Введение к работе
Актуальность проблемы. Вопросы обеспечения биологической безопасности Российской Федерации непосредственно связаны с проблемой санитарной охраны территории страны. Они включают в себя разработку новых средств защиты, в том числе методов лабораторной диагностики инфекционных болезней, в первую очередь, неконтролируемых средствами иммунной профилактики. К таким заболеваниям относят сап и мелиоидоз [В.Д.Беляков, Л. А.Ряпис, 1990].
Необходимость создания эффективных средств диагностики этих инфекций определяется реальной угрозой их заноса на территорию России из эндемичных стран, вследствие возможного возникновения чрезвычайных биологических ситуаций в результате техногенных и природных катастроф, а также террористических актов с использованием Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei [M.Wheelis, 1998; В.В.Алексеев и др., 2003; J.M. Rusnak et al., 2004].
Многообразие клинических проявлений сапа и мелиоидоза, тяжёлое течение, высокая летальность существенно затрудняют адекватную диагностику и своевременное лечение этих опасных заболеваний. Особую проблему представляют клинические формы инфекции с длительным течением, при которых даже с использованием бактериологического метода, как «золотого стандарта» идентификации, возможна регистрация отрицательных результатов.
Среди новых средств диагностики сапа и мелиоидоза выделяют методы, основанные на обнаружении ДНК микробов. В первую очередь, это по-лимеразная цепная реакция (ПЦР)^ как высокочувствительный, специфичный, но, в то же время, доступный и простой в исполнении метод.
В последние годы зарубежными и отечественными исследователями предпринимались попытки конструирования fily^leljjJBiUL» шлишіціия уча-
I «ивлиотекІ1***!
стков генов 16S, 23SpPHK, спейсерной области 16-23SрРНК, а также видос-пецифических последовательностей генома возбудителя мелиоидоза [S.D.Tyler et al., 1995; M.Kunakom, R.B.Markham, 1995, A.Bauernfeind et al., 1998; Г.А.Ткаченко, 2003]. Большая часть исследований была направлена на идентификацию B.pseudomallei. В отношении использования метода ПЦР для идентификации B.mallei имеются лишь единичные публикации, в которых приводятся результаты не только выявления, но и дифференциации патогенных буркхольдерий между собой [A.Bauernfeind et al., 1998]. Отдельными исследователями показана сравнительная эффективность использования нескольких пар праймеров для выявления возбудителя мелиоидоза [M.Kunakom, 2000]. Однако до настоящего времени нет единого мнения и регламентирующих документов, определяющих обязательные ДНК-мишени и необходимые праймеры для идентификации патогенных буркхольдерий.
Остаются открытыми также и вопросы, касающиеся диагностики различных клинических форм сана и мелиоидоза с использованием ПЦР. Не определены оптимальные сочетания праймеров для выявления возбудителей при инфекционном процессе. Таким образом, проведение исследований, направленных на поиск оптимальных праймеров для проведения ПЦР-анализа и определения места полимеразной цепной реакции в схеме лабораторной диагностики сапа и мелиоидоза, остается актуальным.
Цель работы: совершенствование генодиагностической тест-системы для выявления патогенных буркхольдерий, оценка её эффективности при ди-аіностике экспериментального сапа и мелиоидоза.
Задачи исследования:
1. Подобрать праймеры на основе нуклеотидных последовательностей флагеллярного и 23S рРНК генов для идентификации типичных и атипичных штаммов патогетшых .буркхольдерий.
-
Разработать с использованием выбранных праймеров амплификаци-онную тест-систему для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза.
-
Оценить чувствительность и специфичность выбранных пар олиго-нуклеотидных затравок при исследовании чистых культур патогенных бурк-хольдерий и гетерологичных микроорганизмов.
-
Изучить эффективность сконструированной ПЦР-тест-системы при диагностике различных клинических форм сапа и мелиоидоза у экспериментально заражённых животных.
-
Определить диагностическую ценность ПЦР с выбранными прай-мерами при исследовании воды и продуктов питания, контаминированных возбудителем мелиоидоза.
Научная новизна. Для идентификации патогенных буркхольдерий на основе нуклеотидной последовательности флагеллярного гена сконструированы оригинальные праймеры bfl-ls/bfl-as2. Подобраны оптимальные условия проведения ПЦР, обеспечивающие амплификацию фрагментов ДНК B.pseudomallei и В mallei с высокой чувствительностью и специфичностью.
Впервые для молекулярной диагностики сапа и мелиоидоза разработана амплификационная іест-систсма с использованием двух пар праймеров -bfl-ls/bfl-2a и b23-s7/b23-a8, полученных на основе флагеллярного и 23S рРНК генов. Продемонстрирована высокая эффективность использования ПЦР с двумя парами праймеров для диагностики различных клинических вариантов сапной и мелиоидозной инфекций, вызванных типичными и атипичными штаммами B.mallei и B.pseudomallei.
Показана возможность использования разработанной ПЦР-тест-системы для анализа воды и продуктов питания, контаминированных B.pseudomallei.
Для выявления триады буркхольдерий - B.pseudomallei, B.mallei и Burkholderia thailandensis впервые предложены группоспецифические олиго-
нуклеотидныс затравки burt-sl/burt-a2, являющиеся фрагментами флагелляр-ного гена.
Впервые показана диагностическая ценность праймеров burt-sl/burt-a2 для идентификации B.thailandensis методом ПЦР при анализе чистых культур микроорганизмов и исследовании биологического материала, полученної о от животных, экспериментально зараженных этим микроорі анизмом.
Дополнена схема лабораторной диагностики сапа и мелиоидоза и идентификации патогенных буркхольдерии.
Практическая ценность. Выбранные праймеры используются в лабораториях Волгоградского НИГТЧИ для анализа музейных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза, изучения генетически измененных штаммов патогенных буркхольдерии, а также в экспериментах для диагностики различных клинических форм инфекций, вызванных типичными и атипичными штаммами B.mallei и B.pseudomallei.
Разработанная ПЦР-тест-система с применением праймеров Ь23-s7/b23-a8 и bfl-ls/bfl-as2 может быть использована для исследования клинического материала, взятого у лиц с подозрением на заболевание сапом и ме-лиоидозом, анализа пищевых продуктов и объектов, подозрительных на контаминацию B.pseudomallei. Указанная система праймеров вместе с предложенными олигонуклеотидными затравками burt-sl/burt-a2, может быть применена для установления инфицированности людей B.thailandensis.
Результаты, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, включены в лекционный материал, предназначенный для врачей, биологов и лаборантов учреждений санитарно-эпидемиологического профиля и клинических диагностических лабораторий при проведении первичной специализации и курсов усовершенствования по вопросам специфической индикации и лабораторной диагностики особо опасных заболеваний.
Материалы диссертации включены в «Программу курсов повышения квалификации бактериологов и эпидемиологов по противодействию биотерроризму», утвержденную Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 01.02.2001 г.
Материалы диссертационного исследования вошли в «Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму» (Волгоград, 2004 г.), утверждённое руководителем Департамента Госсанэпиднадзора Минздрава России С.И.Ивановым 06.11.2003 г.
По результатам работы проведены внутриинститутские приёмочные испытания (акт уївержден директором Волгоградского НИПЧИ 12.01.2004г).
Разработан пакет первичной документации: «Инструкция по изготовлению и контролю амплификационной тест-системы для выявления Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei» и «Инструкция по применению амплификационной тест-системы для выявления Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei», утверждённые директором Волгоградского НИПЧИ 15.03.2005 г.
По материалам диссертационной работы составлены методические рекомендации: «Идентификация возбудителей сапа и мелиоидоза методом по-лимеразной цепной реакции», утверждены директором Волгоградского НИПЧИ 29.05.2002 г.; «Использование двух пар праймеров для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР», утверждены директором Волгоградского НИПЧИ 10.02.2005 г.
Положения, выносимые на защиту:
1. Оригинальные праймеры bfl-1 s/bfl-as2, сконструированные на основе нуклеотидкой последовательное!и флагеллярного ієна патогенных бурк-
8 хольдерий обеспечивают специфическую амплификацию фрагментов ДНК B.pseudomallei и B.mallei с чувствительностью ІхІО2- 1х103м.к./мл.
-
Разработанная амплификационная тест-система с использованием олигонуклеотидных затравок b23-s7/b23-a8, являющихся участком гена 23S рРНКк праймеров bfl-ls/bfl-2a, фланкирующих фрагмент флагеллярного гена (fliC) возбудителей сапа и мелиоидоза, пригодна для идентификации патогенных буркхольдерий, диагностики экспериментальных инфекций и анализа объектов, контаминированных B.pseudomallei.
-
ПЦР-тест-система с двумя парами праймеров bfl-ls/bfl-as2 и Ь23-s7/b23-a8 обладает преимуществом по сравнению с бактериологическим методом при диагностике острых и подострых форм сапа и мелиоидоза и позволяет обнаруживать патогенных буркхольдерий в крови экспериментально заражённых животных на начальных этапах развития инфекции.
-
Группоспецифические нраймеры burt-sl/burt-a2, сконструированные на основе последовательности ДНК флагеллярного гена, обеспечивают идентификацию триады буркхольдерий - B.pseudomallei, B.mallei и B.thailandensis методом ГЩР с чувствительностью 1x102- 1х103 м.к./мл.
-
Праймеры burt-sl/burt-a2, обеспечивают специфическую амплификацию фрагмента ДНК B.thailandensis при анализе чистых культур и биологического материала от экспериментально заражённых животных.
Апробация работы
Основные материалы диссертации доложены: на конференции к 100-летию Астраханской противочумной станции «Природно-очаговые особо опасные инфекции на Юге России, их профилактика и лабораторная диагностика» (Астрахань, 2001); VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002); III Общероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Сочи, 2002); IV Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекцион-
9 ных заболеваний» (Москва, 2002); международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (Москва, 2002); научно- практической конференции, посвященной 75 - летию НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 2003); IV Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в диагносіике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003); XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004); Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология - XXI век» (Саратов, 2004), научных конференциях Волгоградского НИПЧИ.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 19 научных работ.
Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 133 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 193 работы, в том числе 62 отечественных и 131 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 14 рисунками.
![Использование липосомальных форм антимикробных препаратов для лечения раневой инфекции в эксперименте [Электронный ресурс]](/i/i/4326/211478.png "Использование липосомальных форм антимикробных препаратов для лечения раневой инфекции в эксперименте [Электронный ресурс] Снатенков Евгений Александрович")
