифичные участки, перспективные для создания генодиагностических препаратов.
Получены новые данные о нуклеотидной последовательности генов «системы жизнеобеспечения»: dnaX,ftsZ, mompS, trpS у штаммов возбудителя легионеллеза, выделенных на территории Российской Федерации.
Впервые для выявления и характеристики штаммов L. pneumophila методом ПЦР с электрофоретическим учетом результатов в качестве ДНК-мишеней использованы мономорфные участки генов ftsZ и mompS.
Впервые на основе генов mip, ftsZ, trpS сконструированы тест-системы для детекции возбудителя легионеллеза и идентификации штаммов L. pneumophila методом ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов.
Впервые разработан алгоритм двухэтаппой генной диагностики легионеллеза, предусматривающий поэтапное выполнение анализа с подтверждением первичного положительного ответа о наличии в пробе ДНК L. pneumophila. Практическая значимость работы
В результате проведенных исследований созданы экспериментальные серии тест-систем для выявления ДНК возбудителя легионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды методом ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов («Ген Legionella pneumophila -
РЭФ» и «АмплиСенс Legionella pneumophila -FL», соответственно) и тест-систем для идентификации L. pneumophila методом ПЦР с электрофоретическим и гибри-дизационно-флуоресцентным учетом результатов («Ген Legionella pneumophila— РЭФ-идентификация» и («Ген Legionella рпеиторІгіІа-РГФ-илснтнфшащия», соответственно). На тест-системы разработаны проекты нормативно-технической документации (ТУ, инструкция по применению).
В ходе межлабораторных испытаний «Ген Legionella pneumophila - РЭФ -тест-системы для выявления ДНК возбудителя легионсллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды методом ПЦР с электрофоретическим учетом результатов» подтверждена диагностическая ценность препарата: чувстви-тельность - 1x10 м.к./мл, специфичность при исследовании чистых культур и секционного материала - 100 % (акты внедрения, утвержденные директором ФГУЗ Ставропольский ЫИПЧИ (от 24.10.08 г.) и генеральным директором ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (от 13.11.08 г.)).
Разработаны методические указания МУК 4.2.22.17-07 «Методические указания по выявлению бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды» (утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 30 мая 2007 г.).
Материалы диссертационной работы представлены в практическом руководстве «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней» (глава «Ле-гионеллез») (утверждено Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 12 декабря 2007 г.).
Материалы диссертации используются при чтении лекций и проведении практических занятий на курсах повышения квалификации «ПЦР в диагностике инфекционных болезней и индикации патогенных микроорганизмов» в соответствии с программой (утверждена Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 08. 10. 2003 г.).
Основные положения, выносимые на защиту
1. На основе нуклеотидных последовательностей мономорфных участков гена mip (отвечающего за синтез полипептида 25 кДа, необходимого для перси-стенции возбудителя в макрофагах), генов «системы жизнеобеспечения» ftsZ и mompS (кодирующих синтез тубулиноподобного белка и белка внешней мембра-
ны, соответственно), определенных в результате анализа генома возбудителя ле-гионеллеза, возможно создание специфичных олигонуклеотидных праймеров и зондов для разработки тест-систем, направленных на индикацию и идентификацию L. pneumophila методом ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов.
Разработанные тест-системы для выявления ДНК возбудителя легионел-леза методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов (ДНК-мишень - ген тір) и электрофоретической детекцией (ДНК-мишень - ген ftsZ) обеспечивают индикацию L. pneumophila в материале от людей, больных пневмониями неясной этиологии, а также в пробах из объектов окружающей ере-ды в концентрации не ниже 1><10 м.к./мл, со 100 % специфичностью.
Созданные гест-системы для идентификации штаммов L. pneumophila методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов (ДНК-мишень - venftsZ) и электрофоретической детекцией (ДНК-мишень - ген mompS), позволяют идентифицировать штаммы L. pneumophila и подтвердить первичный положительный ответ (наличие в исследуемой пробе ДНК возбудителя легио-нелллеза), полученный на этапе индикации. Специфическая активность - 1 х 10J м.к./мл, специфичность — 100 %.
Сконструированные тест-системы обеспечивают возможность проведения генной диагностики легионеллеза в учреждениях Роспотребнадзора в два этапа: 1. выявление ДНК возбудителя в биологическом материале и объектах окружающей среды («Ген Legionella pneumophila — РЭФ» и «AunnwConc^ Legionella pneumophila-FL»); 2. идентификация штаммов L. pneumophila и подтверждение первичного положительного ответа о наличии в пробе патогена («Ген Legionella pneumophila - РЭФ-идентификация» и «Ген Legionella pneumophila-РГФ-и дентифи кация »).
Апробация работы
Материалы диссертации представлены на Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Новосибирск, 2005); VII Межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий
государств-участников Содружества Независимых Государств» (Оболенск, 2006); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации» (Москва, 2007); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участігаков СНГ» (Саратов, 2007); Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика инфекционных болезней» (Минск, 2007); 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика» (Москва, 2007).
Публикации
Основное содержание работы отражено в 10 научных публикациях, из них 1 - в рекомендованном ВАК издании.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 62 отечественных и 201 зарубежных источников. Общий объем работы составляет 161 страницы компьютерного текста, иллюстрированного 15 таблицами и 10 рисунками.
